HCN2在大鼠外周神经病理性疼痛发生中的作用*

黄 涛， 付 波， 王 静， 王 滨， 刘少君△， 翁谢川△

(1. 军事医学科学院基础医学研究所神经生物学研究室； 2. 军事医学科学院国家蛋白质组学重点实验室， 北京 100850；3. 军事医学科学院卫生学环境医学研究所， 天津 300050)

HCN2在大鼠外周神经病理性疼痛发生中的作用*

黄 涛1,2， 付 波1,2， 王 静3， 王 滨1,2， 刘少君1,2△， 翁谢川1,2△

(1. 军事医学科学院基础医学研究所神经生物学研究室； 2. 军事医学科学院国家蛋白质组学重点实验室， 北京 100850；3. 军事医学科学院卫生学环境医学研究所， 天津 300050)

目的初步探讨超极化激活的环核苷酸门控通道2型(HCN2)在外周神经病理性疼痛发生中的作用。方法将24只健康成年大鼠进行随机分组(n=12)：假手术组(Sham)大鼠仅分离左侧L4、L5脊神经，模型组(SNL)分离脊神经后进行相应的结扎处理，手术7 d后用行为学方法进行模型评价；将造模成功的大鼠进行随机分组(n=6)：①阴性对照组(Saline)，左侧足底注射生理盐水；②阳性对照组(GBPT)，腹腔注射加巴喷丁；③实验组(ZD7288)，左侧足底注射HCN非特异性阻断剂ZD7288。在给药前以及给药后1 h、4 h、24 h、48 h用疼痛行为学实验检测其对神经病理性疼痛的作用；分别取手术前对照组(Control)、假手术组(Sham)和模型组(SNL)大鼠的背根神经节(DRG)(n=6)，利用qPCR和Western blot的方法研究造模前后大鼠DRG内HCN2的表达的变化情况。结果①成功建立大鼠神经痛模型；②与Saline组比较，GBPT组和ZD7288组在注射1 h后，均能明显的减轻大鼠神经病理性疼痛的症状(P<0.01)，而GBPT组和ZD7288组之间比较则无差异；③与Control组和Sham组相比较，SNL组大鼠DRG内的HCN2 mRNA表达量明显增加(P<0.01)；与Control组和Sham组相比较，SNL组大鼠DRG内的HCN2 通道蛋白表达量显著增加(P<0.05)。结论HCN2参与外周神经病理性疼痛的发生，并有可能成为治疗神经病理性疼痛一个潜在的新靶点。

外周神经病理性疼痛；HCN2；背根神经节；大鼠

神经病理性疼痛(neuropathic pain，NPP)是由躯体感觉神经系统的损伤或疾病而直接造成一种慢性疼痛。其表现为自发性疼痛、痛觉过敏、异常疼痛和感觉异常等临床特征。根据流行病学的研究，人群患有神经病理性疼痛的概率高达6.9%～10%[1]。许多疾病都能诱发神经病理性疼痛，例如糖尿病、带状孢疹、甲状腺功能低下以及抑郁症等。由于造成神经病理性疼痛的因素多样，其发病机制尚不明确，目前尚无有效的治疗手段。当前针对神经病理性疼痛的研究主要集中在神经电生理的改变、周围和中枢神经敏化、离子通道改变和新治疗靶点和新途径的探索等方面。

HCN (hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels)通道即超极化激活的环核苷酸门控通道，共有四种亚型HCN1、HCN2、HCN3和HCN4。HCN通道由4个同源或异源亚基聚合而成，具有以下特性[2]：(1)具有独特的电压依赖性，只有膜电位超极化时才被激活产生Ih电流；(2)具有非特异性的钠、钾离子通透性；(3)可直接受cAMP的调节；(4)对Cs+敏感，可以被其阻断。研究发现，HCN通道可以影响细胞膜静息电位，参与众多生理病理功能的调节，维持神经元兴奋性和神经网络的共振[2,3]。

研究显示，HCN通道广泛分布于痛觉传导通路并在疼痛形成和发展过程中发挥着重要作用[4-6]。我们前期的研究发现，HCN通道的亚型HCN2参与慢性炎性疼痛，其机制可能与慢性炎性条件下HCN2的表达上调和生物物理学特性改变相关[5]。神经病理性疼痛，不同于慢性炎性疼痛，但其临床症状提示我们HCN通道也有可能参与该疼痛的发生过程。因此，本实验拟采用脊神经结扎损伤(spinal nerve ligation, SNL)这一经典的神经痛模型，结合疼痛的行为学评价和药理学实验，以及分子生物学研究来阐述这一问题，探讨HCN2在外周神经病理性疼痛发生中的作用，为进一步阐明神经病理性疼痛的发生机制提供理论依据，也为神经病理性痛的诊疗提供新的线索。

