双低油菜籽不同添加水平对牦牛空肠和盲肠食糜消化酶活性的影响

范小红， 郝力壮， 刘书杰， 柴沙驼， 牛建章，张晓卫， 王 迅， 孙 璐， 赵索南， 张成图， 李吉业

（1.省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室，青海省高原放牧家畜动物营养与饲料科学重点实验室，青海西宁 810016；2.青海高原牦牛研究中心，青海西宁 810016；3.青海大学畜牧兽医科学院，青海西宁，810016；4.海北州畜牧兽医科学研究所,青海海晏 810200；5.西宁市畜牧兽医站，青海西宁 810016；6.青海省大通种牛场，青海大通县，810102）

双低油菜籽不同添加水平对牦牛空肠和盲肠食糜消化酶活性的影响

范小红1，2，3*， 郝力壮1，2，3*， 刘书杰1，2，3*， 柴沙驼1，2，3， 牛建章1，2，3，张晓卫1，2，3， 王 迅1，2，3， 孙 璐1，2，3， 赵索南4， 张成图5， 李吉业6

（1.省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室，青海省高原放牧家畜动物营养与饲料科学重点实验室，青海西宁 810016；2.青海高原牦牛研究中心，青海西宁 810016；3.青海大学畜牧兽医科学院，青海西宁，810016；4.海北州畜牧兽医科学研究所,青海海晏 810200；5.西宁市畜牧兽医站，青海西宁 810016；6.青海省大通种牛场，青海大通县，810102）

为揭示牦牛日粮中双低油菜籽不同添加量对其空肠和盲肠食糜消化酶活性的影响及各酶活性间的关系，试验采用年龄、性别和体况基本一致的生长期健康阉牦牛18头，随机分为3组，分别饲喂添加油菜籽为21.75%（H组）、10%（M组）和0%（L组）的精饲料日粮，每个处理组6个重复，每个重复单头饲喂。试验结果表明：（1）不同油菜籽添加量对空肠食糜淀粉酶（AMS）、脂肪酶（LPS）和羧甲基纤维素酶（CLS）活性无显著性影响（P＞0.05），胰蛋白酶（TRS）活性H组显著高于M组和L组（P＜0.05），H组较M组及L组分别高51.30%、45.08%；（2）不同油菜籽添加量盲肠食糜消化酶活性H组的AMS和CLS活性显著高于M组和L组 （P＜0.05），AMS活性分别较M组和L组高75.26%、72.22%，CLS活性分别较M组和L组高68.73%、52.48%；（3）由相关性可知，空肠食糜消化酶活性中，AMS与CLS活性极显著正相关（P ＜ 0.01）；盲肠食糜消化酶活性中，AMS、LPS、TRS、CLS 间均呈极显著正相关（P ＜ 0.01）。

油菜籽；牦牛；食糜酶活；淀粉酶；脂肪酶；纤维素酶

牦牛是高寒草地重要的生态组成部分，因牦 牛对寒冷、氧气缺乏、草料匮乏等恶劣环境的适应能力较强而成为高寒牧区中不可替代的生产生活资料和支柱产业（郭宪，2009）。反刍动物日粮中添加油脂既可以解决反刍家畜能量和蛋白质缺乏，提高日粮能量浓度和动物生产性能，调控畜产品品质，又可降低甲烷排放和改善肉质品质。Delbecch等（2001）在奶牛日粮中添加4.8%保护性双低油菜籽发现，乳中饱和脂肪酸（C8-C16）及油酸（C18∶1）均显著减少；Wiesen 等（1990）研究油菜籽添加水平分别为0%、7%和14%的三种日粮发现，高油菜籽添加水平使得乳中不饱和脂肪酸（C18∶1 和 C18∶2） 显著升高；Mckinnon 等（1977）用双低油菜籽粕含量为4%～30%的日粮对犊牛进行饲喂试验，表明双低油菜籽粕添加量为21.7%时，犊牛的日增重及消化率最高。然而也有试验表明，菜籽粕添加过量会对试验动物产生不利影响，林莉（2010）采用体外产气法研究日粮中添加油菜籽对牦牛瘤胃发酵的影响发现，0%、5%、10%、15%、20%、25%的油菜籽添加水平对干物质降解率、48 h产气量有负影响。目前关于脂类营养物质对牦牛消化道酶活性的营养调控研究较少。刘慧丽（2017）研究油菜籽不同添加量对牦牛瘤胃食糜和十二指肠食糜中消化酶活性的影响，由此，本试验研究油菜籽不同添加量对牦牛空肠食糜和盲肠食糜中消化酶活性的影响以及各不同酶活性之间的相关性，旨在补充牦牛全消化道食糜中消化酶活性参数，为脂类在牦牛补饲饲养中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验地点 试验在青海省高原放牧家畜营养与生态国家重点实验室培育基地，青海省高原放牧家畜动物营养与饲料科学重点实验室进行。试验基地位于 E101.75°，N36.69°，平均海拔 2275 m，年平均气温较低，属于高原高山寒温性气候；试验期间，基地内平均温度3.8℃，最高6.5℃，最低可达-10℃，相对湿度保持在68%以上。

