低浓度葫芦素-I诱导胃癌细胞G2/M期阻滞和细胞凋亡及其机制研究

李 建 肖修玲 李 彦 邹晓平 邓 超#

重庆市开州区人民医院消化科1(405400) 南京大学医学院附属鼓楼医院消化科2

低浓度葫芦素-I诱导胃癌细胞G2/M期阻滞和细胞凋亡及其机制研究

李 建1*肖修玲1李 彦1邹晓平2邓 超1#

重庆市开州区人民医院消化科1(405400)南京大学医学院附属鼓楼医院消化科2

背景：葫芦素-I通过抑制STAT3信号通路在多种恶性肿瘤中发挥强大的抗癌作用，但其在胃癌中是否同样具有抗癌作用及其作用机制，目前仍不清楚。目的：通过体外实验评估低浓度葫芦素-I对人胃癌细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响并初步探讨其可能作用机制。方法：以低浓度葫芦素-I处理人胃腺癌细胞株AGS和HGC-27，采用CCK-8试验和集落形成试验评估其对细胞增殖的抑制作用，流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡，蛋白质印迹法检测细胞周期转换相关蛋白表达以及caspase-3/PARP细胞凋亡途径、STAT3、GADD45α和JNK/p38 MAPK信号通路激活情况。结果：低浓度葫芦素-I可在不抑制STAT3信号通路的情况下发挥强大的胃癌细胞生长抑制作用，此作用是通过诱导细胞周期G2/M期阻滞和细胞凋亡实现的。机制研究发现葫芦素-I可通过上调GADD45α和激活JNK/p38 MAPK信号通路诱导细胞凋亡，发挥抗胃癌作用。结论：本研究揭示了葫芦素-I抗胃癌作用的新机制，证明葫芦素-I是一个具有临床应用前景的化疗药物。

葫芦素类； STAT3转录因子； 生长阻滞和DNA损伤诱导蛋白45α； 丝裂原活化蛋白激酶类； 胃肿瘤； 细胞周期； 细胞凋亡

Correspondenceto: DENG Chao, Email: denchao1@126.com

Background: Upon inhibition of STAT3 signaling pathway, cucurbitacin-I elicits anticancer effect in various malignancies. However, the anticancer effect and underlying mechanism of cucurbitacin-I in gastric cancer is still elusive.Aims: To explore the effect of low nanomolar cucurbitacin-I on cell proliferation, cell cycle and apoptosis in human gastric cancer cells and the underlying mechanisminvitro.Methods: Human gastric adenocarcinoma cell lines AGS and HGC-27 were treated with cucurbitacin-I at low nanomolar concentration. The anti-proliferative effect of cucurbitacin-I was detected by CCK-8 assay and colony formation assay. Flow cytometry was used to assess the cell cycle and apoptosis.Expressions of cell cycle-related proteins, as well as activation of related pathways such as caspase-3/PARP apoptotic pathway, STAT3, GADD45α and JNK/p38 MAPK signaling pathways were determined by Western blotting.Results: Cucurbitacin-I markedly inhibited the growth of gastric cancer cells at low nanomolar concentration by inducing G2/M phase arrest and apoptosis via a STAT3-independent manner. Furthermore, it was revealed that the anticancer effect of cucurbitacin-I was associated with up-regulation of GADD45α, activation of JNK/p38 MAPK signaling pathway and the subsequent apoptotic events.Conclusions: The present study provides new insights into the mechanism of anticancer effect of cucurbitacin-I, supporting cucurbitacin-I as an attractive therapeutic drug in gastric cancer.

