不同栽培年限亳芍多糖与微量元素动态积累规律研究

姚厚军， 陈乃东,3， 陈乃富， 郭 旭， 刘路静, 司华阳

(1. 皖西学院 生物与制药工程学院， 六安 237012; 2. 皖西中药与天然药物工程技术研究中心， 六安 237012;3. 安徽医科大学 药学院， 合肥 230032； 4. 中国人民解放军陆军军医大学士官学校，石家庄050081)

不同栽培年限亳芍多糖与微量元素动态积累规律研究

姚厚军1,2， 陈乃东1,2,3， 陈乃富1,2， 郭 旭4， 刘路静1, 司华阳1

(1. 皖西学院 生物与制药工程学院， 六安 237012; 2. 皖西中药与天然药物工程技术研究中心， 六安 237012;3. 安徽医科大学 药学院， 合肥 230032； 4. 中国人民解放军陆军军医大学士官学校，石家庄050081)

对采自安徽亳州地区人工栽培1～7年亳芍样品，水提醇沉法提取多糖，蒽酮-硫酸法和原子吸收光谱法(FAAS)分别测定样品中多糖及微量元素含量，探讨多糖、微量元素在亳芍中的动态积累规律，为亳芍采收、品质评价与规范化栽培提供依据。结果表明，栽培年限对亳芍多糖和微量元素的积累有显著影响: 株龄1～7年的亳芍，多糖的含量分别为(2.06±0.12)%、(3.59±0.17)%、(4.66±0.26)%、(3.14±0.19)%、(2.44±0.03)%、(2.49±0.12)%和(2.32±0.20)%；株龄1～7年的亳芍铜元素、铅元素、铬元素、镁元素、钙元素、钠元素、锌元素和钡元素的平均质量分数分别为(3.28±0.63)、(3.16±0.63)、(1.69±0.09)、(300.17±13.64)、(1476.66±57.49)、(71.88±2.26)、(8.58±0.56)和(369.51±26.68) mg/kg (DW)；3种有害微量元素含量未超过5.0 mg/kg (DW)限量指标，均在规定限度范围内。上述结果显示，株龄3年亳芍多糖含量最高，亳芍中含丰富的人体必需微量元素，重金属限量指标整体上是安全的，微量元素的含量与多糖的含量存在相关性。

亳芍；多糖；微量元素；规范化栽培

AbstractThe contents of the total polysaccharide and the 8 trace elements of 1-7 years-old Bozhou Peony were detected by anthracenone-concentrated-sulfuric-acid colorimetry and AAS, respectively, to explore the dynamic accumulation of polysaccharides and 8 trace elements in Bozhou PeonyPaeonialactiflora, and to provide scientific basis for the optimum harvesting age, quality evaluation and standardized cultivation of Bozhou Peony. The results indicated that cultivating ages would significantly impact the accumulation of polysaccharide and trace elements. The average contents of polysaccharides of Bozhou Peony (from 1 to 7 years) were:(2.06±0.12)%, (3.59±0.17)%, (4.66±0.26)%, (3.14±0.19)%, (2.44±0.03)%, (2.49±0.12)% and (2.94±0.20)%; the mass fractions of Cu, Pb, Cr ,Mg, Ca, Na, Zn and Ba were (4.14±0.39), (5.02±0.87), (1.69±0.07), (300.17±13.64), (1476.66±57.49), (71.88±2.26), (8.58±0.56) and (369.51±26.68) mg/kg(DW), respectively, and all the mental elements were in limits except Pd content in the samples exceeded the standard limit 0.89 mg kg(DW). Our experimental suggested that the Bozhou Peony cultivated for 3 years obtained the highest polysaccharide. There were rich essential mental elements in Bozhou Peony and the contents of heavy mental elements were lower than the limited. There might exist correlation between the trace elements contents and the accumulation of polysaccharide in Bozhou Peony.