1 材料与方法

1.1 材料

铬制羊肠线、医用真丝编织线(上海浦东金环医疗用品有限公司)；GBPT、HCN2单克隆抗体(Sigma-Aldrich)；ZD7288(Tocris Bioscience，UK)；总RNA提取试剂盒(北京天根生物科技有限公司)；SYBR Green、逆转录试剂盒(TOYOBO)；山羊抗鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)；戊巴比妥钠(北京化学试剂公司)；0.9%无菌生理盐水(石家庄四药有限公司)；多聚甲醛(国药集团化学试剂有限公司)；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 主要仪器

微量移液器、离心机(Eppendorf，德国)；Von Frey filaments(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；YLS-6B智能热板仪(上海精密仪器仪表有限公司)；PCR仪、荧光实时定量PCR仪(Life Technology，美国)；-80℃冰箱(海尔)；实验动物专用手术器械(上海医疗器械有限公司手术器械厂)。

1.3 实验动物模型的建立

实验所用动物为SPF级雄性SD大鼠，体重180～220 g，由军事医学科学院实验动物中心提供。实验开始前，对实验动物进行适应性饲养3 d，然后进行痛阈相关的的行为学检测，剔除痛觉过敏的大鼠。将符合实验标准的大鼠进行随机分组(n=12)，模型组(SNL)按如下步骤进行手术操作：腹腔注射戊巴比妥钠(60 mg/kg)对实验大鼠进行麻醉，待大鼠失去知觉后对大鼠腰部进行剃毛备皮，并固定于手术台上。根据大鼠髂骨顶端与第六腰椎齐平为依据[7]，找到第四腰椎和第五腰椎的位置，从大鼠左侧靠近腰椎处将表皮切开3 cm左右，分离肌肉组织，暴露出背根神经。用铬制羊肠线在L4背根神经上打一宽松的套环，用丝线将L5背根神经进行紧密结扎。术后对伤口进行消毒缝合；假手术组(Sham)只对大鼠L4、L5背根神经进行分离而不损伤。手术7 d后，再次对大鼠进行行为学检测，用统计学方法评价模型是否成功。

1.4 行为学检测

1.4.1 机械痛实验 利用Von Frey filaments检测大鼠机械刺激缩足反射阈值：将20 cm×20 cm×25 cm的透明有机玻璃箱放置于顶部为铁丝网的架子上。将大鼠放入箱内适应20 min，使其停止探索活动和修饰行为。实验者用Von Frey纤维丝穿过铁丝网刺激大鼠左后肢外侧三分之一的部位。刺激所用的纤维丝强度包括(g)：2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0。根据由小到大的原则，从2.0 g开始刺激。如果大鼠出现缩足反应或舔足行为，则换上一强度的纤维丝，反之则换下一强度的纤维丝。取包括第一次出现反应之后的6次测量值，重复测量2次，每次测量间隔5 min。按照50%的阈值计算疼痛的感知情况[8]。

1.4.2 热板实验 将YLS-6B智能热板仪设置为将热板加热至56℃。实验者迅速将大鼠放入热板仪内，同时脚踩计时踏板。若观察到大鼠左后肢出现明显的抬起动作或舔足动作，则立刻再次踩下踏板停止计时。此时仪器所显示的即为大鼠热痛阈值。重复测量2次，每次测量间隔5 min。

1.4.3 自发抬足实验 自发抬足被认为是自发性神经痛的重要指标。将大鼠放入上述铁丝网架上的透明箱内，使其适应20 min进入安静状态。记录5 min内大鼠自发抬起左后肢的时间(走动及舔足不纳入记录标准)。重复记录2次，中间间隔5 min。

1.5 药理学实验

ZD7288是HCN离子通道的非特异性阻断剂，加巴喷丁(gabapentin, GBPT)则是目前用于治疗神经病理性疼痛的一种抗癫痫药物。通过给药前后的行为学检测，观察ZD7288是否能起到逆转疼痛的作用，进而说明HCN2是否参与外周神经病理性疼痛。将造模成功后的大鼠进行随机分组(n=6)，按如下方法进行给药试验：①阴性对照组(Saline)，足底注射0.9%生理盐水，注射剂量为500 μl/kg；②阳性对照组(GBPT)，腹腔注射0.9%生理盐水配制的加巴喷丁溶液，注射剂量为10 mg/kg；③实验组(ZD7288)，足底注射0.9%生理盐水配制的ZD7288溶液，注射剂量为15 μg/kg。分别测量给药前和给药后1 h、4 h、24 h、48 h 5个时间点的上述3个行为学指标。