KeywordsCucurbitacins; STAT3 Transcription Factor; Growth Arrest and DNA Damage-Inducible Protein 45alpha; Mitogen-Activated Protein Kinases; Stomach Neoplasms; Cell Cycle; Apoptosis

葫芦素是一类来源于葫芦科植物的三萜类化合物，具有抗菌、抗炎、抗糖尿病等多种生物学活性[1]。根据结构特征的差异，葫芦素可分为12类，其中葫芦素-B、-D、-E、-I和-Q可发挥强大的抗癌作用，既往绝大多数研究表明葫芦素类药物的抗癌作用主要是通过抑制STAT3信号通路实现的。葫芦素-I又名JSI-124，作为JAK/STAT3信号通路选择性抑制剂而得以广泛应用，在肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、头颈部鳞癌、恶性胶质瘤等多种STAT3异常激活的恶性肿瘤中发挥强大的抗癌作用[2-5]。但其在胃癌中是否同样具有抗癌作用及其作用机制，目前仍不清楚。本研究旨在评估低浓度葫芦素-I的抗胃癌作用并初步探讨其可能作用机制。

材料与方法

一、细胞株和主要试剂

人胃腺癌细胞株AGS和HGC-27购自中科院上海细胞库，人胃黏膜上皮永生细胞株GES-1购自上海吉凯基因化学技术有限公司，由南京鼓楼医院消化科实验室冻存。葫芦素-I(Sigma-Aldrich Co. LLC.)，pan-caspase抑制剂Z-VAD-FMK、广谱JNK抑制剂SP600125、p38 MAPK抑制剂SB203580(Selleck Chemicals.)，Lipofectamine®RNAiMAX 转染试剂(Thermo Fisher Scientific)；CCK-8细胞增殖/细胞毒性检测试剂盒[东仁化学科技(上海)有限公司]，细胞周期检测试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒(BD Biosciences)；试验中所用抗体，包括STAT3、磷酸化STAT3(p-STAT3，磷酸化位点分别为tyr705、ser727)、细胞周期蛋白依赖性激酶7(CDK7)、细胞周期蛋白B1(cyclin B1)、细胞分裂周期蛋白2(CDC2)、聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(PARP)、procaspase-3、-8、-9和cleaved caspase-3、-8、-9、生长阻滞和DNA损伤诱导蛋白45α(GADD45α)、JNK和p-JNK、p38 和 p-p38抗体均购自Cell Signaling Technology,Inc.。

二、方法

1. 细胞培养：GES-1、AGS和HGC-27细胞以含 10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基按贴壁方法在37 ℃、5% CO2孵箱内培养，细胞接近80%融合状态时，以含EDTA的0.25%胰酶消化传代，2～3 d一次。将对数生长期细胞按不同密度接种于6孔板、96孔板或25 cm2细胞瓶，用于后续实验。

2. CCK-8试验：于96孔板中每孔加入100 μL含5 000个胃癌细胞的细胞悬液，37 ℃孵育过夜，予不同浓度葫芦素-I处理24 h，以含10% CCK-8的100 μL培养基换液，37 ℃孵育1 h，使用酶标仪测定450 nm波长处吸光度值(A值)。每组设5个复孔，每次试验独立重复3次。相对细胞活力=(A处理组-A空白组)/(A对照组-A空白组)。

3. 集落形成试验：于6孔板中每孔铺1 000个胃癌细胞，过夜使其贴壁生长，予0、100、200 nmol/L葫芦素-I处理14 d，期间根据培养基颜色变化情况更换培养基。待长成肉眼可见的集落后，1 mL甲醇固定15 min，0.5%结晶紫染色15 min，洗净后于Olympus显微镜下拍照、计数。

4. 蛋白质印迹法：于6孔板中按相应要求处理胃癌细胞，贴壁细胞以4 ℃预冷PBS洗2次，RIPA裂解液冰上裂解，离心、收集上清液，BSA法测定蛋白浓度。以上样缓冲液调整各组蛋白至相同浓度，高温变性，上样，电泳，转至PVDF膜或NC膜，室温5%脱脂牛奶或5% BSA封闭2 h，根据试剂说明书稀释一抗至合适浓度，将膜置于含4 mL抗体稀释液的塑料盒中，4 ℃孵育过夜，取出条带，TBST漂洗，加入1∶3 000二抗稀释液，室温孵育1 h，TBST漂洗，ChemiScope 6000化学发光成像分析系统(上海勤翔科学仪器有限公司)曝光、拍照、分析。

