5个糖化血红蛋白检测系统对Hb NewYork合并β地中海贫血标本异常结果预警能力比较*

索明环，温冬梅，王伟佳，张德才，胡婷，王霞

(中山大学附属中山医院检验医学中心，广东中山 528403)

·临床检验技术研究·

5个糖化血红蛋白检测系统对Hb NewYork合并β地中海贫血标本异常结果预警能力比较*

索明环，温冬梅，王伟佳，张德才，胡婷，王霞

(中山大学附属中山医院检验医学中心，广东中山 528403)

目的通过分析不同糖化血红蛋白检测系统检测Hb NewYork合并β地中海贫血(简称“地贫”，双重杂合子)标本的结果，观察不同系统对该双重杂合子的预警能力。方法收集40例HbA1c不同分布范围的无血红蛋白病的标本，以通过NGSP Ⅰ级检测实验室认证的VariantⅡ(VⅡ)糖化血红蛋白检测系统作为参考系统，VariantⅡTurbo2.0(VⅡ-T)、Capillary 2 Flex Piercing(C2FP)、Primus Ultra2(Ultra2)、Modular PPI 800(PPI)系统为比对系统检测标本，以判断比对系统与参考系统结果的一致性。收集2例异常血红蛋白Hb NewYork合并β地贫血患者全血及血清标本，用5个糖化血红蛋白检测系统检测2例标本HbA1c。用毛细管电泳法对2例标本进行血红蛋白电泳分析，用GAP-PCR、原位杂交及双脱氧链终止法检测血红蛋白基因。结果对于无血红蛋白病患者全血标本，其他4个检测系统与VariantⅡ系统的一致性良好。2例患者的血红蛋白基因型分别为aa/aa,βIVS-2-654/βNewYork;aa/aa,β41-42/βNewYork；HbA含量均为0%,Hb NewYork含量分别为93.5%和94.0%；VⅡ的HbA1c检测结果分别为4.3%(23 mmol/mol)和4.5%(26 mmol/mol)；VⅡ-T2.0的检测结果分别为4.5%(26 mmol/mol)和4.6%(27 mmol/mol)；C2FP未检出HbA1c；Ultra2的结果分别为4.1%(21 mmol/mol)和4.3%(23 mmol/mol)；PPI的检测结果为4.2%(22 mmol/mol)和4.8%(29 mmol/mol)。检测系统无异常报警。结论5个检测系统对Hb NewYork双重杂合子的检测预警能力不同，Hb NewYork双重杂合子标本理论上不含HbA1c，VⅡ、VⅡ-T、Ultra2、PPI检测系统报告了HbA1c结果，对该标本无预警能力，而C2FP系统未报告检测结果，对此标本有预警能力。

糖化血红蛋白A1c；血红蛋白NewYork；色谱法；比浊法；毛细管电泳法

Abstract:ObjectiveTo analyze the HbA1c results of double heterozygotes of hemoglobin(Hb)NewYork and β-thalassemia detected by five different HbA1c detection systems, and compare the early-warning abilities of erroneous glycosylated hemoglobin results for Hb NewYork and β-thalassemia heterozygotes.MethodsPeripheral blood samples from 40 patients without hemoglobinopathies with different range of HbA1c levels were collected to evaluate the consistency of the detected results. Variant Ⅱ system was used as the reference system which successfully completed NGSP Level Ⅰ laboratory certification. Variant Ⅱ Turbo 2.0(VⅡ-T), Capillary 2 Flex Piercing(2FP), Primus Ultra2(Ultra2)and Roche Modular PPI(PPI)800 were used as the comparative systems. The HbA1c in 2 sera from the patients with compand heterozygotes of Hb NewYork was detected by the above systems. Hemoglobin electrophoresis was performed. Gentypes of α-and β-globin genes were analyzed by GAP-PCR, hybridization and dideoxy chain termination method.ResultsThe HbA1c values in non-hemoglobinophthy samples obtained using VⅡ-T 2.0, Ultra2, C2FP and PPI systems were well correlated with that of VⅡ system. The hemoglobin genotypes of the two cases of compand heterozygotes were aa/aa, βIVS-2-654/βNewYork and aa/aa, β41-42/βNewYork, respectively. The proportions of HbA were all 0 while the proportions of Hb NewYork were 93.5% and 94.0% respectively. The HbA1c results of the two cases detected were 4.3%(23 mmol/mol)and 4.5%(26 mmol/mol)by VⅡ, 4.5%(26 mmol/mol)and 4.6%(27 mmol/mol)by VⅡ-T 2.0, no values and no values by C2FP, 4.1%(21 mmol/mol)and 4.3%(23 mmol/mol)by Ultra2 and 4.2%(22 mmol/mol)and 4.8%(29 mmol/mol)by PPI systems, respectively. All the systems did not send warning for abnormal signs in profiles and results.ConclusionThe five systems presented different early-warning ability for the double heterozygotes of Hb NewYork and β-thalassemia. The compand heterozygotes should theoretically not contain HbA1c, but the systems VⅡ, VⅡ-T, Ultra2 and PPI showed detectable results of HbA1c indicating all the four systems were not able to provide with early-warning. C2FP system did not report HbA1c result so it exhibited early-warning ability for the double heterozygote.