1.6 qPCR检测HCN2 mRNA的变化

随机选取造模前正常大鼠(Control)、造模后假手术组(Sham)和造模成功后的模型组(SNL)大鼠各6只，分离得到其背根神经节(dorsal root ganglia, DRG)，用总RNA提取试剂盒提取大鼠DRG总RNA，再用紫外分光光度计测量其浓度。取1.2 μg总RNA，利用逆转录试剂盒合成cDNA。将cDNA稀释两倍后，取2 μl进行qPCR。上游引物为5’-CCGGCGTCAACAAGTTCTC-3’，下游的引物设计为5’-TGCCCACGGGAATGATAATGA-3’，产物大小为180 bp。PCR扩增体系：逆转录产物2 μl，上下游引物各0.4 μl，2×QuantiTect SYBR green PCR Master Mix 10 μl，Nuclease-free Water 5.2 μl，10×plus one 2 μl。扩增条件：95℃预变性10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40个循环。以GAPDH为内参，采用2-△△Ct方法计算目的基因的改变倍数。

1.7 Western blot 检测HCN2的表达情况

随机选取造模前正常大鼠(Control)、造模后假手术组(Sham)和造模成功后的模型组(SNL)大鼠各6只，分离得到其DRG，用液氮研磨后，加蛋白裂解液置于冰上裂解30 min，12 000 r/min，4℃，离心10 min，吸取上清，用BCA检测试剂盒检测蛋白浓度；12% SDS-PAGE胶电泳，电转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶粉室温封闭1 h；孵育一抗，抗体稀释比：GAPDH(1∶1 000)，HCN2(1∶1 000)，4℃，过夜；TBST漂洗10 min×3次，滴加辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG二抗，室温孵育2 h；TBST漂洗10 min×3次，滴加显影液于PVDF膜上，在全自动凝胶成像分析仪上，根据Marker进行扫描成像。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 神经病理性疼痛模型的建立和评价

神经病理性疼痛脊神经结扎(SNL)模型大鼠的手术方法如前所述。手术前分别对假手术组(Sham)和模型组(SNL)进行机械痛实验、热板实验和自发抬足实验。手术后7 d，再次进行上述3项行为学检测。经统计分析，在机械痛实验中(图1A)，Sham组术前术后分别为(11.22±0.87 g，11.69±0.70 g)，而SNL组为(11.62±0.82 g，7.84±0.39 g，P<0.01)；在热板实验中(图1B)，Sham组术前术后分别为(7.59±0.35 s，7.41±0.51 s)，而SNL组分别为(7.85±0.37 s，4.68±0.45 s，P<0.01)；在自发抬足实验中(图1C)，Sham组术前术5 min抬足时间为(2.42±0.38 s，2.21±0.42 s)，而SNL组为(2.13±0.32 s，8.29±0.56 s，P<0.01)。以上实验结果表明，SNL组大鼠的热痛阈值和机械痛阈值明显降低，自发抬足时长明显增加，模型成功建立。

Fig.1Effects of operation on mechanical and heat hypersensitivity and spontaneous foot lifting (SFL) (n=12) SNL-operation significantly decreased mean paw withdrawal threshold to a mechanical stimulus(A) and mean paw withdrawal latency to a hot plate stimulus(B). C shows significantly longer SFL duration in SNL group**P<0.01vspreoperation

2.2 HCN通道阻断剂对大鼠行为学指标的影响

将给药前和给药后1 h、4 h、24 h、48 h的行为学进行统计分析，结果显示：在机械痛方面(图2A)，与Saline组(6.44±0.72 g)相比，大鼠腹腔注射GBPT(11.14±1.07 g)和足底注射ZD7288(12.34±0.72 g)1 h的时候，都能使大鼠50%机械刺激反射阈值明显增高(P<0.01)，同时GBPT组和ZD7288组之间没有差异；在热板实验中(图2B)，与Saline组(4.02±0.27s)相比，大鼠热痛阈值也显著提高，分别为GBPT组(5.61±0.29 s，P<0.01)、ZD7288组(5.80±0.35 s，P<0.01)；此外，给予GBPT和ZD7288后1 h、4 h都能减少大鼠自发抬足的时间(图2C)，在1 h时，ZD7288(1.75±0.39 s，P<0.01)效果优于GBPT(3.75±0.76 s，P<0.01)，此时，Saline组为(8.75±0.82 s)，而在4 h时，GBPT(4.92±0.53 s，P<0.01)效果则优于ZD7288(5.50±0.71 s，P<0.05)，此时Saline组为(8.16±0.89 s)。以上结果提示HCN通道的阻断剂ZD7288能起到逆转疼痛的作用。

