生物质炭对土霉素胁迫下小白菜种子萌发的影响

马瑞阳，闫聪聪，符博敏，俞花美，葛成军,2,*

1. 海南大学环境与植物保护学院，海口 5702282. 浙江大学生命科学学院，杭州 310058

生物质炭对土霉素胁迫下小白菜种子萌发的影响

马瑞阳1，闫聪聪1，符博敏1，俞花美1，葛成军1,2,*

1. 海南大学环境与植物保护学院，海口 5702282. 浙江大学生命科学学院，杭州 310058

采用土培模拟污染实验，将甘蔗渣炭、菠萝渣炭和木薯渣炭分别以0%、0.1%、0.5%和1.0%的炭土比添加到砖红壤中，研究土霉素胁迫下小白菜种子萌发效应。结果表明：(1)生物质炭促进种子萌发；土霉素在0～300 mg·kg-1胁迫下种子发芽率未受明显影响，300～500 mg·kg-1时受轻微抑制。(2)土霉素为0～100 mg·kg-1时对种子根及芽伸长呈促进作用，促进率最高达33.05%。100～500 mg·kg-1呈抑制效应，最大抑制率63.98%；种子对土霉素的敏感顺序依次为：根伸长>芽伸长>发芽率。(3)在土霉素胁迫下炭土比与种子根伸长呈显著正相关。3种生物质炭对小白菜种子根及芽伸长的促进效果呈：木薯渣炭>菠萝渣炭>甘蔗渣炭。(4)生物质炭和低浓度土霉素共同促进小白菜萌发，对高浓度土霉素毒性有缓解作用。

生物质炭；土霉素胁迫；小白菜；根伸长；芽伸长

Received15 January 2017accepted20 March 2017

Abstract: To explore the effects of oxytetracycline on the germination of cabbage seeds, soil culture experiment was used in the laterite soil in this study, with the supplement of bagasse biochar, pineapple biochar and cassava biochar at a carbon/soil ratio of 0, 0.1%, 0.5% and 1%, respectively. The results showed that: (1) Oxytetracycline had little effect on the germination rate of cabbage seeds at low concentration (i.e., 0-300 mg·kg-1), while inhibited it lightly at higher concentrations (i.e., 300-500 mg·kg-1); (2) Low concentrations of oxytetracycline (i.e., 0-100 mg·kg-1) promoted the root/shoot elongation of cabbage seeds with the maximum promotion rate of 33.05%. However, high concentrations (i.e., 100-500 mg·kg-1) of oxytetracycline had inhibitory effects on them and the inhibition rate raised up to 63.98%. On the other hand, seeds were sensitive to oxytetracycline, but the root elongation was more sensitive than shoot elongation and than germination rate; (3) Positive correlations between the ratio of biochar/soil and the root elongation of cabbage seed were also observed under oxytetracycline stress. All three types of biochars promoted the elongation, with more obvious promotion effect induced by cassava biochar than that of pineapple biochar, and than bagasse biochar;(4) Biochars combined with low concentrations of oxytetracycline jointly promoted the root and shoot elongation, and meanwhile alleviated the toxicity at high concentrations of oxytetracycline.

Keywords: biochar; oxytetracycline stress; cabbage; root elongation; shoot elongation

随着我国畜禽养殖业的迅速发展，抗生素的应用范围和施用总量持续增长。据统计，欧共体抗生素的消耗量每年达5 000 t[1]。2000年我国兽药抗生素用量已经超过6 000 t[2]。研究表明，施用到动物体内的抗生素有25%～75%以原药形式通过粪便排出体外[3-5]，并且在土壤中长期持留[6-7]。土霉素是我国使用量最多的兽药抗生素之一，其在动物体内消除缓慢、代谢率低，多数以原药形式通过新陈代谢排出并进入土壤环境[8-9]。进入土壤中的土霉素，由于存在外源不断输入，导致长期积累于土壤中。土霉素极易在植物体内富集，可通过食物链对人体产生危害[10-11]。

