miRNA499在小细胞肺癌患者血清和肺泡灌洗液中的表达分析

周凤丽，冯定云，邹小玲，吴少珠，刘燕飞 （中山大学附属第三医院呼吸科，广东广州510630）

miRNA499在小细胞肺癌患者血清和肺泡灌洗液中的表达分析

周凤丽，冯定云，邹小玲，吴少珠，刘燕飞 （中山大学附属第三医院呼吸科，广东广州510630）

目的：探讨miRNA499能否作为早期诊断小细胞肺癌（SCLC）的分子标志物．方法：收集26例SCLC患者的血清、肺泡灌洗液以及20例非肺癌呼吸疾病患者的血清，检测其RNA浓度、RT逆转录后cDNA的浓度；同时检测SCLC患者血清以及肺泡灌洗液中miRNA499的相对表达．结果：①SCLC患者血清和肺泡灌洗液中miRNA499的表达水平均明显升高；②非肺癌呼吸疾病患者几乎不表达或者不表达 miR⁃NA499．结论：miRNA499的检测有可能作为临床SCLC的早期诊断指标和基因治疗靶点．

肺癌；miRNA499；分子标志物

0 引言

肺癌已成为人类因癌症死亡的主要原因［1－2］．肺癌分为小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小细胞肺癌（non⁃small cell lung cancer， NSCLC），其中15%～20%为SCLC．SCLC血行转移早，手术机会少，5年生存率不足10%［2］．因此早期诊断才是临床有效治疗SCLC的关键．目前对NSCLC分子标志物的研究较多，SCLC是否也有相应的早期诊断的分子标志物呢？MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小为20～25个核苷酸．miRNAs已在许多细胞代谢过程中发挥重要作用，如发育、增殖、分化和凋亡．循环miRNAs已被提议作为新兴的生物标志物，如癌症、糖尿病和心血管疾病，包括急性心肌梗死（acute myocardial infarction， AMI）［3］．

目前研究证明miRNAs在癌症发生发展中发挥重要的生物学效应，如miRNA499的表达与肝癌密切相关［4－5］．本研究通过检测SCLC患者血清和肺泡灌洗液中miRNA499的表达，明确miRNA499能否作为早期诊断SCLC的分子标志物．

1 资料和方法

1．1 一般资料 收集中山大学附属第三医院2015－01／2016－05住院或门诊的SCLC患者26例，其中男14例，女12例，中位年龄45（30～65）岁，未经任何手术治疗以及放、化疗，均经病理确诊．对照组为非肺癌呼吸疾病患者20例，均为同期中山大学附属第三医院接受支气管镜检查的患者．

1．2 标本采集 血清采集使用一次性真空采血管（惰性分离胶促凝管），采集受试者外周血标本5 mL，分离血清，吸取1 mL血清于1．5 mL离心管中，将血清3000 g离心10 min，后将上清液置入新的离心管中，置－80℃低温保存．肺泡灌洗液收集使用olympus BF⁃1T260电子支气管镜，SCLC患者取荷瘤肺叶灌洗，对照组均取右中叶灌洗，以37℃的无菌生理盐水150 mL灌洗，回收灌洗液，取样 10 mL，3000 g，离心5 min、加入250 μL生理盐水保存．