Fig.2Effects of operation on mechanical and heat hypersensitivity and spontaneous foot lifting (SFL) (n=6) ZD7288 significantly increased mean paw withdrawal threshold to a mechanical stimulus(A) and mean paw withdrawal latency to a hot plate stimulus(B) at 1 h. C shows ZD7288 deceased the rats’ duration of SFL at 1 h and 4 h*P<0.05，**P<0.01vssaline group

2.3 造模前后大鼠DRG内HCN2的表达变化

通过qPCR实验检测并计算2-△△CT值，结果如图(3A)所示，对比手术前Control组(1.13±0.15)，Sham组(1.27±0.10)大鼠DRG内HCN2的mRNA无显著变化，而SNL组(3.16±0.46)大鼠DRG内HCN2的mRNA量明显增加(P<0.01)；同时与Sham组相比，SNL组的2-△△CT值也明显增大(P<0.01)。Western blot实验结果显示(图3B、3C)，SNL组大鼠DRG内HCN2蛋白表达水平也有所提高，各组中HCN2蛋白条带相较于内参GAPDH条带的灰度比分别是Control组(0.58±0.04)、Sham组(0.61±0.01)，SNL组(0.81±0.05)，P<0.05。以上结果说明HCN2随着神经痛的形成而表达上调，提示HCN2与神经病理性疼痛的形成相关联。

Fig.3The expression of HCN2 in rats’DRG(n=6) A shows that the mRNA significantly increased in SNL group’s DRG. B and C shows the HCN2 protein increased in SNL group’s DRG. The results indicate HCN2 channels contribute to the mechanisms of neuropathic pain*P<0.05，**P<0.01vssham group

3 讨论

神经病理性疼痛是目前临床上难以解决的问题之一。它的发生部位、发生时间、临床症状和诱发原因都没有固定的模式。神经病理性疼痛对患者造成的影响也因人而异，但是共同点是持续时间长，严重影响患者的正常生活。有的患者还可能因此引发失眠、焦虑、抑郁，甚至自杀。神经病理性疼痛在临床上还没有针对性的有效药物，目前使用较多的是抗癫痫药物(普瑞巴林、加巴喷丁)、抗抑郁药(三环、非三环抗抑郁药)以及阿片类等其他药物[9]。这些药物普遍存在着作用靶点不明、副作用多、缓解疼痛效率低及易复发等缺点。因此，寻找新的药物治疗靶点无疑对神经病理性疼痛的临床治疗具有重要的意义。

关于神经病理性疼痛的发生，传入神经元受损异常放电假说是目前比较公认的机制之一。该假说认为，外周神经损伤后产生的自发疼痛和诱发痛与受损部位神经元自发和持续性地异常放电密切相关，而这种异常放电与离子通道的异常相关[10]，如Na1.3、Na1.7、Na1.8、Na1.9以及钠激活型钾离子通道等，是目前研究较多的与疼痛相关的钠离子通道亚型[11]。研究表明，HCN通道在维持膜电位的稳定性和细胞兴奋性发挥了重要的作用。HCN通道与一般的钠、钾离子通道最大的不同点是它只有在超极化时被激活，同时产生一个内向的Ih电流。当HCN通道与cAMP结合并激活时，Ih电流可以使静息膜电位去极化，进而提高神经元的放电频率。本研究通过一系列实验证实HCN2参与外周神经病理性疼痛的发生，其表达量在神经痛大鼠DRG内显著增加。该结果提示我们HCN2在外周神经病理性疼痛中的作用是维持伤害性感觉神经元的兴奋性，从而产生持续的、异常的疼痛。

前已述及，HCN2参与炎性疼痛已被证实，它是炎性介质PGE2的作用靶点。PGE2在外周和中枢敏化中发挥重要作用，而中枢敏化是慢性疼痛的原因之一[12]。近期的研究发现COX2缺失的小鼠在神经病理性疼痛中表现出更加缓和的症状，而COX2是PGE2合成相关的酶。这就提示我们，HCN2不但参与两种疼痛的发生，还极有可能是炎性疼痛向神经病理性疼痛过渡的桥梁。