生物质炭是由生物质在限氧条件下热解制备的富碳材料[12]。多孔、高比表面积、含氧活性基团等特性赋予其良好的吸附能力[13]。作为土壤腐殖质中高度芳香化结构组分的重要来源，生物质炭在稳定土壤有机碳库、持留土壤养分、维持土壤生态系统平衡也发挥着重要作用[14]。生物质炭具有成本低、绿色环保、技术简单、治污效率高等优点，在污水处理和土壤重金属钝化等方面应用广泛，但其在土壤抗生素污染修复中的应用较少。

本文选取小白菜为供试作物，通过土培模拟污染实验研究了外源生物质炭施入土壤后不同浓度土霉素对小白菜种子萌发的影响，并对比不同原料制备的生物质炭对土霉素毒性的缓解效应，旨在揭示生物质炭农用的环境效应及其在抗生素污染土壤修复中应用的可行性。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 供试材料

供试作物小白菜(Brassica rapa var. glabra)，品种为揭农三号甜白菜，产地为广东省揭阳市，培育单位为保丰种子商行。购自海南省海口市菜满堂种子经销部。

供试土壤为砖红壤，采自海南大学热带农林学院基地无污染源农田表层(0～20 cm)土壤，自然风干后磨碎并过2 mm尼龙筛备用。实验土壤基本理化性质如下：pH值为5.31，全氮、全磷、全钾和有机质含量分别为4.21%、0.15%、0.76%和2.98%。

供试抗生素为土霉素，纯度98%，购自adamas-beta公司。

分别将木薯渣、甘蔗渣和菠萝皮渣经自然风干，碾碎后置于马弗炉中，在限氧条件下200 ℃预炭化2 h后，将温度升至550 ℃并保持炭化3 h，制得3种不同性质生物质炭后过0.2 mm筛备用。

本实验在海南大学热带农林学院环境功能材料实验室内完成。发芽率实验在受控智能人工气候培养箱(杭州钱江ZRX-300D)中进行。试验用水为Spring-S60i+PALL超纯水系统制备。

1.2 实验方法

称取50 g风干土壤于90 mm硬质玻璃培养皿中，将生物质炭分别以0%、0.1%、0.5%和1.0%的炭土比加入土壤中，添加土霉素浓度分别为0、10、50、100、300、500 mg·kg-1，每个处理设置3个平行，用去离子水调节土壤至最大持水量的60%左右，用医用镊子将植物种子均匀播种于土壤中(放置种子时，保持种子胚根末端和生长方向呈直线)，每皿放置20粒种子。盖好玻璃培养皿，置于人工气候培养箱中25 ℃下暗处培养，定期观察种子发芽数、根长、芽长等指标。当空白对照种子发芽率>70%，根长达到20 mm时结束实验。

1.3 测定指标与方法

选取发芽率、根和芽伸长及其抑制率作为测定指标。

发芽率作为检验种子播种品质的指标可指示种子萌发能力，计算公式如下：

种子根及芽伸长用卷尺直接测量，可直观的测定土霉素胁迫下小白菜种子的生态毒性效应。抑制率(IR)采用如下计算公式：

抑制率(IR)=

以浓度-抑制率绘制曲线，进行回归分析，并根据回归方程计算出种子生长抑制率为50%时土霉素的浓度(IC50)。

1.4 数据分析

采用SPSS17.0和Excel软件对试验数据进行回归分析和对浓度-抑制率曲线进行拟合并作图。

2 结果与分析(Results and analysis)

2.1 生物质炭对土霉素胁迫下小白菜种子发芽率的影响

生物质炭对土霉素胁迫下小白菜种子发芽率的影响如图1所示。由图1(a)可知，甘蔗渣炭炭土比为1.0% (质量分数)时，小白菜种子发芽率增大。土霉素浓度小于300 mg·kg-1时对种子萌发影响较小。种子发芽率在70%左右波动，这可能与种皮对有机污染物透过具有一定的阻碍作用有关，也可能与种子萌发过程能量主要来源于相关酶对种子内淀粉、蛋白质和脂肪的活化分解作用有关[15]。浓度为500 mg·kg-1时，发芽率略有下降。由图1(b)可知，木薯渣炭存在时土霉素胁迫下种子发芽率介于65%～95%，对小白菜发芽率有一定促进作用且炭土比为1.0%时效果最好。这可能是生物质炭增加土壤肥力，改善土壤环境促进小白菜种子萌发。同甘蔗渣炭一样，除炭土比为1.0%外小白菜种子发芽率受土霉素的影响较小，当土霉素浓度高达500 mg·kg-1时，炭土比为0%和0.1%条件下的种子发芽率明显减小。由图1(c)可知，菠萝渣炭促进种子萌发，当炭土比为0.1%时促进作用最明显。土霉素胁迫浓度为500 mg·kg-1时，炭土比为0%和0.5%条件下的种子发芽率下降。