1．3 血清及肺泡灌洗液中RNA的提取与RT⁃PCR

采用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，按照常规Trizol提取操作．血清取 250 μL，加入 1 mL Trizol．生理盐水溶解的肺泡灌洗液沉淀上清250 μL，加入1 mL Tr⁃izol，提取方法按照常规Trizol提取．miRNA499上游引物和下游引物序列均由广州锐博公司提供（该公司陈述未公开上述引物，需要者可以向其索取）．检测按实验室常规方法进行PCR扩增．全部取2 μL的cDNA 用于 RT 反应条件：42℃，15 min，85℃，1 min．试剂购自 Promega公司，定量 PCR采用的体系为：25XdNTPs 2 μL，10Xbuffer 5 μL，上下游引物各10 pmol，Pfu 酶 0．5 μL，浓度参见试剂盒说明书，模板2 μL，加三蒸水至总体积 50 μL，该试剂盒为 Super⁃Real PreMix Plus（SYBR Green），购自北京天根（FP205⁃01）；扩增条件为：预变性 94℃ 5 min，进入循环，变性 94℃ 15 min，退火60℃ 20 s，延伸72℃ 10 s，40个循环后，72℃延伸5 min相对拷贝数比值计算，依据2△CT法计算各组miR499的相对表达量［10］．

1．4 统计学处理 采用SPSS16．0软件进行数据分析．正态分布计量资料以±s表示，采用 t检验，P＜0．05表示差异有统计学意义．

2 结果

2．1 两组患者血清和肺泡灌洗液中RNA浓度测定

本研究对RNA进行浓度测定和A260／280比值测定．正常肺泡盥洗液和血清中RNA含量比肺癌患者少很多，其原因不详．但是其提取RNA的A260／280比值均可以满足下一步实验的需要（表1）．

表1 血清和肺泡灌洗液总RNA浓度和A260／280比值对照表

2．2 miRNA499 PCR溶解温度曲线 本研究将miRNA499a的引物进行PCR，发现引物具备特异性，仅有单一的峰值，说明miRNA499的引物具有特异性（图 1）．

图1 miR499PCR温度溶解曲线

2．3 肺癌患者血清和肺泡灌洗液以及非肺癌呼吸疾病患者血清的PCR扩增曲线 本研究对肺癌患者血清、肺泡灌洗液以及非肺癌呼吸疾病患者血清进行PCR检测．结果显示，曲线呈“倒S形”，提示PCR扩增是标准的扩增曲线，说明miRNA499PCR扩增过程是特异性指数扩增（图2～4）．

图2 血清标本的扩增曲线

图3 肺泡灌洗液的扩增曲线

图4 阴性对照的扩增曲线

2．4 两组患者血清和肺泡灌洗液中miRNA499表达量比较 对肺癌患者和非肺癌呼吸疾病患者（对照组）血清进行取样250 μL，提取总RNA；同样，对生理盐水溶解的肺泡灌洗液标本，也吸取250 μL．值得注意的是，肺泡灌洗液最初来自临床，体积是10 mL，对其高速离心后，丢弃上清，加250 μL生理盐水溶解．然后，取总RNA，该总RNA血清和灌洗液中包含了总miRNA．最后，用20 μL无核酸酶的水溶解，取2 μL反转录成 cDNA，PCR 上样量 2 μL．qPCR 相对定量的依据原理是：一定血清或肺泡灌洗液体积内miR499拷贝数的变化．其原因如下：①没有合适的恒定表达的内参；②检测样品非肿瘤组织，因为血清或灌洗液中即使有U6，无法分辨是肿瘤来源的还是免疫细胞来源的．通过对血清和灌洗液的PCR结果进行分析，纵坐标表示倍数变化．具体计算方式：患者样品PCR扩增的Ct值减去对照组Ct值，公式：2＾－（Ct患者－Ct对照），Ct表示定量 PCR 仪上扩增曲线Ct值．其结果提示肺癌患者无论在血清还是肺泡灌洗液，其 miR499 表达显著增高（P＜0．01，图 5）．

