N乙酰半胱氨酸保护下给药钆二乙三胺五乙酸后慢性肾衰大鼠的尿液代谢组学研究

万传玲 薛蓉++湛游洋 李晓晶 裴奉奎

摘要N乙酰半胱氨酸（NAC）有减轻造影剂引发肾损伤的作用，但其作用机制尚未明确。本研究采用基于1H NMR的代谢组学方法，结合正交偏最小二乘法判别分析（OPLSDA），在NAC保护下对慢性肾衰大鼠给药造影剂钆二乙三胺五乙酸（GdDTPA）， 通过分析大鼠尿液中内源性代谢物的变化，研究了NAC对慢性肾衰大鼠的保护机制。结果表明，慢性肾衰大鼠能量代谢、尿素循环等代谢通路发生紊乱。给药GdDTPA后，大鼠尿液中胆碱、N氧三甲胺、邻羟基苯乙酸苯酯、对羟基苯乙酸苯酯、马尿酸、甘氨酸、烟酸、牛磺酸减少，尿囊素增加； 而在NAC保护下相关代谢产物向模型组的恢复，说明NAC对GdDTPA引发的大鼠肠道细菌代谢、肝线粒体代谢、犬尿氨酸代谢紊乱及氧化损伤具有一定修复作用。NAC对尿素循环代谢的改善可能减轻大鼠体内的肾损伤，而其对细胞中谷胱甘肽的补充可能减轻GdDTPA造成的氧化损伤。

[KH*3/4D][HTH]关键词代谢组学；核磁共振；慢性肾衰；钆二乙三胺五乙酸；N乙酰半胱氨酸

1引 言

磁共振成像（Magnetic resonance imaging， MRI）是当前临床诊断中最有力的检测手段之一[1，2]，为提高成像对比度，超过30%的MRI诊断需要使用造影剂。钆造影剂（Gadoliniumbased contrast agents， GBCAs）在人体内具有较高的热力学和动力学稳定性，且易于排出体外，是目前临床应用最广泛的造影剂[3]。2006年， Grobner提出腎源性系统性纤维化（Nephrogenic systemic fibrosis， NSF）的发生可能与肾衰患者在MRI诊断时使用钆造影剂有关[4]，钆造影剂的安全性问题再次得到关注。NSF与钆造影剂的相关性研究有很多，但其发病机理尚未明确，且诊断后尚无有效的治疗方法[5]，因此NSF的早期发现与预防至关重要。

N乙酰半胱氨酸（Nacetylcysteine， NAC）是合成谷胱甘肽的前体，最早应用于囊胞性纤维症的治疗，但近年来对其抗氧化性的研究越来越广泛，更值得注意的是NAC有减轻造影剂引发肾损伤的作用[6]，但其作用机制尚未明确。代谢组学[7]是通过考察生物体系受刺激或扰动后代谢产物的变化，系统研究生物体系代谢途径的一种技术，目前广泛应用于药物研发、疾病诊断、食品化学、微生物学、植物生物学及环境监测等领域[8～9]。因此机体在NAC保护下注射钆造影剂后，对其进行代谢组学研究，将对NSF的早期发现与预防起到重要作用。

为了研究NAC对钆造影剂引发损伤的保护机制，本研究选择临床应用最广泛的GdDTPA作为研究对象，采用基于1H NMR的代谢组学方法，对NAC保护下给药GdDTPA前后慢性肾衰（Chronic renal failure， CRF） 大鼠尿液中的内源性代谢物进行分析，同时结合单变量分析，找出GdDTPA及NAC影响的潜在特征代谢物，从代谢角度初步阐述了NAC对造影剂引发损伤的保护机制。