对比3种生物质炭对土霉素胁迫下小白菜种子发芽率的影响可知，生物质炭在一定程度上促进种子萌发。甘蔗渣炭和木薯渣炭在炭土比为1.0%时促进效果最优，而菠萝渣炭在炭土比为0.1%时的促进效果最明显。3种生物质炭在土霉素胁迫下对发芽率影响表现为低浓度促进，高浓度抑制，可能是土霉素毒性高，超过种子萌发耐受极限，导致小白菜种子发芽率降低。

2.2 生物质炭对土霉素胁迫下小白菜种子根伸长的影响

2.2.1 生物质炭对小白菜种子根伸长的影响

由图2可知，在没有土霉素胁迫条件下施加3种生物质炭的小白菜种子根伸长值均大于未施加生物质炭时的值，说明3种生物质炭对根伸长均具有促进作用。炭土比相同条件下，木薯渣炭的促进作用明显优于其他2种炭。3种炭的促进效果表现为：木薯渣炭>菠萝渣炭>甘蔗渣炭。土壤中炭土比越大，根伸长长度越长。

图1 生物质炭对土霉素胁迫下小白菜种子发芽率的影响Fig. 1 The effects of biochar on cabbage seed germination rate under oxytetracycline stress

图2 生物质炭对小白菜种子根伸长的影响Fig. 2 Effect of the biochar on root elongation of cabbage

图3 土霉素胁迫对小白菜种子根伸长的抑制率Fig. 3 The inhibition of oxytetracycline on root elongation of cabbage

2.2.2 土霉素胁迫对小白菜种子根伸长的影响

由图3可知，土霉素浓度为0～100 mg·kg-1，小白菜种子根伸长抑制率为负值，说明外源土霉素促进种子根伸长，促进作用先增强后减弱，在土霉素浓度为50 mg·kg-1时促进作用最明显。浓度为100～500 mg·kg-1时，种子根伸长抑制率为正值，表明种子根受土霉素胁迫抑制，抑制效应随土霉素浓度增大而增强。

在不加炭的对照土壤中，土霉素浓度和小白菜根伸长抑制率呈显著线性相关性(P<0.05)。土霉素胁迫下种子根长的IC50值为417.87 mg·kg-1，说明供试小白菜品种优良，对土霉素耐受性较好。

2.2.3 生物质炭对土霉素胁迫下小白菜种子根伸长的影响

生物质炭对土霉素胁迫下小白菜种子根伸长的影响如图4所示。当土壤中土霉素浓度在0～50 mg·kg-1范围，小白菜种子根伸长抑制率为负值且呈下降趋势，说明低浓度土霉素和生物质炭共同促进小白菜根伸长，且促进效果随浓度的增大而增强。浓度为50～100 mg·kg-1，小白菜根伸长抑制率为负值并呈减弱趋势，说明随土霉素浓度增大促进效果减弱。土霉素浓度为100～500 mg·kg-1时抑制小白菜根伸长，而生物质炭具促进作用，二者共同影响呈现出种子根伸长抑制率随土霉素浓度升高而增大，且随炭土比升高而降低的趋势。土霉素胁迫下，与未添加生物质炭对比，添加生物质炭可降低抑制率。说明生物质炭促进种子根伸长，且对土霉素低浓度促进效应具有一定影响，当炭土比1.0%时促进效果最明显。

图4 生物质炭对土霉素胁迫下小白菜种子根 伸长抑制率的影响Fig. 4 The effect of biochar on root elongation inhibition rate of oxytetracycline to cabbage