图5 血清及肺泡灌洗液中miRNA499的相对表达图

3 讨论

目前，NSCLC，尤其是肺腺癌的分子标志物和靶向治疗研究有了很多新的进展，但SCLC的分子标志物和靶向治疗相关研究均未见新的报道．

miRNAs是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小为20～25个核苷酸．最近的研究表明miRNA参与各种各样的调节途径，其中与肿瘤相关的调节是参与细胞增殖和凋亡［6－7］．miRNAs通过与其下游靶基因的 mRNA 的 3，UTR非翻译区域相结合进行调节，具体作用方式取决于miRNAs与其靶基因mRNA匹配程度，近乎完全匹配抑制靶基因mRNA的转录，匹配程度较差抑制翻译水平的蛋白表达．大约有30%的人类基因mR⁃NA受miRNAs的调控，在多种人类肿瘤组织中可检测到 miRNAs的异常表达［8－10］，而 miRNA499 的高表达及基因的多态性也与肝癌［11］、喉癌［12］、口腔癌［13］和肺癌［14］密切相关．

在肺癌的发生发展过程中，miRNAs发挥着复杂的生物学功能，即可作为原癌基因促肺癌发生，亦可调节相关信号通路．研究显示部分miRNAs对肺癌的相关癌基因进行调控，与肺癌的发生以及临床预后有着密切关系．具体涉及与肺癌的转移相关［15－16］，参与诱导肺癌的细胞凋亡过程［17］，与肺癌的早期诊断和病理分型相关［18－19］，与肺癌细胞对化疗药物的敏感性相关［20］，以及作为评估预后的价值［21］等．Meta 分析显示miRNA499可能是肺癌的潜在生物标志物［14］，但具体与SCLC的关系尚未见明确的报道．

本研究对非肺癌呼吸疾病患者血清及肺癌患者血清及肺泡灌洗液中RNA浓度测定，发现总RNA的变化有着显著变化．虽然这一检测结果未必和miR⁃NA499有着直接关系．但是在研究肺癌患者体液中miRNA的表达变化时，应当给予重视，为什么患者血清中RNA的提取总量升高，有待进一步研究．或许预示着更多其他非miRNA499的 miRNAs、环状 RNA、非编码RNA的增加，目前我们尚不清楚其背后机制．在检测RT逆转录后，对照组与SCLC患者血清及肺泡灌洗液中的cDNA进行qPCR检测，结果显示：SCLC患者血清和肺泡灌洗液中miRNA499的表达水平都明显升高，差异有统计学意义（P＜0．05）．以这种差异表达情况为基础，我们期待更进一步的研究，比如miRNA499可能作为癌基因参与SCLC患者肿瘤细胞的生长和转移；miRNA499能否作为SCLC基因治疗的一个靶点等．

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Expression of miRNA499 in serum and bron⁃choalveolar lavage fluid of patients with small cell lung cancer

ZHOU Feng⁃Li， FENG Ding⁃Yun， ZOU Xiao⁃Ling， WU Shao⁃Zhu， LIU Yan⁃Fei
Department of Respiratory Medicine， The Third Affiliated Hospi⁃tal， Sun Yat⁃sen University， Guangzhou 510630， China

AIM： To determine whether miRNA499 can be used as a molecular marker for early diagnosis of small cell lung cancer SCLC．METHODS： The serum and bronchoalveolar lavage fluid from 26 patients with SCLC and serum of 20 cancer⁃free controls with respiratory disease were collected．The RNA concentration and the cDNA concentration after reverse transcription were detec⁃ted．The expression of miRNA499 in serum and bronchoalveolar lavage fluid of patients with SCLC were also detected．RE⁃SULTS：①The expression levels of miRNA499 in serum and bronchoalveolar lavage fluid of patients with SCLC were signifi⁃cantly increased．②The miRNA499 gene was almost not expressed or not expressed in small cell lung cancer⁃free controls with respir⁃atory disease．CONCLUSION： The miRNA499 may be used as the early diagnosis index and the target of gene therapy for SCLC．

lung neoplasms； miRNA499； molecular markers

R734．2

A

2095⁃6894（2017）09⁃39⁃03

2017－05－04；接受日期：2017－05－20

广东省科技计划项目（2014A020212531）

周凤丽．博士，副主任医师，硕导．E⁃mail：zhoufenglizfl＠126．com