2实验部分

2.1仪器与试剂

尿液的1H NMR实验均在AV 600 型核磁共振谱仪（德国布鲁克公司）上进行，质子共振频率为600.13 MHz，采用预饱和方法压制水峰采集信号，采样温度298 K，FID采集次数64，数据点32 K，延迟时间2 s，采样时间2.4773 s，谱宽6613.8 Hz。生化指标在A6 半自动生化分析仪（北京松上技术有限公司）上进行。组织病理学检查在OlympusBX51光学显微镜（日本Olympus公司）上进行。

重水（D2O，99.9%氘代，美国剑桥同位素实验室）； 3（三甲基硅基）氘代丙酸钠（TSP，98%氘代）、N乙酰半胱氨酸、腺嘌呤均购于美国SigmaAldrich公司； 马根维显（GdDTPA，0.5 mol/L，德国拜耳先灵医药股份有限公司）； 血清尿素氮、肌酐试剂盒（长春汇力生物技术有限公司）。

2.2动物实验

取40只成年雄性SD大鼠（吉林大学白求恩医学院动物实验中心），自由摄食饮水，随机分为4组：对照组（Control group， n=8）、慢性肾衰组（CRF group， n=16）、GdDTPA组（CRFGd group， n=8）、NAC组（CRFGdNAC group， n=8）。

实验第1～21天，慢性肾衰组、GdDTPA组、NAC组按照剂量200 mg/kg体重灌胃给药腺嘌呤造慢性肾衰（CRF）模型[10]，对照组灌胃蒸馏水；第22～31天，NAC组将饮用水替换为600 mg/L NAC溶液（剂量参考文献[13～14]、大鼠进水量及体重）；第24天，GdDTPA组、NAC组按照剂量2 mmol/kg体重尾静脉注射给药GdDTPA（剂量参考大鼠GdDTPA的半致死量[11]及文献[12]）。

实验第22天、31天均收集4组尿液；实验第22天处死8只慢性肾衰组大鼠，实验第31天处死对照组、慢性肾衰组、GdDTPA组、NAC组大鼠，收集血液；4℃，4000 r/min 离心10 min，取上层清液即为血清。尿液及血清均置于

Symbolm@@ 80℃保存备用。

2.3核磁样品制备与数据处理

样品检测前于4℃融化，取400 μL尿液与200 μL磷酸盐缓冲液（0.25 mol/L，pH 7.4，20% D2O，1 mmol/L TSP）混合，静置10 min，4℃，8000 r/min离心10 min，取上层清液550 μL于核磁管中测试。

核磁谱图使用MestReC软件（www.mestrec.com）进行相位调整和基线校正，以TSP（δ =0.000）为内标。在δ 9.500～0.200范围内，谱图按δ=0.005分段积分，去除水峰（δ=5.320～4.340）及尿素峰（δ=6.200～5.450）。概率商归一化（PQN）后所得数据导入SIMCAP 11.0（Umetrics，Sweden），进行OPLSDA分析，OPLSDA模型进行CVANOVA（Cross validationanalysis of variance）验证（p<0.05）。endprint

2.4血清的生化指标检测及肾脏的组织病理学检查

血清的尿素氮（Blood urea nitrogen， BUN）、肌酐（Creatinine， Cr）在松上 A6 半自动生化分析仪上按照试剂盒方法（尿酶靛蓝法、苦味酸法）测试。

将处死的大鼠肾脏迅速取出， 用生理盐水冲洗，10%福尔马林固定后石蜡包埋，切片厚度3 μm，苏木素伊红（Hematoxylineosin， HE）染色，光学显微镜进行组织病理学观察，摄片。

3结果与讨论

3.1血清生化指标及肾脏组织切片光镜图的分析

大鼠血清中尿素氮及肌酐的含量见表1。从表1可见，慢性肾衰模型建立后（实验第22天），大鼠血清中尿素氮、肌酐显著性增加，说明慢性肾衰模型已经成功建立。实验第31天，慢性肾衰组血清中尿素氮、肌酐仍显著增加，说明建立的模型稳定。GdDTPA 给药7天后，GdDTPA组与慢性肾衰组相比尿

