肝硬化患者继发急性肾损伤的实验室评价*

葛斌，刘艳，徐革，吴多江，秦亚录，俸家富

(1.西南医科大学医学检验系，四川泸州 646000；2.郫都区人民医院检验科，成都 611730；3.绵阳市中心医院检验科，四川绵阳 621000)

·临床实验研究·

肝硬化患者继发急性肾损伤的实验室评价*

葛斌1,2，刘艳2，徐革2，吴多江2，秦亚录2，俸家富1,3

(1.西南医科大学医学检验系，四川泸州 646000；2.郫都区人民医院检验科，成都 611730；3.绵阳市中心医院检验科，四川绵阳 621000)

目的探讨中性粒细胞相关载脂蛋白(NGAL)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(CysC)和肌酐(Cr)检测在肝硬化患者继发急性肾损伤(AKI)中的应用价值。方法选取2015年1月至 2016年8月绵阳市中心医院符合入选标准的肝硬化继发AKI患者207例(AKI组)、单纯肝硬化患者260例(LC组)和健康者106例(HC组)，统计分析3组及不同分期AKI患者血清NGAL(sNGAL)、尿NGAL(uNGAL)、血清CysC和血清Cr(sCr)及其估算肾小球滤过率(eGFR：CysC-eGFR/c-aGFR)水平的差异性和相关性，并评估其对肝硬化继发AKI的诊断性能。结果AKI组sNGAL、uNGAL、CysC和sCr水平高于LC组和HC组(P<0.01)，CysC-eGFR和c-aGFR则相反，低于LC组和HC组(P<0.01)。随着AKI分期递增，患者sNGAL、uNGAL、CysC和sCr水平逐渐升高(P<0.01)，c-aGFR和CysC-eGFR水平逐渐降低(P<0.01)。相关分析显示，sNGAL、uNGAL和CysC水平与sCr(r=0.662、0.672、0.726，P<0.01)呈正相关，与c-aGFR(r=-0.639、-0.661、-0.732，P<0.01)呈负相关；CysC-eGFR则反之，与sCr(r=-0.711，P<0.01)呈负相关，与c-aGFR(r=0.736，P<0.01)呈正相关。ROC曲线分析显示曲线下面积(AUC)以uNGAL最大(0.995)，均显著高于sNGAL、sCr、CysC、c-aGFR和CysC-eGFR(P均<0.01)；sNGAL的AUC次之，但仅高于c-aGFR和CysC-eGFR(P均<0.05)，与sCr和CysC(P均>0.05)的AUC差异无统计学意义。uNGAL和sNGAL对肝硬化继发AKI的诊断有效性分别为0.962和0.920。结论对诊断肝硬化患者发生AKI，NGAL可能优于sCr和CysC，检测uNGAL比sNGAL能提高诊断性能。

