超高效液相色谱三重四极杆质谱联用检测红色糖多孢菌胞内中间代谢物同位素丰度

牟翰+洪铭+刘晓云+李敏超+黄明志+储炬+庄英萍+张嗣良

摘要采用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱联用仪（LCMS/MS），建立了能精确检测红色糖多孢菌胞内代谢物13C同位素丰度的方法。在优化的超高效液相色谱的条件及三重四极杆串联质谱的离子传输电压和碰撞池电压下，筛选出各胞内代谢物的最佳离子对。根据物质在LCMS/MS中生成的母离子和子离子碳链长短及子离子是否含有13C等特性，建立了“一对一”法、“一对多”法和单级质谱SIM法等同位素丰度检测方法。利用这些方法，检测了自然标记标准品和13C标记实验样品，根据实验值与理论值的接近程度筛选出最优方法。结果表明，对于以磷酸糖类为代表的子离子不含有13C的代谢物，“一对一”法最有效； 对于以有机酸类为代表的母离子和子离子都含有13C的短碳链代谢物，“一对多”法更有优势； 对于以辅酶A类为代表的母离子和子离子都含有13C且碳链较长的代谢物，单级质谱SIM法才能发挥作用。建立的同位素丰度检测方法具有较好的准确度，可应用于红色糖多孢菌胞内代谢物同位素丰度的检测，为后续研究菌体的代谢机理，实现红霉素的高效表达奠定了基础。

关键词红色糖多孢菌； 胞内代谢物； 13C同位素丰度； 超高效液相色谱三重四极杆串联质谱

1引 言

红色糖多孢菌是工业化生产红霉素的主要菌种，生产工艺优化是提高红霉素生产水平的重要方法。13C代谢分析是一种检测细胞生理代谢状态的有效方法，在工艺优化研究中有着广泛应用[1～4]。红霉素属于次级代谢产物，红色糖多孢菌合成红霉素时细胞已经处于不生长的稳定期，这期间细胞新合成蛋白的量不大，使目前广泛使用的基于菌体蛋白氨基酸同位素丰度信息的13C代谢分析方法不适用于红霉素生产过程的研究。与菌体蛋白不同，红霉素合成需要胞内中间代谢物持续不断的供应，胞内中间代谢物同位素丰度的变化能及时反映细胞的代谢状态。因此，精确检测胞内中间代谢物的同位素丰度，是进行红霉素生产过程代谢流分析的前提条件，对理解红色糖多孢菌胞内代谢调控机理，指导发酵工艺优化具有重要意义[5～9]。

胞内中间代谢物的种类有多种，大致可分为氨基酸、有机酸、磷酸糖和辅酶A类物质等。胞内代谢物具有周转快、浓度低的特点，色谱质谱联用技术得以广泛应用[10]。色谱质谱联用技术将定性与定量分析有机地结合在一起[11，12]，具有高灵敏度、准确度。目前氨基酸的同位素丰度在GCMS上已有较好的检测方法[13]，其它的几类物质由于难挥发或热不稳定性等特点，需采用LCMS/MS进行检测。

采用LCMS/MS检测中间代谢物的同位素丰度时，最直接的方法是“一对一”法，即将一个母离子和一个子离子形成离子对，检测所有可能形成的离子对。引入13C同位素后，在母离子和子离子中都可能含有13C，一种中间代谢物可能形成的离子对数量较多，加上中间代谢物的浓度很低，造成检测信号弱、检测结果准确度不高等问题[14]。为解决这个问题，Ruhl等[15]提出了一种方法，即“一对多”法，在Q3上一次扫描多个子离子，这样需要检测的离子对数量降低，准确度有可能得到提高。

为实现红霉素发酵过程中胞内中间代谢物同位素丰度的精确检测，本研究分别考察了磷酸糖、有机酸和辅酶A类物质的适用检测方法。这3类物质分别代表了用LCMS/MS检测中间代谢物同位素丰度时常见的典型情况。其中，磷酸糖类物质生成的子离子固定为H2PO