5. 细胞周期检测：胃癌细胞以3×105/孔铺于6孔板，37 ℃孵育过夜，予不同浓度葫芦素-I处理12 h，收集贴壁细胞，预冷PBS洗2次，以125 μL溶液A(胰蛋白酶缓冲液)重悬细胞，轻轻振荡均匀，室温反应10 min，加入100 μL溶液B(胰蛋白酶抑制剂和RNA酶缓冲液)，轻轻振荡均匀，室温反应10 min，加入100 μL预冷溶液C(PI染液)，冰上避光反应10 min，于1 h内以流式细胞仪(BD Bio-sciences)分析细胞周期分布情况。

6. 细胞凋亡检测：胃癌细胞处理同细胞周期检测，收集悬浮细胞和贴壁细胞，预冷PBS洗2次，100 μL 1×结合缓冲液重悬，分别加入5 μL FITC Annexin V和5 μL PI，轻轻振荡均匀，室温避光孵育15 min，加入400 μL 1×结合缓冲液均匀稀释，于1 h 内以流式细胞仪分析细胞凋亡情况。

7. SiRNA转染：于6孔板中加入0.5 mL Opti-MEMⅠ减血清培养基和50 pmol 相应siRNA，再加入7.5 μL Lipofectamine®RNAiMAX 转染试剂，轻轻混合均匀，常温孵育20 min，加入含3×105个胃癌细胞的2 mL完全培养基悬液，轻轻混合均匀，使siRNA终浓度为20 nmol/L，48 h后进行相应检测。

三、统计学分析

结 果

一、低浓度葫芦素-I通过非STAT3信号通路抑制途径抑制胃癌细胞生长

CCK-8试验显示，经12.5、25、40、50、100和200 nmol/L 葫芦素-I处理24 h的AGS和HGC-27细胞，细胞活力依次降低，表明葫芦素-I可剂量依赖性地抑制胃癌细胞增殖，半数抑制浓度(IC50)在AGS和HGC-27细胞中分别约为97.4和123 nmol/L(图 1A)，低于既往在其他肿瘤细胞中的报道[2]。进一步以100、200 nmol/L葫芦素-I处理AGS、HGC-27细胞12 h、24 h、36 h和48 h，发现处理24 h时几乎已达到最大抑制效果(图1B)。集落形成试验显示，100、200 nmol/L葫芦素-I几乎能完全抑制AGS、HGC-27细胞的集落形成能力(图 1C)。因此认为低浓度葫芦素-I能有效抑制胃癌细胞生长。

既往多数研究表明葫芦素-I系通过抑制JAK/STAT3信号通路发挥抗癌作用。有鉴于此，本研究检测了人胃黏膜上皮永生细胞株GES-1和人胃腺癌细胞株AGS、HGC-27的STAT3基础激活情况及其在葫芦素-I处理后的变化。蛋白质印迹法检测显示，AGS、HGC-27细胞中STAT3基础激活明显高于GES-1细胞(图 1D)，而浓度在IC50附近(100 nmol/L)的葫芦素-I处理24 h对AGS、HGC-27细胞的STAT3激活无明显抑制作用(图 1E)。上述发现表明葫芦素-I对胃癌细胞生长的抑制作用可能不全是通过抑制STAT3信号通路实现的。为证明上述结论，以STAT3-siRNA处理48 h以沉默AGS细胞中的STAT3基因表达，CCK-8试验显示100 nmol/L葫芦素-I仍能有效抑制AGS细胞增殖(图 1F)。综上，低浓度葫芦素-I可在不抑制STAT3信号通路的情况下发挥强大的胃癌细胞生长抑制作用。