肝硬化；急性肾损伤；中性粒细胞相关载脂蛋白；半胱氨酸蛋白酶抑制剂C；肌酐

Abstract：ObjectiveTo investigate the clinical application of measurements of neutrophil gelatinase associated lipocalin in serum(sNGAL)and urine(uNGAL), cystatin C(CysC)and serum creatinine(sCr)in diagnosis of acute kidney injury(AKI)patients secondary to liver cirrhosis(LC).MethodsA total of 260 liver cirrhosis patients without AKI(LC group), 207 liver cirrhosis patients with AKI(AKI group)and 106 healthy controls(HC group)were included in the study. The levels of sNGAL, uNGAL, serum creatinine(sCr)and cystatin C(CysC)were determined, respectively. The estimated glomerular filtration rate(eGFR)were calculated base on sCr and CysC, named as c-aGFR and CysC-eGFR. The differences and correlation of each observed parameters among the various groups were statistically analyzed, and the effectiveness of these parameters as biomarkers for predicting the development of AKI in these patients with liver cirrhosis were assessed.ResultsCompared with LC group and healthy control group, the levels of sNGAL, uNGAL, sCr and CysC in AKI group were significantly increased(allP<0.01), while the levels of c-aGFR and CysC-eGFR were significantly decreased(allP<0.01). Along with the progression of AKI stages, the levels of sNGAL, uNGAL, sCr and CysC in the patients were increasing(allP<0.01), while the levels of c-aGFR and CysC-eGFR were decreasing(allP<0.01). Correlation analysis showed that the levels of sNGAL, uNGAL and CysC were positively correlated with sCr(r=0.662, 0.672, 0.726, allP<0.01)and negatively correlated with c-aGFR(r=-0.639, -0.661, -0.732, allP<0.01). On the contrary, CysC was negatively correlated with sCr(r=-0.711,P<0.01)and positively correlated with c-aGFR(r=0.736,P<0.01). ROC curve analysis showed that the area under the curve(AUC)of uNGAL was maximum(0.995)which were significantly higher than that of sNGAL, sCr, c-aGFR, CysC and CysC-eGFR(allP<0.01). The AUC of sNGAL did not present marked difference with that of sCr and CysC(P>0.05), but-was barely higher than that of c-aGFR and CysC-eGFR(P<0.05). The diagnostic effectiveness of uNGAL was maximum(0.962), followed by sNGAL(0.920).ConclusionFor diagnosis of the development of AKI in the patients with liver cirrhosis, NGAL may be more reliable marker than sCr and CysC, and the detection of uNGAL could be more effective than sNGAL for the diagnosis.

Keywords：liver cirrhosis; acute kidney injury; neutrophil gelatinase associated lipocalin; cystatin C; creatinine

急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)是失代偿期肝硬化患者出现的严重并发症之一。肝硬化患者发生AKI后，多预后不良。据文献报道，肝硬化住院患者AKI发生率高达19%～20%[1]，其中最常见的AKI类型有：肾前性氮质血症(prerenal azotemia，PRA)、肝肾综合征(hepatorenal syndrome，HRS)和急性肾小管坏死(acute tubular necrosis，ATN)，其患病率依次约为68%、25%和33%[1-2]。研究表明，肝硬化患者的病死率与肾功能损伤严重程度密切相关[3-5]。但早期肝硬化患者发生急性肾损伤症状不明显，传统血清肌酐(serum creatinine，sCr)及尿量监测常不能及时准确地反映肾脏功能的损伤[6]，导致延误诊疗。研究显示，中性粒细胞相关载脂蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(cystatin C，CysC)和/或基于CysC的估算肾小球滤过率(CysC-based estimating glomerular filtration rate，CysC-eGFR)在肾功能的评价中优于传统检测指标sCr[7-9]。本研究通过病例-对照研究，探讨血清NGAL(serum NGAL, sNGAL)、尿液NGAL(urine NGAL, uNGAL)和血清CysC及传统指标sCr在肝硬化继发AKI患者中的诊断性能。

1 材料与方法

1.1研究对象 选取 2015年1月至 2016年8月绵阳市中心医院收治的乙肝患者467例。其中肝硬化继发AKI患者207例(AKI组)，男152例，女55例，年龄26～88(61.7±13.0)岁。所有患者：(1)符合2016年APASL(Asian Pacific Association for the Study of the Liver)标准[10]；(2)排除近期服用可导致肾脏功能损害或严重心肺功能不全药物、免疫制剂及调节剂、糖皮质激素和他汀类药物等的患者；(3)排除合并原发性肾脏疾病、肿瘤、血液系统疾病、精神系统疾病、自身免疫病、糖尿病、冠心病、高血压、尿路感染等疾病或并发症的患者；(3)符合2012年改善全球肾脏病预后组织(Kidney Disease Improving Global Outcome，KDIGO)标准[6]，即患者48 h内sCr水平增加>26.5 μmol/L，或7 d 内sCr水平超过基线值的1.5倍，或每小时尿量少于0.5 mL/kg持续超过6 h。同时按此标准将该组病例再分为AKI-S1患者114例，AKI-S2患者53例，AKI-S3患者40例。此外，选取同期符合上述(1)(2)(3)标准的单纯肝硬化患者260例(肝硬化组)作为疾病对照组，其中男181例，女79例，年龄22～89(53.4±12.0)岁；选取同期肝肾功能及尿液分析等检测正常的健康者106例(对照组)作为健康对照，其中男70例，女36例，年龄24～87(46.4±11.3)岁。