素

氮、肌酐均显著性增加，说明GdDTPA会对大鼠肾脏造成一定损伤。而NAC组与GdDTPA组相比，

血清中尿素氮、肌酐减少，说明给药GdDTPA时，NAC对大鼠肾脏有一定保护作用。

肾脏组织切片光镜图（图1）显示，与对照组相比， 慢性肾衰组（第22和31天）大鼠肾小球基底膜增厚、系膜细胞增生，细胞外基质增多，肾间质中可见纤维化、多见轻度中性粒细胞渗出与浸润，肾小管多灶性萎缩与消失，部分代偿性扩张，镜下多见腺嘌呤体内氧化产物2，8二羟基腺嘌呤结晶周围单核与巨噬细胞呈结节状病变。GdDTPA组结节状病变及肾小管内炎细胞弥漫浸润加剧，可能是GdDTPA影响肾脏功能，导致大量腺嘌呤体内代谢产物不易从肾脏排泄到体外，而留在肾内形成大量结晶物质，导致肾脏损伤程度的加剧。NAC组与GdDTPA组相比结节状病变及肾间质炎症浸润的程度有减轻，可见肾脏内出现管型，肾脏排泄代谢产物的功能有所提高。

3.2尿液的1H NMR谱图

尿液是最易于收集的生物体液，其组成及代谢物的浓度受机体各系统功能状态的直接影响，能够及时有效地反映机体的代谢变化。图2为对照组、慢性肾衰组、GdDTPA组和NAC组尿液的1H NMR 谱图，参考文献[15～17]进行谱峰归属。从图2可见，大鼠尿液主成分有短链脂肪酸（α羟基正丁酸、α羟基正戊酸）、糖酵解产物（乳酸、乙酸、丙酮酸、丙氨酸）、胆碱、三羧酸循环中间体（柠檬酸、顺乌头酸、α酮戊二酸、琥珀酸、延胡索酸、苹果酸）、有机酸（邻羟基苯乙酸苯酯、对羟基苯乙酸苯酯、苯乙酰甘氨酸、甲基丙二酸）、代谢中间产物（N乙酰谷氨酸、甘氨酸、二甲基甘氨酸）、代谢终产物（肌酐、牛磺酸、甲酸、N氧三甲胺、二甲胺、马尿酸、尿囊素、N甲基烟碱、烟酸）等。

α羟基正丁酸： αhydroxynbutyrate （αHB）； α羟基正戊酸： αhydroxynvalerate （αHV）； 甲基丙二酸： Methylmalonate； 乳酸： Lactate； 丙氨酸： Alanine； 乙酸： Acetate； 乙酰胺： Acetamide； N乙酰谷氨酸： Nacetylglutamate； 丙酮酸： Pyruvate； 琥珀酸： Succinate； α酮戊二酸： αketoglutarate； 柠檬酸： Citrate； 二甲胺： Dimethylamine； 二甲基甘氨酸： Dimethylglycine； 肌酐： Creatinine； 顺乌头酸： cisAconitate； 胆碱： Choline； N氧三甲胺： Trimethylamine Noxide （TMAO）； 牛磺酸： Taurine； 甘氨酸： Glycine； 邻羟基苯乙酸苯酯： oHydroxyphenylacetate （oHPA）； 苯乙酰甘氨酸： Phenylacetylglycine （PAG）； 对羟基苯乙酸苯酯： pHydroxyphenylacetate （pHPA）； 马尿酸： Hippurate； 苹果酸： Malate； 尿囊素： Allantoin； 尿素： Urea； 延胡索酸： Fumarate； 甲酸： Formate； 烟酸： Nicotinate； N甲基烟碱： Nmethylnicotinamide.