图1 低浓度葫芦素-I通过非STAT3信号通路抑制途径抑制胃癌细胞生长

二、葫芦素-I可通过上调GADD45α诱导胃癌细胞G2/M期阻滞和细胞凋亡

细胞周期检测显示，经100、200 nmol/L葫芦素-I处理12 h的AGS和HGC-27细胞，G2期细胞比例显著增加(图2A)，相应地，蛋白质印迹法检测显示在G2/M期转换中发挥重要作用的CDK7、cyclin B1、CDC2蛋白表达均被葫芦素-I明显抑制(图2B)，提示胃癌细胞发生细胞周期G2/M期阻滞。以100 nmol/L葫芦素-I处理AGS、HGC-27细胞1 h时即可观察到细胞形态发生明显变化，部分细胞变圆、稍发亮甚至漂浮。上述现象提示葫芦素-I可能引发细胞凋亡事件。细胞凋亡检测证实，经100、200 nmol/L葫芦素-I处理12 h的AGS、HGC-27细胞发生明显的早期和晚期凋亡(图2C)，同时蛋白质印迹法检测显示caspase-3/PARP细胞凋亡途径激活(图2D)。为证明caspase途径激活在此凋亡事件中居主导地位，以pan-caspase抑制剂Z-VAD-FMK 20 μmol/L预处理HGC-27细胞1 h后再进行上述检测，发现100 nmol/L葫芦素-I诱导细胞凋亡的能力明显减弱(图 2E)。

GADD45α是细胞应激反应中的一个重要基因，在细胞周期阻滞、细胞凋亡和DNA损伤修复的调节中起重要作用[6-8]。数据库资料分析显示，胃癌患者GADD45α mRNA表达水平明显低于正常人，高表达GADD45α mRNA的患者预后明显好于低表达者，提示GADD45α可能在胃癌中起抑癌基因作用。本研究蛋白质印迹法检测显示，100、200 nmol/L葫芦素-I处理24 h能明显上调AGS(p53野生型)、HGC-27(p53突变型)细胞GADD45α蛋白表达(图2F)。为进一步证明GADD45α参与介导了葫芦素-I诱导的G2/M期阻滞和细胞凋亡，以GADD45α-siRNA处理48 h以沉默AGS细胞中的GADD45α基因表达，CCK-8试验和蛋白质印迹法检测显示100 nmol/L葫芦素-I诱导G2/M期阻滞和caspase-3/PARP细胞凋亡途径激活的能力被抵消，同时被葫芦素-I抑制的cyclin B1、CDC2蛋白表达有所增加(图2G、2H)。综合上述发现，葫芦素-I诱导胃癌细胞G2/M期阻滞和细胞凋亡至少部分是通过上调GADD45α实现的。

三、葫芦素-I可通过激活JNK/p38 MAPK信号通路诱导胃癌细胞凋亡

据报道，葫芦素除诱导细胞凋亡外，还可通过激活MAPK家族诱导氧化应激，进而引起自噬和非凋亡性细胞死亡[9]。为明确葫芦素-I在胃癌细胞中是否亦能激活MAPK家族，本研究以葫芦素-I处理AGS、HGC-27细胞后检测了MAPK家族中两个关键成员JNK和p38的表达情况。蛋白质印迹法检测显示，经100、200 nmol/L葫芦素-I处理 24 h 的AGS和HGC-27细胞，p-JNK、p-p38表达明显上调(图3A)，表明葫芦素-I能激活JNK、p38。为进一步证明JNK、p38激活在葫芦素-I的抗胃癌效应中起关键作用，先以广谱JNK抑制剂SP600125或p38 MAPK抑制剂SB203580 20 μmol/L预处理AGS细胞1 h，再予100 nmol/L葫芦素-I处理，CCK-8试验显示JNK、p38抑制剂预处理能明显减弱葫芦素-I对胃癌细胞的杀伤作用，细胞活力显著升高(图3B)，细胞凋亡检测显示此种作用正是通过降低葫芦素-I诱导细胞凋亡的能力实现的(图3C)，蛋白质印迹法检测证明此时caspase-3/PARP细胞凋亡途径激活明显受抑，但cyclin B1、CDC2蛋白表达未受明显影响(图3D)。综合上述发现，葫芦素-I可通过激活JNK/p38 MAPK信号通路诱导胃癌细胞凋亡。