1.2仪器与试剂 Hitachi LST008型全自动生化分析仪(日本Hitachi公司)；BioSystems A25型全自动特定蛋白分析仪(西班牙BioSystems公司)；CysC、NGAL和sCr检测试剂盒均购自四川迈克公司；uCr试剂盒购自重庆博士泰公司。

1.3标本采集与处理 所有肝硬化患者试验前均未采取手术治疗。继发AKI患者于未使用药物治疗前，单纯肝硬化患者及健康对照者于清晨空腹，用BD Vacutainer®SST ⅡAdvance管(含分离胶/纤维蛋白酶促凝剂)采集静脉血约5 mL，轻轻颠倒8次混匀，静置约30 min，等血块收缩后，以3 000 rpm离心15 min分离血清，在2 h内用于sNGAL、sCr和CysC测定。同期收集研究对象中段尿约10 mL，3 000 rpm离心10 min，取上清液在2 h内测定uNGAL和uCr含量。

1.4实验室检测 CysC(透射比浊法)、sNGAL/uNGAL(透射比浊法)和sCr(肌氨酸氧化酶法)均用LST008型全自动生化分析仪测定；uCr(肌氨酸氧化酶法)用A25型全自动特定蛋白分析仪测定;质控在控后方接受标本检测结果。

1.5计算eGFR 用基于中国人群开发的eGFR方程计算GFR。CysC-eGFR方程[8]是由本课题组开发的适合中国人群的CysC方程，c-aGFR方程即适合中国人的改良MDRD方程[8]。

2 结果

2.1肝硬化组、肝硬化伴AKI组和健康人对照组的主要指标检测结果 见表1。经单样本Kolmogorov-Smirnov正态性检验，sNGAL、uNGAL、sCr、CysC、c-aGFR和CysC-eGFR水平均呈非正态分布(z=1.383～6.926，P<0.05)。因此，用多个独立样本的Kruskal-Wallis非参数检验分析3组间各指标检测结果，差异均有统计学意义(χ2=323.138～388.309，P<0.01)。多重比较结果显示，AKI组sNGAL、uNGAL、sCr和CysC水平高于肝硬化组和对照组，而c-aGFR和CysC-eGFR低于肝硬化组和对照组；肝硬化组sCr、CysC、c-aGFR和CysC-eGFR水平高于对照组(z=-1.980～-3.414，P<0.05)，而两组间sNGAL和uNGAL水平则差异无统计学意义(z=-0.838和-1.208，P>0.05)。

表1 肝硬化组、肝硬化伴AKI组、健康人对照组的主要检测指标结果

注：与健康人对照组比较，a,P<0.01，b,P<0.05；与肝硬化组比较，c,P<0.01。

2.2不同分期肝硬化伴AKI患者的主要指标检测结果 207例不同分期肝硬化伴AKI患者sNGAL、uNGAL、sCr、CysC、c-aGFR和CysC-eGFR水平的比较见表2。经有序样本Jonckheere-Terpstra非参数检验，sNGAL、uNGAL、sCr和CysC水平随分期递增而上升(z=5.334～13.643，P<0.01)，而c-aGFR和CysC-eGFR水平随分期递增而下降(z=-13.689和-11.894，P<0.01)，差异均有统计学意义。两两比较结果显示，AKI-S3患者sNGAL、uNGAL、sCr、CysC(z=3.308～7.888，P<0.01)水平明显高于AKI-S2患者，而c-aGFR和CysC-eGFR(z=-8.024、-6.197，P<0.01)水平明显低于AKI-S2患者；AKI-S2患者sNGAL(z=2.570，P=0.015)、sCr(z=9.663，P<0.01)、CysC(z=2.570～9.663，P<0.05)水平明显高于AKI-S1患者，而c-aGFR和CysC-eGFR(z=-9.674、-7.866，P<0.01)水平明显低于AKI-S1患者，但uNGAL(z=1.628，P=0.115)水平与AKI-S1患者差异无统计学意义。