外源生物质炭加入时，土霉素浓度和小白菜种子根伸长抑制率之间具显著相关性(P<0.05)，回归方程如表1所示。添加3种生物质炭后小白菜根伸长IC50值均大于不加炭处理，说明土壤中施加生物质炭促进小白菜根伸长。当炭土比分别为0.1%、0.5%和1.0%时，甘蔗渣炭添加组土霉素对小白菜根伸长的IC50值分别为483.39、511.24和552.91 mg·kg-1，木薯渣炭组分别为453.15、489.35和767.23 mg·kg-1，菠萝渣炭组分别为469.73、465.57和548.76 mg·kg-1。小白菜根伸长的IC50值总体上随炭土比的增大而增大，说明土壤中生物质炭含量的增大可有效促进小白菜根伸长。因此，土壤中施入生物质炭可有效缓解高浓度土霉素胁迫下小白菜根伸长的毒性效应。对比3种生物质炭缓解毒性的效果，木薯渣炭效果最优。

2.3 生物质炭对土霉素胁迫下小白菜种子芽伸长的影响

2.3.1 生物质炭对小白菜种子芽伸长的影响

如图5所示，无土霉素胁迫下，炭土比和芽伸长长度呈正相关。即炭土比越大，芽伸长长势越好。3种生物质炭对小白菜种子芽伸长均起促进作用，且促进效果与根伸长相似，均表现为：木薯渣炭>菠萝渣炭>甘蔗渣炭。

2.3.2 土霉素胁迫对小白菜种子芽伸长的影响

如图6所示，土霉素胁迫下小白菜种子芽伸长抑制率的影响呈低浓度(小于100 mg·kg-1)促进，高浓度(大于100 mg·kg-1)抑制的趋势。土霉素胁迫下小白菜芽伸长的IC50值为523.61 mg·kg-1且大于根的IC50值，说明芽对土霉素的耐受性更强，根对土霉素的敏感性更大。这可能是芽伸长过程所需的物质和能量主要来自胚内的养分供应，其受外界土壤中土霉素影响不大。而根一开始就完全暴露于土壤中，其生长发育全过程受土壤条件的影响较大。当外源污染物存在于土壤环境中时，土壤中微生物活性受抑制，营养物质转化受阻，进而导致作物根尖细胞有丝分裂数减少，分裂速度减慢，根伸长被抑制[16]。因此，根对土壤污染的反应更敏感和直接。该结果与前人研究结果相一致[17-19]。

图5 生物质炭对小白菜种子芽伸长的影响Fig. 5 Effect of the biochar on shoot elongation of cabbage

图6 土霉素胁迫对小白菜种子芽伸长抑制率的影响Fig. 6 The effect of oxytetracycline on shoot elongation inhibition rate of cabbage

表1 生物质炭对土霉素胁迫下小白菜种子根伸长影响的回归方程和IC50Table 1 Regression equation and IC50 for seed root elongation under the effect of biochar and oxytetracycline stress

注：RI为根伸长抑制率；x为土霉素的浓度。

Note: RI is the inhibition rate of root elongation; x is oxytetracycline concentration.

图7 生物质炭对土霉素胁迫下小白菜种子 芽伸长抑制率的影响Fig. 7 The effect of biochar on shoot elongation inhibition rate of oxytetracycline to cabbage

2.3.3 生物质炭对土霉素胁迫下小白菜种子芽伸长的影响

生物质炭对土霉素胁迫下小白菜种子芽伸长的影响如图7所示，其趋势和根相一致：炭土比越大，芽伸长长势越好。低浓度土霉素胁迫下，种子细胞分裂素分泌增多，芽伸长速度加快，生物质炭也促进芽伸长，二者共同作用使种子芽伸长长度增大，抑制率减小；高浓度土霉素污染时，芽伸长受土霉素抑制，生物质炭促进芽伸长并缓解土霉素毒性。

土壤中施入生物质炭时，土霉素浓度与小白菜种子芽伸长抑制率之间具显著相关性(P<0.05)，回归方程如表2所示。在土霉素胁迫下，土壤中甘蔗渣炭除了炭土比0.1%以外，种子芽的IC50值均大于不加炭的IC50值且变化幅度较小，说明甘蔗渣炭对种子芽伸长具有轻微促进作用。木薯渣炭也呈现相似趋势，炭土比为0.1%时种子IC50值较小，炭土比为0.5%和1.0%时IC50值大幅增大，说明木薯渣炭促进效应明显。土壤中添加菠萝渣炭，种子芽伸长的IC50值随炭土比的增大而增大且变化幅度较小。对比3种生物质炭对土霉素胁迫下种子芽伸长的影响效果，木薯渣炭效果最优。