Keywords： glycated hemoglobin A1c; hemoglobins NewYork; chromatography; turbidimetry; capillary electrophoresis

HbA1被称为糖化血红蛋白(glycosylated hemoglobin，GHb)，是葡萄糖或其他糖类与血红蛋白的氨基发生非酶促催化反应的产物，包括HbA1a、HbA1b和HbA1c。其中，HbA1c由葡萄糖和HbA的β肽链N末端缬氨酸残基缩合而成，可用于监控糖尿病患者血糖长期控制水平、评估并发症风险[1-2]。2010年美国糖尿病学会(American Diabete Association，ADA)已将HbA1c作为糖尿病的诊断标准之一[3]。目前，国内HbA1c检测的方法和影响因素多，标准化程度低，至今未作为诊断指标；特别是在血红蛋白病高发区，其应用受到一定程度的限制[4]。临床实验室常规检测HbA1c的方法主要有阳离子交换色谱法、亲和层析色谱法、毛细管电泳法和免疫法等，各方法原理不同，HbA1c检测结果影响程度也不同。广东地区是我国地中海贫血(以下简称“地贫”)和血红蛋白病高发区。调查发现，在β链发生基因突变的血红蛋白变异体中，HbE和Hb NewYork是广东南部地区的主要变异血红蛋白[5]。Hb NewYork合并β地贫的患者无正常的血红蛋白[6]。由于此类患者不存在正常的HbA，故理论上不存在正常的HbA1c。随着HbA1c的推广应用，检测系统对上述情况是否具有预警能力而防止错误报告HbA1c成为问题。本研究分析了5种常见检测系统检测Hb NewYork合并β地贫标本的HbA1c结果，比较了不同检测系统的预警能力差异。

1 对象与方法

1.1研究对象 收集40例经毛细管电泳法筛查排除地贫及血红蛋白变异体的患者标本，HbA1c 4.4%～14.4%，分别来自20例表观健康成人和20例2型糖尿病(T2DM)患者。表观健康者中男、女各10例，年龄20～40岁；T2DM患者中男、女各10例，年龄42～65岁；均已排除贫血、高胆红素血症、高脂血症和尿毒症等患者。收集2例Hb NewYork合并β地贫患者全血和血清标本，男、女各1例，年龄分别为25、18岁，均经毛细管电泳筛查和血红蛋白基因检测确认其血红蛋白基因型。

1.2主要仪器与试剂 VariantⅡ(VⅡ)和VariantⅡTurbo2.0(VⅡ-T)全自动糖化血红蛋白分析仪及其配套试剂、校准品(美国Bio Rad公司)；Capillary 2 Flex Piercing(C2FP)全自动糖化血红蛋白分析仪及其配套试剂、校准品(法国Sebia公司)；Primus Ultra2(Ultra2)全自动糖化血红蛋白分析仪及其配套试剂、校准品(美国Primus公司)；Modular PPI 800(PPI)全自动生化分析仪及其配套试剂、校准品(瑞士Roche公司)；Advia 2400全自动生化分析仪及其配套葡萄糖检测试剂(德国Siemens公司)；果糖胺(GSP)试剂(Roche公司)；糖化清蛋白(GA)试剂(日本旭化成公司)。XE-2100全自动血液分析仪(日本Sysmex公司)；Sebia Capilarys毛细管电泳分析仪及其配套试剂、质控品(法国sebia公司)；地贫基因检测试剂盒(深圳益生堂)；Applied Biosystems 3730XL测序仪(美国应用生物系统公司)。