表2 肝硬化伴AKI组不同分期患者sNGAL和uNGAL等指标比较

注：S2与S3比较，a，P<0.01；S1与S2比较，b，P<0.05。

2.3sNGAL、uNGAL、CysC和CysC-eGFR与sCr及c-aGFR的相关性 经Spearman相关分析结果显示，sNGAL、uNGAL和CysC水平与sCr(r=0.662、0.672、0.726，P<0.01)呈正相关，与c-aGFR(r=-0.639、-0.661、-0.732，P<0.01)呈负相关，CysC-eGFR与sCr(r=-0.711，P<0.01)呈负相关，与c-aGFR(r=0.736，P<0.01)呈正相关。

2.4各指标诊断肝硬化伴AKI的ROC曲线 见图1。各指标诊断肝硬化患者发生AKI的性能见表3。

sNGAL、uNGAL、CysC、sCr、CysC-eGFR及c-aGFR的最佳判断界值(YI最大)分别为109 μg/L、41 μg/gCr、76.8 μmol/L、1.24 mg/L、96.1 mL/min/1.73 m2和60.2 mL/min/1.73 m2时，uNGAL诊断性能最大(YI=0.962)，其次为sNGAL(YI=0.920)。其中uNGAL的AUC均高于sNGAL、sCr、CysC、c-aGFR和CysC-eGFR(z=2.723、4.191、4.486、3.111、3.445，P<0.01)；sNGAL的AUC次之，但仅高于c-aGFR和CysC-eGFR(z=2.366、2.280，P<0.05)，与sCr和CysC(z=1.713、1.924，P>0.05)的AUC差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 各指标诊断肝硬化患者发生AKI的性能

图1 sNGAL、uNGAL和CysC等指标的曲线下面积比较

3 讨论

肾功能不全严重影响肝硬化的自然演变。如果肾功能不全得以早期诊断，并积极采取干预措施，可能改善肝硬化患者的治疗和预后[11]。有关AKI诊断先后提出了3个标准——RIFLE 标准、AKIN标准和KDIGO标准，且均已运用在肾脏病和重症监护病房的临床实践中，但这些标准能否改善肝硬化患者继发AKI的诊断，尚需进一步研究。因为ADQI工作组(2013)和KIDGO均指出：并没有支持某个或某几个标志物作为AKI诊断指标的临床证据。

在过去十年中，在肾损伤的各种生物标志物评估中，NGAL是一种最有前途的和研究最多的生物标志物。NGAL作为脂质蛋白超家族成员，共价结合在中性粒细胞明胶酶上，存在3种不同分子结构，相对分子质量(Mr)分别为25 000、45 000及135 000[12]，高度表达于损伤的肾小管中。NGAL早期诊断肝硬化AKI的机制可能是：当肾小管上皮细胞受到损伤、缺血等刺激因素后，NGAL表达上调，被早期的原始肾上皮细胞摄取，通过介导铁的转运促使原始肾上皮细胞的成熟[13]。在AKI-S1期，NGAL水平已经明显升高，而sCr还处于正常水平，这是因为人体肾脏代偿能力强，当肾脏损伤较轻时一般人不适感觉不明显，当临床症状明显，其实肾脏损伤已经较严重，此时sCr才明显上升[14]。