KeywordsBozhou PeonyPaeonialactiflora; polysaccharides; trace element; standardized cultivation

亳芍(Bozhou PeonyPaeonialactiflora)，即亳州白芍，是芍药科植物芍药(Paeonialactiflora)的根，作为安徽道地药材之一，主产安徽省亳州地区。具有抗炎、免疫调节、抗病毒、抗氧化、抗惊厥、护肝等作用，对胃肠道疾病和心血管疾病也有一定的疗效[1]。

截至目前，有关亳芍的化学成分，主要依据白芍的化学成分推论而来。作为安徽道地药材之一，尚未见对亳芍化学成分的系统研究报道。本课题组在前期研究中，发现并首次报道亳芍中存在微量生物碱类物质[2]，作为亳芍化学成分系统研究工作之一，本文拟对不同生长年限亳芍的多糖及微量元素含量变化规律进行研究，为探讨中药亳芍的最佳药材采收时期、质量评价及规范化种植提供依据。

1 仪器和试剂

1.1 仪器

AA-6800型原子吸收光谱仪(日本岛津公司)；L2433型铜、铅、铬、镁、钙、钠、锌、钡空心阴极灯(日本岛津公司)；YGH-500S/BS型远红外快速恒温干燥箱(上海跃进医疗器械有限公司)；DK-8D型数显恒温水浴锅(金坛市杰瑞尔电器有限公司)；RE-2000型旋转蒸发器(上海洪旋实验仪器有限公司)；XB-120A型电子分析天平(瑞士普利赛斯公司)；双光束紫外分光光度计(TU-1901型，北京普析通用仪器有限公司)。

1.2 试剂

无水乙醇、氯仿、浓硫酸、浓盐酸、α-萘酚、标准葡萄糖、蒽酮、丙酮、正丁醇和氢氧化钠等。以上试剂均为国产分析纯。

1.3 材料

实验材料亳芍2013年8月采自亳芍道地产区安徽省亳州市5个不同的亳芍种植基地，品种经皖西中药与天然药物工程技术研究中心陈乃东博士鉴定为毛茛科植物芍药(PaeonialactifloraPall.)干燥的根。

5个不同栽培基地分别挖取栽培1～7年的亳芍，共35个样品，以采自5个基地的15个样品测定的多糖和微量元素平均含量作为该株龄亳芍多糖及重金属的含量。新鲜的亳芍，洗净，去皮，晾干，备用。

2 实验方法

2.1 亳芍多糖含量测定

2.1.1 多糖的提取纯化

亳芍样品60℃干燥至恒重，粉碎，精密称取100 g，无水乙醇索氏提取至回流液无色，残渣挥尽溶剂，以料液比1∶5(V∶V)加入双蒸水，85℃下水浴回流提取，每次3 h，提取3次，过滤，合并提取液，减压浓缩至有明显沉淀，按浓缩液∶无水乙醇=24∶76(V∶V)加入无水乙醇，4℃冰箱过夜，以5000 r/min冷冻离心(离心半径15 cm)15 min，沉淀加适量的去离子水溶解，反复用乙醇沉淀，合并沉淀，加入适量蒸馏水，按照粗多糖溶液∶萃取剂(V∶V)=4∶1加入Sevage试剂[3～6](氯仿∶正丁醇=4∶1)除去蛋白。收集上层水相，浓缩，蒸干得精制多糖。

以蒽酮-硫酸比色法[7-9]测定含量，实验设3次重复。

2.1.2 线性关系考察

精确配制0.1 mg/mL的葡萄糖标准母液，精密量取0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL和1.0 mL于7支带塞刻度试管中，分别加双蒸水至体积为1.0 mL，摇匀，于冰水浴中缓慢滴加4.0 mL 0.2%蒽酮-硫酸溶液，摇匀，冷却后，100.0℃水浴10.0 min后取出，冷却至室温，以双蒸水为空白对照，于620 nm下测吸光度值，得吸光度与浓度的回归方程A=8.2567C+0.0262，R2=0.9901，在0～0.1 mg，吸光度(A)与浓度(C)呈良好的线性关系。

2.1.3 稳定性试验

精取样品液0.2 mL，按2.1.2所述操作，在620 nm处分别于0、30、60、120、240和360 min测定吸光度。结果显示该显色在6.0 h内稳定。

2.1.4 精密度试验

精密吸取葡萄糖标准溶液0.2 mL，按2.1.2操作，测定5 次。结果显示，RSD=2.3%。

2.1.5 换算因子的测定

精密称取精制多糖10.0 mg，配制成0.1 mg/mL的多糖溶液，精密吸取1.0 mL，按2.1.2操作测定其吸光度，按下式算得换算因子(F)：

F=W/(C×D)