1.3标本检测 分别用VⅡ、VⅡ-T、C2FP、Ultra2、PPI系统通过离子交换高效液相色谱法(IE-HPLC)、IE-HPLC、毛细管电泳法、硼酸盐亲和层析高效液相色谱法(AC-HPLC)、免疫抑制比浊法(TINIA)检测42例研究对象标本。用Sysmex XE-2100检测红细胞平均容积(MCV)、红细胞平均血红蛋白量(MCH)。用Sebia Capilarys毛细管电泳分析仪(法国sebia公司)和配套试剂盒用毛细管电泳法进行血红蛋白电泳。在ADVIA 2400生化仪上用己糖激酶法检测空腹血浆葡萄糖(FPG)，用比色法检测GSP，用酶法检测GA。用深圳益生堂血红蛋白基因检测试剂盒检测标本的α和β地贫基因，测序标本送至深圳华大基因公司，用Applied Biosystems 3730XL测序仪(美国应用生物系统公司)用双脱氧链终止法(Sanger法)对血红蛋白基因测序。

1.4比对分析和偏移评估 VⅡ检测系统已通过美国糖化血红蛋白标准化计划(National Glycohemoglobin Standardization Program，NGSP)Ⅰ级检测实验室认证，结果可溯源至糖尿病控制与并发症试验(DCCT)。以VⅡ作为参考系统，其他4个检测系统为比对系统，对比检测结果并评估偏移。每天检测8份标本HbA1c，连续测定5 d。当各检测系统结果与VⅡ可比时，检测Hb NewYork合并β地贫患者的标本。

1.5图谱分析 根据不同检测系统原理，分析图谱并与正常图谱比较。

2 结果

2.1Hb NewYork合并β地贫血液学表型结果 2例Hb NewYork合并β地贫患者RBC分别为6.96×1012、4.04×1012/L，Hb分别为143、81 g/L，MCV分别为64.1、65.3 fL，MCH分别为20.5、20.0 pg。血红蛋白电泳结果显示Hb NewYork分别为93.5%、94.0%，HbF分别为1.5%、1.0%，HbA2均为5%，HbA均为0%，见图1A。地贫基因检测结果显示两个标本α链不存在异常，β链分别存在IVS2-654和CD41-42突变，β基因测序显示在βC3测定的341位置检测到双峰T>A，相对应于β珠蛋白肽链第113位缬氨酸突变为谷氨酸(Val>Glu)(图1B)，形成异常血红蛋白Hb NewYork。2位患者FPG、GSP、GA结果分别为4.8 mmol/L、181 μmol/L、15.13%和4.4 mmol/L、163 μmol/L、14.75%，均在参考区间内。

2.2比对分析和偏移评估结果 VⅡ-T、C2FP、Ultra2和PPI 4个比对系统与VⅡ参考系统检测40例对照标本结果的相关性良好，相关系数(r)分别为0.998 4、0.998 2、0.997 8、0.997 8(P均<0.05)；与VⅡ参考系统检测结果差值的95%CI，VⅡ-T为-0.59%～0.3%，C2FP为-0.44%～0.38%，Ultra2为-0.24%～0.48%，PPI为-0.31%～0.49%，均在±0.75%间。Bland-Altman图结果显示，4个比对系统与VⅡ参考系统检测结果的差值百分比均位于±6%间，4个比对系统与VⅡ参考系统检测结果一致性良好。