1.2 试验日粮 参考胡令浩（1999）《牦牛营养研究论文集》和《肉牛饲养标准》（NY/T 815—2004）（2004），以150 kg牦牛日增重500 g所需的能量和蛋白质为基础设计牦牛日粮配方 （已提交专利申请，编号：KHP161110881.4）。以青海地区常用的玉米、小麦麸、玉米麸、油菜籽等主要原料为精料，以颗粒料形式进行饲喂，燕麦青干草为粗料，按精粗比 7∶3 饲喂，其中高（H）、中（M）和低（L）三个处理组精料中油菜籽的添加量分别为21.75%、10%和0%。

1.3 试验设计和饲养管理 试验选取18头健康、体况相近、体重为（127.62±16.93）kg 的 3 岁青海阉牦牛，随机分为3个处理组，进行全舍饲试验，每个处理组6个重复，每个重复单头饲喂。预饲期40 d，正式期180 d。每天分两次进行饲喂（08∶00 和 18∶00），日采食量定量 4 kg，先粗料后精料，自由饮水。牛舍的消毒程序按正规牛场的标准进行，每天打扫一次卫生，每周消毒一次。每天注意观察试验牛的精神状态，如果发现病牛，及时进行治疗。

1.4 样品采集 饲喂试验结束后全部屠宰，屠宰过程参考袁建新（1997）的方法。取每个处理空肠和盲肠部分食糜，装于50 mL离心管中，对样品进行汇总，液氮保存。用于测定空肠和盲肠中淀粉酶（AMS）、胰蛋白酶（TRS）、脂肪酶（LPS）和羧甲基纤维素酶（CLS）活性。

1.5 测定指标及方法 AMS、TRS、LPS活性的测定参考陈鼎（2008）的方法进行，CLS活性的测定采用南京建成生化工程研究所生产的试剂盒 （货号：A137）进行测定。

1.5.1 AMS的测定 AMS能水解淀粉生成葡萄糖、麦芽糖及糊精，在底物浓度已知并且过量的情况下，加入碘液与未水解的淀粉结合生成蓝色复合物，根据蓝色的深浅可推算出水解的淀粉酶量，从而计算出AMS的活力。将每毫克蛋白质在37℃与底物作用30 min，水解10 mg淀粉定义为一个酶活力单位。

1.5.2 LPS的测定 37℃条件下，每克蛋白质在本反应体系中与底物反应1 min，每消耗1 μmol底物为一个酶活力单位。甘油三脂和水制成的乳胶，因其胶束对入射光的吸收及散射而具有乳浊性状，胶束中的甘油三脂在LPS的作用下水解使胶束分裂，浊度或光散射因此降低，降低的速率与LPS活力有关。

1.5.3 TRS的测定 pH 8.0，37℃条件下，每毫克蛋白质含有的TRS每分钟使吸光度变化0.003即为一个酶活力单位。TRS催化水解底物精氨酸乙酯的酯链，使其在253 nm处吸光度值升高，根据吸光度的变化计算出酶的活力。

1.5.4 CLS的测定 每毫克蛋白质每分钟催化产生1 μg葡萄糖定义为一个酶活力单位。采用3.5-二硝基水杨酸法测定纤维素酶催化纤维素降解产生还原糖的含量。

1.6 数据统计分析 用Excel 2007对数据进行初步处理。通过SPSS19.0的ANOVA过程进行单因素方差分析检测主要效果的统计学显著性，由Duncan’s进行多重比较，P＜0.05作为差异显著的判断标准，酶活性之间的相关系数用Spearman分析。