综上所述：

(1) 小白菜种子萌发的发芽率受土霉素的影响较小，施加生物质炭则可促进种子萌发。土霉素对小白菜种子根的抑制作用较芽明显。小白菜对土霉素的敏感顺序依次为根伸长>芽伸长>发芽率，根伸长可作为反映土壤被土霉素污染状况的敏感指标。

(2) 小白菜根及芽伸长抑制率与土壤中土霉素浓度呈线性关系。低浓度土霉素对种子根及芽伸长起促进作用；高浓度土霉素胁迫下，种子根及芽伸长受抑制。

(3) 3种生物质炭对小白菜种子根及芽伸长起促进作用。根及芽伸长促进效果总体呈现：木薯渣炭>菠萝渣炭>甘蔗渣炭。生物质炭可缓解土霉素毒性作用。随着炭土比的增加，小白菜种子根伸长的IC50随之增大，芽伸长的IC50值亦总体增大。

(4) 生物质炭和低浓度土霉素共存时可促进小白菜根及芽伸长，但与高浓度土霉素共存时呈拮抗效应，影响种子萌发。生物质炭对高浓度土霉素毒性有缓解作用。

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◆

EffectsofBiocharonSeedGerminationofCabbageundertheStressofOxytetracycline

Ma Ruiyang1, Yan Congcong1, Fu Bomin1, Yu Huamei1, Ge Chengjun1,2,*

1. College of Environment and Plant Protection, Hainan University, Haikou 570228, China2. College of Life Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China

10.7524/AJE.1673-5897.20170115006

2017-01-15录用日期2017-03-20

1673-5897(2017)3-564-08

X171.5

A

葛成军(1977—)，男，江西南昌人，博士，教授，主要研究方向为污染物环境行为。

表2生物质炭对土霉素胁迫下小白菜种子芽伸长影响的回归方程和IC50
Table 2 Regression equation and the IC50for seed shoot elongation under the effect of the biochar and oxytetracycline stress

炭土比Carbonratio拟合方程FittingequationR2PIC50/(mg·kg-1)不加炭Nobiocharadded0%SI=2E-06x2-1E-05x-0．04310．9633<0．01523．61甘蔗渣炭Bagassebiochar0．1%SI=3E-06x2-0．0003x-0．07540．9158<0．01490．790．5%SI=3E-06x2-0．0005x-0．11120．949<0．01542．331．0%SI=3E-06x2-0．0004x-0．23770．9201<0．01567．01木薯渣炭Cassavabiochar0．1%SI=3E-06x2-0．0004x-0．08870．9862<0．01514．640．5%SI=1E-06x2-0．0003x-0．22430．8768<0．051014．181．0%SI=7E-07x2+0．0001x-0．41890．8015<0．051076．53菠萝渣炭Pineapplebiochar0．1%SI=2E-06x2-8E-06x-0．12090．876<0．05559．190．5%SI=2E-06x2+0．0003x-0．27920．9366<0．01553．671．0%SI=3E-06x2-0．0005x-0．35320．9695<0．01623．10

注：SI为芽伸长抑制率；x为土霉素的浓度。

Note: SI is shoot elongation inhibition rate; x is oxytetracycline concentration.

国家自然科学基金项目(21467008)；国家自然科学基金项目(21367011)；海南省自然科学基金项目(413123)；中西部高校提升综合实力工作资金项目(ZXBJH-XK004, ZXBJH-XK005, MWECSP-RT08)；海南省研究生创新科研课题项目(Hys2016-22)

马瑞阳(1993-)，女，硕士研究生，研究方向为污染物环境行为，E-mail: 15692557581@163.com；

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: gcj3007@163.com

马瑞阳, 闫聪聪, 符博敏, 等. 生物质炭对土霉素胁迫下小白菜种子萌发的影响[J]. 生态毒理学报，2017, 12(3): 564-571

Ma R Y, Yan C C, Fu B M, et al. Effects of biochar on seed germination of cabbage under the stress of oxytetracycline [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(3): 564-571 (in Chinese)