2.3VⅡ与VⅡ-T 2.0检测Hb NewYork双重杂合子的HbA1c图谱 VⅡ检测系统检测正常标本(图2A)与Hb NewYork杂合子标本(图2B和C)的分离图谱几无差异，血红蛋白组分均被一一分离，“HbA1c”分别在0.94、0.89和0.90 min被分离，且图谱成分列表显示标本B和C HbA0含量分别为85.5%和86.3%，未显示异常血红蛋白存在。

VⅡ-T 2.0检测系统检测正常标本(图2D)与Hb NewYork杂合子标本(图2E和F)的分离图谱也

几无差异，血红蛋白各组分被一一分离，“HbA1c”在分别在0.51、0.46和0.46 min被分离出，“HbA1c”的出峰时间均正常，未显示异常血红蛋白存在。

注：A，血红蛋白电泳结果，无HbA0条带；B，箭头指示Hb NewYork变异体β链基因突变位点(T>A)。

图1 Hb NewYork合并β地贫患者标本血红蛋白电泳和基因测序结果

2.4C2FP检测Hb NewYork合并β地贫标本的HbA1c结果分析 见图3。Hb NewYork杂合子标本图谱与正常标本图谱存在明显差异。正常图谱出现HbA1c、other HbA、HbA0及HbA2峰，而Hb NewYork杂合子图谱与正常图谱(图3A)相比，图3B与图3C没有分离出HbA1c区带，仅出现了HbA0、HbF及HbA2峰，但系统将Hb NewYork峰误判为HbA0峰。

2.5Ultra2和PPI检测Hb NewYork合并β地贫标本的HbA1c结果分析 Ultra2和PPI分别用硼酸盐亲和层析法和免疫抑制比浊法检测HbA1c，2个检测系统均给出了HbA1c的检测结果(表1)，且检测系统没有异常报警提示。

注：A、B、C，VⅡ检测系统的图谱；D、E、F，VⅡ-T 2.0检测系统的图谱；A、D是正常标本，B、C、E、F为2例Hb NewYork双重杂合子标本。

图2 VⅡ与VⅡ-T 2.0 糖化血红蛋白检测系统标本检测结果

注：A，正常标本；B、C，2例Hb NewYork合并β地贫患者标本，未检出HbA1c区带。

图3 C2FP 糖化血红蛋白检测系统检测果图谱

注：Nr，未检测出该标本的HbA1c。

3 讨论

HbA1c是人体血液中葡萄糖与血红蛋白β链N末端缬氨酸残基以共价键结合的稳定化合物，反映红细胞生命周期内的平均血糖水平，是糖尿病的早期诊断标准及血糖控制的有效指标[1,3]。Hb NewYork是由于β珠蛋白肽链113位氨基酸缬氨酸被谷氨酸所代替，1967年Ranney等[7]首次在纽约一美籍华人中发现。本研究中2位患者均为双重杂合子，存在Hb NewYork血红蛋白变异体，同时也合并了中国人常见的17种β链的突变类型之一，国外在2008年有过类似病例报道[6]。由于两条β链均不能正常合成，不能产生正常的血红蛋白A。因2位患者血红蛋白不含HbA，因此理论上无HbA1c。