2 结果与分析

2.1 双低油菜籽不同添加量对牦牛空肠食糜消化酶活性的影响 由表1可知，H组的TRS活性显著高于M组和L组 （P＜0.05），H组较M组及L组分别高51.30%和45.08%，三个处理组的空肠食糜 AMS、LPS和 CLS活性差异均不显著 （P＞0.05），而M组的AMS、LPS和CLS活性均高于H组和L组；AMS较H组和L组分别高 9.58%、25.75%，LPS较 H组和 L组分别高0.93%、53.63%，CLS较 H组和 L组分别高 1.78%、42.21%。因此，从空肠食糜酶活性显著分析来看，M组为较适宜添加量。

表1 双低油菜籽不同添加量对牦牛空肠食糜消化酶活的影响 U/mL

2.2 双低油菜籽不同添加量对牦牛盲肠食糜酶活的影响 由表2可知，H组的AMS和CLS活性显著高于M组和L组（P＜0.05），AMS活性分别较M组和L组高75.26%、72.22%，CLS活性分别较M组和L组高68.73%、52.48%；而三个处理组LPS和TRS活性均差异不显著（P＞0.05），且M组活性较H组和L组的活性低，AMS活性分别较H组和L组低57.03%、0.78%，CLS活性分别较H组和L组低25.79%、13.61%。

表2 双低油菜籽不同添加量对牦牛盲肠食糜消化酶活的影响U/mL

2.3 食糜消化酶活性的相关性 由表3、表4可知，空肠食糜消化酶活性中，AMS与CLS活性极显著正相关（P＜0.01），与LPS、TRS活性没有显著相关性（P ＞ 0.05），CLS、LPS、TRS 之间亦无显著相关性 （P＞0.05）。盲肠食糜消化酶活性中，AMS与、LPS、TRS、CLS 均呈极显著正相关 （P ＜ 0.01），LPS与LPS、CLS也呈极显著正相关（P＜0.01）。

表4 盲肠食糜中酶活性之间的相关性

表3 空肠食糜中酶活性之间的相关性

3 讨论

3.1 双低油菜籽不同添加水平对食糜消化酶活性的影响 反刍动物的消化器官发育及消化酶的分泌与活性可直接影响日粮在消化道内的消化，且动物对日粮中营养物质消化、吸收和利用的程度可由消化酶的分布情况及活力水平间接反映出来。动物体内消化道酶主要有AMS、TRS、LPS等，可以补充动物体内内源性消化道酶的不足。

AMS活性在不同部位各不相同，AMS对淀粉在消化道的消化起着十分重要的作用，Keys等（1974）报道，日粮养分在消化道各部位的消化率有很大差异。本试验结果表明，不同双低油菜籽添加水平空肠AMS活性差异不显著 （P＞0.05），但M组的AMS活性最高；盲肠AMS活性H组显著高于M组和L组（P＜0.05），且不同处理水平AMS活性盲肠高于空肠。刘月琴（2004）研究日粮类型对小尾寒羊小肠消化酶活性影响时发现，空肠内容物中AMS活性最高；孙娟等（2015）研究表明，AMS活性在十二指肠中最低，空肠中最高，与本试验结果不同。这可能由于添加双低油菜籽使得盲肠段 pH最接近AMS活性最佳 pH （6.9），AMS活性最高；而空肠段pH或偏高或偏低，从而AMS活性较差。

不同双低油菜籽添加水平对LPS活性有一定影响，但对于不同部位影响不同。反刍动物采食的脂肪在瘤胃内被分解为甘油和脂肪酸，绝大部分脂肪酸被氢化后进入后消化道。本试验结果表明，不同双低油菜籽处理水平空肠和盲肠中LPS活性均差异不显著（P＞0.05），但随着不同油菜籽添加量逐渐增加，空肠和盲肠食糜LPS活性依次升高，且空肠LPS活性较盲肠高。Brannon（1990）研究表明，日粮中的油脂增加LPS活性增加，与本试验结果一致，说明LPS活性会随日粮中甘油三酯增加而升高；刘月琴（2004）也发现，空肠中LPS活性较高，与本试验结果一致。此外，Romo等（2000）指出，促胰液素、游离脂肪酸等也能增加LPS的活性。