其中：

W：精制多糖质量(mg)；C：多糖液中所含葡萄糖的浓度(mg/mL)；D：稀释因素。

2.1.6 多糖含量测定

精密称取亳芍粗多糖各10.0 mg，配制成0.1 mg/mL的多糖溶液，按2.1.2操作测定其吸光度，按下式算得亳芍多糖含量：

药材中多糖含量(%)=C×D×F×V/W×Y×100%

其中：

C：为样品液中折合葡萄糖的浓度(mg/mL)；D为样品溶液的稀释因素；F为换算因子；V为样品溶液体积(mL)；W为样品质量(mg)；Y为粗多糖得率。

根据上式分别计算出1～7生长年限亳芍总多糖的含量并进行比较。

2.1.7 重现性试验

取同一样品5份，按2.1.6所述操作，测定多糖含量。结果显示，RSD=2.95%，表明该方法重现性好。

2.2 亳芍金属含量的测定

2.2.1 样品处理

取粉碎机粉碎后的亳芍药材粉末适量，103℃烘干至恒重，精确称取粉末1.0 g，于瓷坩埚中经电炉低温炭化至无烟，移入马弗炉中500℃至完全灰化(约5～7 h)，冷却后取出，加10.0 mL 10%硝酸溶液溶解，溶液移至50.0 mL容量瓶中，用双蒸水洗涤容器，合并洗涤液于容量瓶，双蒸水定容至50.0 mL，摇匀。同法同时制备试剂空白溶液。

2.2.2 标准溶液配制与测定

按陈乃东等[10]所述方法制备各微量元素标准溶液，通过原子吸收分光光度计考察其线性关系，绘制标准曲线，测定各金属的含量，不同金属的仪器操作条件如表1。各金属标准曲线如表2所示，各金属标准溶液在0～1.0 mg/L范围内线性关系良好。

表1 原子吸收光谱法测铅、铜、铬、钙、镁、钠、钡、锌的工作参数

2.2.3 样品中微量元素含量测定

将2.2.1制备的样品，按照2.2.3所述操作测定吸光值，代入回归方程，求得样品中微量元素含量。

2.2.4 稳定性试验

取2.2.1制备的样品液，按2.2.3所述操作，分别于0、4、8、12、16、20和24 h测定吸光度，结果显示各微量元素的测定结果的RSD均小于5%，在24 h内稳定。

表2 各微量元素回归方程和线性范围

2.2.5 精密度试验

取2.2.1制备的样品液，按2.2.3所述操作，测定5 次。结果显示各微量元素的测定结果的RSD均小于5%。

2.2.6 加样回收率实验

在亳芍药材粉末(1.0 g)中添加适量的铜、铅、铬、镁、钙、钠、锌、钡标准溶液，测定其回收率。测得元素的加样回收率均在96%～99%，RSD值(n=5)在1.2%～3.7%之间，说明采用火焰原子吸收光谱法测定这8种元素稳定性良好，精确度较好、精密度较高、达到定量分析需求。

2.3 分析方法

应用SPSS统计软件对不同株龄亳芍多糖及金属含量进行描述性统计分析；偏相关分析亳芍营养元素与多糖含量间的偏相关系数，筛选影响多糖含量的主要营养元素。

3 结果与分析

3.1 多糖含量测定结果

在本实验条件下，测得株龄1～7年亳芍多糖含量为(图1)：(2.06±0.12)%、(3.1±0.23)%、(4.66±0.26)%、(2.9±0.33)%、(2.3±0.23)%、(2.4±0.10)%、(2.3±0.07)%。

3.2 不同株龄亳芍微量元素含量测定结果

不同栽培年限亳芍的铜、铅、铬、镁、钙、钠、锌、钡含量测定结果如表3所示。栽培1～7年的亳芍铜、铅、铬、镁、钙、钠、锌、钡平均质量分数分别为(3.28±0.63)、(3.16±0.63)、(1.69±0.09)、(300.17±13.64)、 (1476.66±57.49)、(71.88± 2.26)、(8.58±0.56)和(369.51±26.68) mg/kg(DW)。从元素的分布来看，钡、钙、镁的含量最高，铜、铅、铬3种重微量元素含量未超过5.0 mg/kg(DW)，均在规定限度范围内[11]。

图1 不同株龄的亳芍总多糖含量测定结果(n=3)