本研究发现，sNGAL和uNGAL水平，与HC组相比时，在LC组和AKI组均有升高，但在AKI组中，二者升高水平明显高于LC组和HC组，且随着AKI分期增加(即肾损伤程度加重)而进一步升高。此外，在肝硬化患者中，sNGAL和uNGAL均与sCr呈正相关，与c-aGFR呈负相关。说明血清和尿液NGAL检测可用作肝硬化患者发生AKI时的诊断指标，能反映患者肾功能损伤的严重程度。相比而言，uNGAL在诊断肝硬化伴AKI时的ROC曲线下面积、敏感性和特异性，均明显高于包括sNGAL在内的其他5个观察指标，说明其诊断性能不仅优于血清Cr和CysC及eGFR，还略胜于血清NGAL。因此，尿NGAL被认为是肝硬化患者AKI独立的早期预测因子，不仅能鉴别诊断肝硬化患者AKI的分型，而且有助于肝硬化患者住院时的风险分层管理[15-18]。

CysC是FDA 2002年向全球推荐使用的内源性肾功能标志物。它是一种由有核细胞合成的内源性的半胱氨酸蛋白酶抑制因子，因其分子量小，能自由通过肾小球滤过膜，且几乎完全(99%以上)在近曲小管上皮细胞被重吸收降解，不会以原型回到血循环。因此，血浆或血清中的Cys C就完全取决于肾小球滤过率。CysC是反映肾小球滤过功能较好的指标。研究表明血清CysC浓度不受年龄、性别、体表面积、肌量、种族和炎症的影响，但进一步的研究则发现，过往研究常只针对Cr检测的不足而设置[19-20]。研究证实，吸烟、甲状腺功能异常和高CRP水平均会促进CysC的产生和/或代谢[21-22]。因此，CysC更多可能是一种反映肾小球滤过功能的标志物[23]，而非AKI生物标志物[21]。CysC对于早期诊断肝硬化AKI也有一定的价值，虽然其敏感性和特异性稍低于NGAL。本研究结果显示，CysC以1.24 mg/L为诊断界值，特异性和敏感性均高达90%以上，正确诊断指数为0.874，其诊断性能优于传统指标sCr和c-aGFR。因此，在急性肾功能损伤的实验室检测中，加入血清CysC指标很有必要。

理论上, CysC和CysC-eGFR，sCr和c-aGFR的诊断性能应一致，尤其是前者。本组病例结果显示其间却有一定差异，这可能是本文借用的CysC-eGFR和c-aGFR方程之基础检测指标CysC和sCr与我们实验室方法(如仪器和/或试剂等)有所不同，也可能是抽样误差(即个体差异)等其他因素引起。

综上所述，NGAL具有高敏感性和特异性的诊断能力，是优于sCr和CysC的生物标志物，且检测uNGAL比检测sNGAL更能提高诊断性能，可用于肝硬化患者发生AKI的早期诊断。但在临床实际运用之前，还需要多中心大样本的临床实验来进一步验证。

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Evaluationofrenalfunctionparametersinacutekidneyinjurypatientssecondarytolivercirrhosis

GEBin1,2,LIEYan2,XUGe2,WUDuo-jiang2,QINYa-lu2,FENGJia-fu1,3(1.FacultyofLaboratoryMedicine,SouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,Sichuan; 2.DepartmentofLaboratoryMedicine,PiduDistrictPeople′sHospital,Chengdu611730，Sichuan; 3.DepartmentofLaboratoryMedicine,MianyangCentralHospital,Mianyang621000,Sichuan,China)

R446；R692.5

A

2017-02-14)

(本文编辑王海燕)

国家重点基础研究发展(973)计划子课题(2015CB755400)；四川省科技厅科技支撑项目(2015SZ0117)。

葛斌，1987年生，男，技师，硕士研究生，研究方向为肾病的实验室诊断。

俸家富，主任技师，硕士研究生导师，E-mail：jiafufeng@aliyun.com。

10.13602/j.cnki.jcls.2017.09.05