讨 论

尽管发达国家的胃癌发病率和死亡率呈下降趋势，但胃癌仍是世界范围内，尤其是一些高发国家如亚太地区的中国、韩国、日本最常见的恶性肿瘤之一[10-11]。对于已失去手术机会的晚期胃癌患者，单用或联用目前常用的化疗药物如5-氟尿嘧啶、阿霉素、顺铂等为其主要治疗手段之一，然而这些药物存在低效、高耐药率等不足[12]。因此，有必要开发新的、疗效更高的胃癌化疗药物。

虽然大多数研究表明葫芦素-I的抗癌作用主要是通过抑制STAT3信号通路实现的，但本研究发现低浓度葫芦素-I在不抑制STAT3信号通路的情况下即可诱导胃癌细胞G2/M期阻滞和细胞凋亡，从而抑制胃癌细胞生长。机制研究发现，纳摩尔级浓度的葫芦素-I可通过激活GADD45α和JNK/p38 MAPK信号通路诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡。

GADD45α是p53信号通路的经典效应蛋白，参与细胞周期阻滞、DNA损伤修复、细胞凋亡等多种生物学行为的调控[6-8]。但GADD45α在胃癌中发挥何种作用，迄今未见相关报道。本研究首次发现，

图2 葫芦素-I可通过上调GADD45α诱导胃癌细胞G2/M期阻滞和细胞凋亡

葫芦素-I在胃癌细胞中可上调GADD45α表达，进而诱导细胞发生G2/M期阻滞和细胞凋亡。此外，本研究还发现葫芦素-I可激活胃癌细胞中的JNK/p38 MAPK信号通路，与Zhang等[9]在Hela细胞中的发现相一致。既往研究[6-7]发现GADD45α可通过激活JNK/p38 MAPK信号通路诱导细胞凋亡。关于葫芦素-I在胃癌细胞中激活这两条信号通路的分子机制，以及两条信号通路间的交互作用，将是本课题组的后续研究方向。

综上所述，本研究首次发现葫芦素-I在较低浓度(对STAT3信号通路无抑制作用)时即可诱导胃癌细胞发生G2/M期阻滞和细胞凋亡，从而抑制胃癌细胞生长，发挥抗癌作用。进一步的机制研究发现，该作用可能是通过激活GADD45α和JNK/p38 MAPK信号通路实现的。这一发现为葫芦素-I成为抗胃癌治疗的新型化疗药物提供了新的理论依据。

图3 葫芦素-I可通过激活JNK/p38 MAPK信号通路诱导胃癌细胞凋亡

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12 Lordick F, Kang YK, Chung HC, et al; Arbeitsgeme-inschaft Internistische Onkologie and EXPAND Investigators. Capecitabine and cisplatin with or without cetuximab for patients with previously untreated advanced gastric cancer (EXPAND): a randomised, open-label phase 3 trial[J]. Lancet Oncol, 2013, 14 (6): 490-499.

(2017-03-24收稿；2017-05-18修回)

LowNanomolarCucurbitacin-IInducesG2/MPhaseArrestandApoptosisinGastricCancerCellsandtheUnderlyingMechanism

LIJian1,XIAOXiuling1,LIYan1,ZOUXiaoping2,DENGChao1.

1DepartmentofGastroenterology,thePeople’sHospitalofKaizhouDistrict,Chongqing(405400);2DepartmentofGastroenterology,theAffiliatedDrumTowerHospitalofNanjingUniversityMedicalSchool,Nanjing

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.09.003

*Email: 1446894878@qq.com

#本文通信作者，Email: denchao1@126.com