本研究采用的是目前常用的神经病理性疼痛模型之一(SNL)，其造模成功率较高，最快术后3 d即可检测到痛阈值的变化，7～10 d后大鼠痛觉变化最明显，而且它持续时间长，往往可以观察8周以上[13, 14]。在药理学实验中，前文提到HCN通道对Cs+敏感，可快速结合胞外的Cs+并发生阻滞，但因为Cs+同时是非选择性的钾通道阻断剂并具有一定的毒性，因此我们选择更为安全有效的HCN通道的非特异性阻断剂ZD7288。所谓非特异性阻断剂，即ZD7288会同阻断HCN通道的4种亚型，因此仅通过药理学实验并不能判断是HCN2发挥了逆转疼痛的作用。但是根据已报道的研究结果，可以对其他3种亚型加以排除。第一，HCN1只在一小部分冷觉感受器上有分布，只占其表达总量的5%[15]。第二，HCN2在小的伤害性感觉神经元上有较多表达[16]。第三，HCN3在DRG内有较多表达，但是其全身敲除小鼠在痛觉方面没有变化。第四，HCN4不表达于神经系统内[17]。综上所述，HCN2是最有可能在外周神经病理性疼痛中发挥作用。

本研究的结果只是证实HCN2参与外周神经病理性疼痛，而我们最终的目的是要探究HCN2参与神经病理性疼痛的机制，进而才有可能发现并利用潜在的治疗靶点。孙瑞卿等[18]探讨利用不同频率的电针治疗神经病理性疼痛，其原理是促进脑啡肽和内吗啡肽的释放。实际上，由于HCN2的放电特性，它在神经递质的释放方面也具有调节作用。因此，研究如何利用HCN2的电生理特性，将有可能为神经病理性疼痛的治疗找到新的策略。

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EffectsofHCN2inthedevelopmentofperipheralneuropathicpaininrats

HUANG Tao1,2, FU Bo1,2, WANG Jing3, WANG Bin1,2, LIU Shao-jun1,2△, WENG Xie-chuan1,2△

(1. Department of Biology, Institute of Basic Medical Science, Academy of Military Medical Science; 2. State Key Laboratory of Proteomics, Beijing 100850; 3. Institute of Health and Environmental Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Tianjin 300050, China)

Objective: To explore the effects of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels 2(HCN2) in the formation of peripheral neuropathic pain in rats.MethodsTwenty-four healthy adult rats were divided into two groups randomly(n=12): the sham group rats were only isolated the left L4, L5 spinal nerve, the spinal nerve ligation(SNL) group was separated the spinal nerve and performed the corresponding ligation. The behavioral experiments were tested 7 days after operation; The model rats were randomly divided into 3 groups(n=6): ① negative group(Saline), intra-plantar injection of saline in left hindpaws; ② positive group(gabapentin, GBPT), intraperitoneal injection of gabapentin; ③ experimental group(ZD7288), intra-plantar injection of ZD7288 in left hindpaws. The behavioral experiments were tested before injection and 1 h, 4 h, 24 h and 48 h after injection; Obtaining the dorsal root ganglion(DRG) of the control group (before operation), sham group and the SNL group(n=6), using qPCR and Western blot to analyze the mRNA and protein of HCN2 in rats’ DRG.ResultsThe rat model of neuropathic pain was successfully established. Compared with saline group, GBPT group and ZD7288 group could significantly reduce the symptoms of neuropathic pain in rats after injection 1 h (P<0.01), and there was no difference between GBPT group and ZD7288 group. Compared with control group and sham group, the expression of HCN2 mRNA in SNL group’s DRG was significantly increased (P<0.01), and the expression of HCN2 channel protein was also increased significantly (P<0.05).ConclusionHCN2 is involved in the development of peripheral neuropathic pain and is likely to be a potential new target for the treatment of neuropathic pain.

peripheral neuropathic pain; HCN2; DRG; rat

Q28

A

1000-6834(2017)04-294-06

北京市自然科学基金面上项目(7142123)；蛋白质组学国家重点实验室优青课题(SKLP-YB201403)；总装预研基金课题(9140A26060215JB94001)

2017-03-01

2017-06-02

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Tel: 010-66931304, 010-66931345; E-mail: liusj@bmi.ac.cn, wengxc2000@sina.com

10.12047/j.cjap.5574.2017.072