TRS的来源主要是胰腺的分泌，各种酶活性均与不同部位有密切的关系，所以不同部位采集的肠道内容物中酶的活性均不同。空肠是日粮中营养物质主要的消化位点，扬子江（2009）试验结果表明，羔羊出生时空肠内TRS活性较高。本试验结果表明，空肠H组的TRS活性显著高于M组和L组（P＜0.05）；盲肠中TRS活性差异不显著（P＞0.05）；但空肠与盲肠H组的TRS活性均较M组与L组高，M组的TRS活性则最低。这可能是由于反刍动物的胰腺反应很难预测，Johannes等（2011）研究表明，在反刍动物中营养物质和激素之间存在复杂的相互作用。张海涛（2009）指出，可能是由于机体自身分泌的TRS、肽酶和脱氨酶可分解蛋白质。

反刍动物对纤维物质的降解主要靠瘤胃微生物分泌的纤维物质降解酶，其中羧甲基纤维素酶活性能反映瘤胃对纤维物质的降解能力。本试验结果表明，不同添加水平下的空肠CLS活性差异不显著，盲肠CLS活性H组显著高于M组和L组（P＜0.05），随着双低油菜籽添加水平的增加，空肠CLS活性呈先升后降的趋势，推测21.75%的油菜籽会抑制纤维分解菌的活性；盲肠CLS活性则呈先降后升趋势，可能是由于消化道后段，其抑制纤维分解菌的能力下降。研究表明，当脂肪超过干物质的2%～3%或不饱和度增加就会抑制纤维分解菌的活动；CLS的活性大小与纤维分解菌的数量直接相关（曹秀青等，2011；王贞贞，2008）；CLS活性还与动物种类，油脂添加类型有关 （张宁，2008）。此外，消化道酶的活性还受温度、pH、激活剂和抑制剂等多种因素的影响，每一种酶都有与其相适应的环境和条件。3.2 食糜消化酶活性的相关性 空肠食糜中，AMS与CLS活性极显著正相关（P＜0.01）；盲肠食糜消化酶活性中，AMS、LPS、TRS、CLS 活性均呈极显著正相关（P ＜ 0.01）。 Moharrery等（2014）研究表明，TRS活性和AMS活性之间呈正相关，与本试验结果不一致，可能是由于胰腺外分泌含有AMS和TRS，根据酶的“平行”分泌，空肠食糜酶活性之间的相互关系是非常复杂的，因为蛋白质水解失活以外的因素，也被假设是通过小肠期间胰腺酶活性选择性变化的原因。

4 结论

日粮精粗比为7∶3时，精料补充料中添加10%油菜籽，空肠AMS和CLS活性较其他两组高，添加21.75%油菜籽时，LPS和TRS活性较高。日粮中添加油菜籽后，空肠AMS与CLS活性极显著正相关；盲肠 AMS 与、LPS、TRS、CLS 均呈极显著正相关。因此，在牦牛补饲饲养中，建议可适量添加熟化油菜籽以提高消化酶活性，有关具体添加量，有待进一步研究。

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The experiment was conducted to study the effect of different additions of canola rapeseed on the activity of digestive enzymes in jejunum and cecal chyme and the relationship among the activities of each enzyme.A total of 18 healthy castrated yaks with the same age，gender and body condition were randomly divided into 3 groups and fed with rapeseed for 21.75% （H）， 10% （M）and 0% （L） of the concentrate feed，six treatments were repeated for each treatment group，and each repeat was fed alone.The results showed that：（1）There was no significant effect of different rapeseed additions on the activities of amylase （AMS），lipase （LPS）and cellulase （CLS） in jejunum （P ＞ 0.05）.The trypsin （TRS） activity in H group was significantly higher 51.30%，45.08%than that in M group and L group.（2）The activities of AMS and CLS in H group were significantly higher than those in M and L groups （P ＜ 0.05）.The AMS activity in H group was higher 75.26%and 72.22%than that of M group and L group，CLS activity was higher 68.73%and 52.48%than that in M group and L group.（3）There was a significant positive correlation between AMS and CLS activities in the digestive enzyme activity of jejunum chyme（P ＜ 0.01）；and there was a significant positive correlation between AMS，LPS，TRS and CLS in the digestive enzyme activity of cecal chyme （P ＜ 0.01）.

rapeseed；yak；chymotrypsin；amylase；lipase；cellulase

S816.7

A

1004-3314（2017）18-0015-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20171804

国家自然科学基金（31660673）；国家重点研发计划（2016YFD0500504-4）；国家重点基础研究发展计划（973项目）（2012CB722906）；国家国际科技合作专项项目（2015DFG31870）；青海省重大科技平台建设项目（2013-Z-Y03）

*通讯作者