Symbolm@@ 4（m/z 97）或PO3

Symbolm@@ 3（m/z 79），母离子含有13C，子离子不含13C，子离子的质荷比不会随13C的引入发生变化，理论上只存在“一对一”法。对于有机酸类物质，母离子和子离子都含有13C，理论上“一对一”法和“一对多”法将有性能差异，本研究比较了两种方法的性能差异。对于辅酶A类物质，母离子和子离子都含有13C，且碳链很长，“一对一”法和“一对多”法都不适用，因此选用了单级质谱选择离子模式（SIM）方法。本研究利用各个方法分别检测各类胞内代谢物的自然标记同位素丰度并与理论值作对比，再用所建立的方法测定专门设计的13C标记实验的实际样品，对检测结果与理论值进行比较，以说明方法的实际应用性能[13]。本研究根据代谢物在LCMS/MS中母离子和子离子碳链的长短及子离子是否含有13C等特性，针对不同种类代谢物，开发了特异性强、准确度高的同位素分析方法，对其它类似代谢物的同位素丰度检测具有借鉴推广意义。

2实验部分

2.1仪器与试剂

超高效液相色谱三重四极杆串联质谱（Thermo Fisher公司）； ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱（150 mm×2.1 mm， 1.7 μm，Waters公司）； 振荡器（Thermo Fisher公司）；移液器（GILSON公司）； 纤维滤膜（Millipore公司）； 注射器滤膜（RephiLe公司）； 快速旋转蒸发仪（LABCONCO公司）； 标准品（Sigma公司）； 流动相乙腈、超纯水（Fisher Chemical公司）； 离子对试剂二丁胺乙酸盐浓缩液（Sigma公司）； [U13C]葡萄糖（Cambridge Isotope Laboratories公司）。

2.2菌株、培养基和培养过程

取适量红色糖多孢菌E3菌株。培养基组成为葡萄糖（20% [U13C]和80%自然标记葡萄糖）10 g/L，（NH4）2SO4 5 g/L，KH2PO4 5 g/L，MgSO4·7H2O 0.9 g/L，NaCl 2 g/L。微量元素溶液（30：1000，V/V），其中微量元素： MnSO4·H2O 0.2 g/L，CoCl2·6H2O 0.25 g/L，ZnSO4·7H2O 0.2 g/L， FeSO4·7H2O 0.03 g/L，Na2MoO4·2H2O 0.02 g/L，CaCl2 0.1g/L，CuSO4·5H2O 0.01 g/L。培養条件： 接种量3%； 采用250 mL微型反应器，装液量150 mL； 过程控制的温度为34℃，pH 7.0，溶氧保持在30%以上。endprint

2.3样品处理

标准品配制成50 μmol/L水溶液500 μL，准备进样。标记实验取样量5 mL，取样后立即抽滤，并用5ml去离子水冲洗3遍，将带有菌体的滤膜泡入液氮中灭活，然后将样品在冷冻抽干机中冻干，向样品中加入20 mL

Symbolm@@ 27℃预冷好的60%甲醇溶液，浸泡在液氮中使其凝固，然后将样品转入

Symbolm@@ 27℃冷冻槽内使其完全融化，每次融化后需要在振荡器上振荡30 s，重复冻融3次，

Symbolm@@ 10℃ 8000 r/min离心5 min，取上清液，注射器滤膜过滤，过滤后的液体用快速旋转蒸发仪浓缩至0.5 mL，于

Symbolm@@ 80℃保存待测。

2.4色谱条件和质谱条件

2.4.1色谱条件采用ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱（150 mm×2.1 mm， 1.7 μm），柱温： 25℃。流动相A： 5% 乙腈，5 mmol/L二丁胺乙酸盐溶液； 流动相B： 84%乙腈，5 mmol/L二丁胺乙酸盐溶液； 流速： 0.2 mL/min。

各物质的洗脱梯度为有机酸类： 0～20 min，0%～20% A； 20～22 min，20%～0% A； 22～27 min，0% A。磷酸糖类： 0～10 min，5%～15% A； 10～15 min，15% A； 15～20 min，15%～5% A； 20～25 min，5% A。辅酶A类0～15 min，10%～22% A； 15～20 min，22%～40% A； 20～23 min，40% A； 23～25 min，40%～10%； 25～30 min，10% A。