3.3潜在特征代谢物筛选

为了找出慢性肾衰组与对照组、GdDTPA组与慢性肾衰组、NAC组与GdDTPA组之间对分类贡献最大的潜在特征代谢物，分别对各组的1H NMR谱图数据进行OPLSDA分析，得到的得分图和相关系数载荷图见图3。如OPLSDA得分图所示，对照组与慢性肾衰组（图3A，3B）、慢性肾衰组与GdDTPA组（图3C）、GdDTPA组与NAC组（图3D）均可明显区分。

筛选出对组间分类做出显著性贡献（Variable importance in projection，VIP>1，p<0.05）的代谢物，对其1H NMR谱图积分面积进行单变量分析，结果见图4。从图4A可见，慢性肾衰组与对照组相比αHB、 乳酸、 丙氨酸、 丙酮酸、 琥珀酸、 α酮戊二酸、 柠檬酸、 二甲胺、 二甲基甘氨酸、 顺乌头酸、 TMAO、 甘氨酸、 oHPA、 PAG、 延胡索酸显著性增加，而N乙酰谷氨酸、肌酸酐、牛磺酸、烟酸显著性减少，乙酸先增加后减少，马尿酸先减少后增加。从图4B可见，GdDTPA组与慢性肾衰组相比αHB、牛磺酸、马尿酸显著性减少；NAC组与GdDTPA组相比αHB、αHV、乳酸、丙氨酸、顺乌头酸、牛磺酸、甘氨酸、oHPA、pHPA、烟酸显著性增加，而马尿酸、尿囊素、延胡索酸显著性减少。

3.4特征代谢物生物学分析

慢性肾衰模型建立后，肾小管和肾小球受损，过滤能力下降，尿肌酐显著性减少，这与文献[18]的研究结果一致。糖酵解相关产物（乳酸，丙酮酸，丙氨酸，乙酸）、三羧酸循环中间产物（柠檬酸，顺乌头酸，α酮戊二酸，琥珀酸，延胡索酸）、短链脂肪酸（αHB）的显著性增加说明慢性肾衰组大鼠能量代谢发生紊乱。NAC组糖酵解相关产物（乳酸、丙氨酸）也显著性增加，说明NAC对糖代謝造成影响。短链脂肪酸是肠道细菌的发酵产物，主要来自大肠内碳水化合物和蛋白质的降解，是肠道上皮细胞能量的重要来源。胆碱被肠道细菌分解为三甲胺，随后在肝脏中代谢产生TMAO。肾衰模型大鼠给药GdDTPA后，尿液中短链脂肪酸（αHB、αHV）、胆碱、TMAO减少，说明GdDTPA引起大鼠肠道细菌代谢紊乱，而NAC组αHB、αHV、胆碱、TMAO增加，说明在NAC保护下，肠道细菌代谢紊乱得到一定程度减缓。芳香酸经肠道菌群代谢产生苯甲酸，苯甲酸在肝脏中生成马尿酸[19]，肾衰模型大鼠给药GdDTPA后，尿液中马尿酸减少，说明肠道菌群与芳香酸代谢之间的平衡受到干扰，而在NAC影响下马尿酸进一步减少，此代谢过程紊乱并未得到改善，其原因需要进一步探索。endprint

文獻[20]报道钆会造成细胞内活性氧的累积，进而形成氧化压力，可能会对线粒体造成损伤。牛磺酸是机体内的抗氧化剂，GdDTPA组大鼠尿液中牛磺酸显著性减少，可能是GdDTPA对机体造成氧化损伤，这也与氧化压力指示性物质尿囊素的增加一致，而NAC组牛磺酸的显著性增加以及尿囊素的显著性减少，说明给药NAC后大鼠抗氧化能力显著性增强，这可能与NAC对细胞中谷胱甘肽的补充有关[21]，谷胱甘肽是一种重要的细胞内抗氧化剂，它能够限制氧化压力影响，保护细胞中脂质、蛋白质、DNA等重要成分。PAG、oHPA、pHPA在肝线粒体中由甘氨酸形成，GdDTPA组oHPA、pHPA、甘氨酸减少，可能是GdDTPA对肝脏线粒体代谢造成影响，而NAC组oHPA、pHPA、甘氨酸的显著性增加说明给药GdDTPA时，NAC对肝线粒体具有一定保护作用。