亳芍样品微量元素含量与生理年龄显著相关。供试的安徽道地药材亳芍，对比分析1～7年株龄样品的铜、铅、铬、镁、钙、钠、锌、钡含量平均值，铜、铅和锌含量随着株龄的增长而增长；镁、钙、钠含量随株龄增长变化不大；钡在3年时含量最低，5年时含量最高。这种变化可能与亳芍生理生化作用有关，锌和铜参与植物体氧化还原反应，这可能与亳芍抗氧化有效成分随着株龄增加而积累增加有关。钙参与细胞壁的合成，一旦形成后不易移动或转化，因此受株龄影响较小。

3.3 多糖含量与微量元素含量相关性研究结果

通过SPSS 17.0分析采自同一栽培基地1～7年生亳芍，多糖与必需元素之间的相关性，结果见表5。分析结果表明，铜含量与亳芍多糖含量具有显著相关性，锌含量与多糖含量存在正相关，与斯金平等研究结果一致[12]。多糖含量与钡、铬的含量呈负相关，与钙的含量没有相关性。

表3 不同生长年限的亳芍铜、铅、镁、钙、钠、锌、钡、铬质量分数

表4 多糖与微量元素间的相关性

“*”在 0.05水平(双侧)上显著相关；“**”在0.01水平(双侧)上显著相关

4 讨论与结论

栽培年限对亳芍多糖的含量存在显著影响：1～3年株龄的亳芍，多糖含量逐年增高，1年株龄的亳芍多糖含量最低(占药材干重2.06%±0.12%)，3年株龄的亳芍多糖含量最高，达药材干重的(4.66±0.26)%，栽培 3年以上，随着株龄增加，多糖含量下降。可能的原因在于，栽培的前3年，亳芍生长旺盛，多糖的积累量增加，3年后，植株逐渐衰老导致光合用积累多糖的能力下降，植株需消耗自身积累的多糖维持正常的生命活动，因此，亳芍多糖积累规律表现为先增加(栽培1～3年)、达到峰值后逐年下降，从多糖含量考虑，以栽培3年的亳芍药材品质较好。研究结果为安徽道地药材亳芍的质量控制提供参考依据，为后续研究亳芍药材的最佳采收时期及规范化种植奠定前期研究基础。

栽培时间对亳芍中各微量元素含量影响各有差异，可能与其所承担的生化作用有关。因此，在栽培中可根据亳芍生理需求补充相应的微量元素，以利亳芍生长。此外，多糖的含量与微量元素Cu、Zn、Na、Ba和Cr的含量具相关性，且与Cu、Zn、Na呈正相关，与Ba、Cr呈负相关。中药材中这些必需元素之间可能通过相互协同作用，从而对植株的次生代谢产生一定的影响。

有益微量元素是衡量药材内在质量指标因素之一，药材的疗效不但与其所含有机成分相关，还与其所含有的微量元素紧密相关。中药材中微量元素的种类与含量受其植物来源、产地、栽培条件及气候等条件的影响，是其道地性的重要成因，通过结合有机成分与无机必需元素的研究可望为解释中药有效成分关系及指导地道药材栽培提供理论指导。

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The dynamic accumulation of polysaccharide and trace elements from Bozhou PeonyPaeonialactiflorawithdifferentharvestingages

YAOHou-jun1,2,CHENNai-dong1,2,3,CHENNai-fu1,2,GUOXu4,LIULu-jing1,SIHua-yang1

(1. College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, West Anhui University, Lu′an 237012; 2.West Anhui Biotechnology Research Center of Natural Medicine and Traditional Chinese Medicine, West Anhui University, Lu′an 237012; 3. School of Pharmacy, Anhui Medical University, Hefei 230032; 4.Academy School, Military Medical University of the People′s Liberation Army of China， Shijiazhuang 050081, China)

Q949.95;R284.1;R282

A

2095-1736(2017)05-0066-04

2017-06-07；

2017-07-28

国家自然科学基金(81573536)；中国博士后基金特批资助(第9批)(2016T90559)；中国博士后研究面上项目(2014M551791)；安徽省人事厅博士后研究项目；安徽省自然基金面上项目(1608085 MH221)

姚厚军，副研究员，主要从事中药资源保护与利用研究, E-mail:yhj02000022@126.com

陈乃东，博士，教授，主要从事天然药物活性成分分离鉴定、中药与天然药物质量标准与质量控制研究，E-mail: 2004cnd@163.com

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.05.066