2.4.2质谱条件有机酸、磷酸糖、辅酶A类物质都采用负离子模式： 喷雾电压

Symbolm@@ 3.0 kV，气化温度200℃，鞘气压15 psi，离子扫描气压0 psi，辅助气压10 psi，毛细管温度270℃。

2.5同位素丰度检测方法的设置

2.5.1“一对一”法“一对一”法的原理如图1，以带4个碳原子的母离子经碰撞形成带2个碳原子的子离子为例[15]，当母离子带2个13C为M+2时，形成的子离子可能是m+0、m+1、m+2，分别对M+2/m+0、M+2/m+1、M+2/m+2进行检测，得到3个信号的和为M+2的信号。用“一对一”法检测带4个碳原子的母离子，所需检测的离子对有9个，等于所有可能子离子的数量。“一对一”法的设置如附录1，扫描模式是选择反应模式（SRM），负离子模式。

2.5.2“一对多”法“一对多”法的原理如图2，同样以带4个碳原子的母离子碰撞形成带2个碳原子的子离子为例，当母离子为M+2时，子离子可能是m+0、m+1、m+2，子离子的设定值为三者的中间值，降低Q3的分辨率，也就是增大Q3检测的半高峰宽（FWHM），扩大了Q3的检测范围，将3种情况一次性检测出来。检测带4个碳原子的母离子需要的离子对有5个，等于母离子碳原子数加1，较“一对一”法有大幅度的减少。“一对多”法的设置如附录2，扫描模式为SRM，负离子模式。由于MAL的母离子与子离子所含的碳原子数一样，故母离子与子离子所带的标记信息一致，MAL不存在“一对多”法。

2.5.3单级质谱SIM方法单级质谱SIM方法的设置如附录3，FWHM设为0.3 amu。

2.6同位素丰度检测方法的验证

用Isopro软件来计算胞内代谢物自然标记同位素丰度理论值，然后用建好的方法，进样标准品，得到实测值，将理论值与实测值对比，差距用残差平方和（SSR）表示。

在进行标记实验时，底物中标记的葡萄糖经过菌体代谢，会将13C转移到胞内代谢物的碳骨架上，当同位素稳态时，胞内代谢物的FL值固定，将理论的FL值与实测的FL值对比，对方法进行评估。

FL=∑ni=0i·Min·∑ni=0Mi

其中： n是母离子碳原子的数量，Mi是含有i个13C的离子占总体的比例。检测标记实验样品得到的数据通过Matlab MS Correction Tool来校正自然标记同位素丰度[16]。

3结果与讨论

3.1色谱操作条件的优化

胞内磷酸糖、有机酸和辅酶A类物质由于极性较大，给色谱分离带来一定困难。本研究根据3类物质的性质，利用SRM模式对色谱方法进行了优化。在流动相中添加离子对试剂，增加了物质在色谱柱上的保留能力。优化不同的流动相洗脱梯度后，可较好地分离出磷酸糖、有机酸和辅酶A类等20种物质[17]，如图3、图4和图5。对各物质的有效分离为后续准确检测代谢物的同位素丰度奠定了基础。

3.2质谱操作条件优化

用标准品对质谱条件进行优化，检测模式为SRM，负离子模式，获得了各物质最佳的离子对以及最优的操作条件，结果如表1所示。

3.3自然同位素丰度检测性能考察

分别检测磷酸糖、有机酸和辅酶A类物质标准品的自然标记同位素丰度，并比较连续3次检测的

结果。准确度： 实测值与理论值对比，差距用残差平方和（SSR）表示。如图6A所示，测量磷酸糖类物质，“一对一”法比单级质谱SIM方法，平均準确度高了2.2倍； 如图7A所示，测量有机酸类物质时，

“一对多”法比“一对一”法平均准确度高了4.6倍； 如图8A所示，测量辅酶A类物质，“一对多”法比单级质谱SIM方法，平均准确度高了3.6倍。

信号强度： 检测相同浓度的标准品，测量磷酸糖类物质时，如图6B所示，单级质谱SIM方法比“一对一”法信号强度高了4.6倍； 测量有机酸类物质时，如图7B所示，“一对多”法比“一对一”法平均信号强度高了2.4倍； 测量辅酶A类物质时，如图8B所示，单级质谱SIM方法比“一对多”法信号强度高了17.8倍。endprint