N乙酰谷氨酸由谷氨酸产生，是尿素循环的限速酶，慢性肾衰组N乙酰谷氨酸显著性减少，这与慢性肾衰组大鼠血清尿素氮的显著性增加（与对照组相比，p<0.05）一致[22]。而NAC组N乙酰谷氨酸的增加说明NAC对造模过程中的尿素循环紊乱具有一定修复作用。GdDTPA组血清中尿素氮含量显著性增加（与慢性肾衰组对比，p<0.05），而NAC组血清中尿素氮向慢性肾衰组恢复，说明NAC可能减缓大鼠体内肾损伤。

烟酸由色氨酸通过犬尿氨酸代谢通路产生[23]，其显著性减少说明慢性肾衰模型建立后此通路受到抑制。给药GdDTPA后，烟酸继续减少，而在NAC组，烟酸显著性增加，说明NAC对犬尿氨酸代谢通路具有保护作用。

4结 论

采用1H NMR方法对NAC保护下给药GdDTPA前后慢性肾衰大鼠尿液中的内源性代谢物进行分析。慢性肾衰造成大鼠体内能量代谢、尿素循环及犬尿氨酸等代谢通路发生紊乱。GdDTPA引发大鼠尿液中胆碱、TMAO、oHPA、pHPA、马尿酸、甘氨酸、烟酸、牛磺酸减少，尿囊素增加。而在NAC保护下给药GdDTPA，大鼠尿液中相关代谢物向慢性肾衰组恢复，说明NAC对GdDTPA引发的肠道细菌代谢、肝线粒体代谢、犬尿氨酸代谢及氧化损伤具有一定保护作用。NAC对尿素循环代谢的改善可能减轻大鼠的肾损伤，而其对细胞中谷胱甘肽的补充可能减轻GdDTPA造成的氧化损伤。

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Urinary Metabonomic Study on NAcetylcysteineProtected Rats with

Chronic Renal Failure from GdDiethylenetriamine

Pentaacetic Acid Administration

WAN ChuanLing1，2， XUE Rong1， ZHAN YouYang1，2， LI XiaoJing*1， PEI FengKui1

1（Changchun Institute of Applied Chemistry Chinese Academy of Sciences， Changchun 130022， China）

2（University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China）

AbstractNAcetylcysteine （NAC） protects rats administrated with gadoliniumbased contrast agents from renal injury， however， the underlying mechanisms remain unclear. A 1H NMRbased metabolomics approach coupled with OPLSDA （orthogonal projection to latent structure with discriminant analysis） was used to analyze the effect of NAC on urinary metabolic changes for Chronic Renal Failure Rats administrated with GdDTPA （GdDiethylenetriamine pentaacetic acid）. Combined with univariate analysis of integral area， the significantly changed metabolites were selected to screen out the potential metabolic disturbances that induced by GdDTPA and NAC. These researches may attribute to study of the protective effect of NAC from renal failure induced by gadoliniumbased contrast agents. The disturbance of energy metabolism， urea cycle and kynurenine metabolism were observed from the CRF group. GdDTPA caused the reduction of urinary choline， TMAO， oHPA， pHPA， hippurate， glycine， nicotinate and taurine accompanied with the elevation of allantoin. Metabonomic recovery in the NAC group was observed， which implied that NAC protects rats with chronic renal failure from GdDTPA induced disturbances of gut microbiota metabolism， liver mitochondria metabolism and kynurenine metabolism. The replenishment of glutathione in cells and the recovery of urea cycle that caused by NAC may protect rats from oxidative damage and renal injury.

KeywordsMetabonomics； Nuclear magnetic resonance； Chronic renal failure； Gddiethylenetriamine pentaacetic acid； NAcetylcysteine

（Received 17 April 2017； accepted 20 June 2017）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No.21305134）.endprint