3.413C标记实验样品分析

13C标记实验样品的理论FL值为99.7%×20%+1.07%×80%=20.05%。磷酸糖类的检测结果如图9A所示，“一对一”法比单级质谱SIM法的实测FL值更加接近理论值，说明对于以磷酸糖类为代表的子离子不含13C的代谢物，“一对一”法的检测更加准确； 有机酸类的检测结果如图9B所示，对于以有机酸类为代表的母离子和子离子都含有13C的短碳链代谢物，“一对多”法的检测更加准确； 如图9C所示，单级质谱SIM方法比“一对多”法的实测FL值更加接近理论值。虽然在检测自然标记同位素丰度时，“一对多”法具有准确度高的优势，但引入了较多13C后，“一对多”法在Q3部分的设置不足以一次性检测所有子离子，所以对于以辅酶A类为代表的母离子和子离子都含有13C且碳链较长的代谢物，单级质谱SIM方法效果更好。同时也要注意到，SIM模式也存在不足之处： 其只用一级质谱对物质进行扫描，容易受到质荷比相同的物质干扰，因此需要注意优化液相方法，提高对不同代谢物的分离效果。

4结 论

本研究根据各胞内中间代谢物在LCMS/MS中母离子和子离子碳链长短及子离子是否含有13C原子等特性的不同，建立了相应的同位素丰度检测方法。结果表明，对于以磷酸糖类为代表的子离子不含有13C的代谢物，常规的“一对一”法就能满足要求； 对于以有机酸类为代表的母离子和子离子都含有13C的短碳链代谢物，“一对多”法比“一对一”法更有优势； 对于以辅酶A类为代表的母离子和子离子都含有13C且碳链较长的代谢物，单级质谱SIM方法才能发挥作用。本方法不仅适合于磷酸糖、有机酸和辅酶A类物质同位素丰度的检测，对具有与以上三类物质相似性质的代谢物，具有借鉴推广意义。

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Accurate Detemination of Isotopic Abundance of

Intracellular Metabolites of Saccharopolysporaerythraea Based on

Ultra Performance Liquid ChromatographyTriple

Quadrupole Mass Spectrometry

MOU Han， HONG Ming， LIU XiaoYun， LI MinChao， HUANG MingZhi*，

CHU Ju， ZHUANG YingPing， ZHANG SiLiang

（State Key Laboratory of Bioreactor Engnieering， East China University of Science and Technology， Shanghai 200237， China）

AbstractA method for measuring 13C isotopic abundance of intracellular metabolites of Saccharopolysporaerythraea by ultrahigh performance liquid chromatography （UPLC）triple quadrupole mass spectrometry was established. First， the chromatographic conditions of UPLC were optimized， and then the MS conditions such as unique tube lens voltage， collision energy， and ion pair were optimized. On the bases of length of the parent and daughter ions carbon chains and whether the daughter ions contain 13C atoms， the onetoone method， onetomany method and SIM method were established for measuring 13C isotopic abundance. Then these methods were used to measure naturally labeled intracellular metabolite standards and 13C labeled samples， and according to the gap between the experimental value and the theoretical value， the best method was established for each metabolite of different characteristics. The results showed that onetoone method was most effective for measuring the metabolites of daughter ions not containing 13C atoms represented by sugar phosphates， onetomany method was the best for measuring the metabolites of both parent and daughter ions containing 13C short carbon chains represented by carboxylic acids， SIM method could play a role in measuring the metabolites of both parent and daughter ions containing 13C long carbon chains represented by coenzyme A. This method had a good measurement precision and could be applied to the measurement of Saccharopolysporaerythraea intracellular metabolites， which contributed to the consequent study of metabolic mechanism and the efficient expression of erythromycin.

KeywordsSaccharopolysporaerythraea； Intracellular metabolites； 13C isotopic abundance； Ultrahigh performance liquid chromatographytriple quadrupole mass spectrometry

（Received 30 March 2017； accepted 12 June 2017）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No. 21276081）.endprint