通过比对分析和偏移评估，VⅡ、VⅡTurbo、Primus和PPI 4个检测系统。40例无血红蛋白病的HbA1c结果可比，说明比对系统与参考系统的结果具有一致性。而2例Hb NewYork双重杂合子标本，每个检测系统给出了不同的检测结果。VⅡ、VⅡ-T 2.0、Ultra2和PPI 4个检测系统均给出了HbA1c的结果，这可能和检测系统的分析原理相关。VⅡ、VⅡ-T 2.0测定HbA1c 主要利用糖化血红蛋白和血红蛋白的物理化学性质的不同，离子交换层析法的原理为用弱酸性离子交换树酯在选定的低浓度洗脱液离子强度及pH 条件下，根据血红蛋白中各组分蛋白所带电荷不同各组份(HbA1a、HbA1b、HbA1c、HbF、LA1c、HbA0、甲基化血红蛋白及部分血红蛋白变异体)被一一分离检测[8]。由于Hb NewYork的分子量和离子强度均和HbA接近，VⅡ和VⅡTurbo检测系统不能分辨HbA和HbNewYork，导致将Hb NewYork的糖基化产物误认为HbA1c。Ultra2检测系统的原理是利用硼酸盐亲和层析法，利用硼酸具有与整合在血红蛋白分子上的葡萄糖顺位二醇作可逆结合反应的性质，使糖化血红蛋白选择性地结合在交联了间苯硼酸的琼脂糖珠的凝胶柱上，而非糖化血红蛋白先被洗脱，再用不同性质的洗脱液将糖化血红蛋白洗脱, 从而达到分离目的。检测物质为总的糖化血红蛋白和总的非糖化血红蛋白，通过校正得到HbA1c结果。该方法不能检测出异常的血红蛋白[9]，误将2位患者的异常血红蛋白的糖基化产物报告为HbA1c。虽然PPI检测系统的试剂经过不断更新，从识别β链N末端4～10号氨基酸抗原表位改变为识别N末端1～4号氨基酸抗原表位，提高了检测特异性[10]。但是也不具备变异体的检出能力，给出了2位患者的HbA1c的结果。以上4个检测系统检测出的HbA1c能否代表患者3个月的平均血糖水平还有待探讨。C2FP检测系统通过毛细管电泳的原理对血红蛋白各组分进行分离，正常和异常血红蛋白按下列顺序检测出来,从阴极到阳极依次为HbA2、HbE、HbS、HbD、HbF、HbA0、其他HbA、HbG、HbA1c、HbH等,具有高分辨率的特性，可将常见的血红蛋白变异体与HbA0和HbA1c完全分离[11]。本研究中，该检测系统很好地分离出了Hb NewYork，没有呈现出HbA1c的结果，这和患者的实际情况相符。

综上所述，5个糖化血红蛋白检测系统对Hb NewYork合并β地贫患者的预警能力存在差别。ADA不建议在血红蛋白变异体存在的情况下使用HbA1c作为糖尿病的诊断标准[12]。因当存在血红蛋白变异体时，红细胞的寿命可能会改变，且变异体的糖基化速率和HbA存在差别，影响了HbA1c的生成，此时的HbA1c不能代表3个月的平均血糖水平。因此，在“两广”等异常血红蛋白高发区，在检测患者HbA1c前应了解患者的血红蛋白情况，熟知检测系统的优缺点，排除血红蛋白变异体对HbA1c的影响，以减少HbA1c检测结果的临床应用风险。

[1]Diabetes Control and Complications Trial Research Group. The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term term complications in insulin-dependent diabetes mellitus[J]. N Engl J Med, 1993, 329(14):977-986.

[2]UK Prospective Diabetes Study(UKPDS)Group. Intensive blood-glucose control with sulphonylureas or insulin compared with conventional treatment and risk of complications in patients with type 2 diabetes(UKPDS 33)[J]. Lancet, 1998, 352(9131):837-853.

[3]American Diabetes Association. Standards of medical care in diabetes 2010[J].Diabetes Care,2010,33(Suppl 1): S11-61.

[4]索明环, 温冬梅, 张秀明, 等. 警惕糖化血红蛋白 A1c 在地贫患者中误用[J]. 临床检验杂志,2014,32(2):151-152.

[5]Lou JW, Wang T, Liu YH,etal. Prevalence and molecular characterization of structural hemoglobin variants in the Dongguan region of Guangdong province, southern China[J]. Hemoglobin,2014,38(4):282-286.

[6]Lee AC, Ma ES, Chan AY,etal．Double heterozygnsity for Hb New York[β113GTG→ GAG；VAL→GLU]an β degrees thalassemia mutations manifests as athalassemia trait[J]．Pediatr Hematol Oncol, 2008, 25(3): 227-231.

[7]Ranney HM, Jacobs AS, Nagel RL. Haemoglobin new york[J]. Nature, 1967, 213(5079): 876-878.

[8]Rhea JM，Molinaro R. Pathology consultation on HbA1c methods and interferences[J]. Am J Clin Pathol, 2014,141(1):5-16.

[9]Rhea JM，Koch D，Ritchie J，etal．Unintended reporting of misleading HbA1c values when using assays incapable of detecting hemoglobin variants[J]. Arch Pathol Lab Med, 2013, 137: 1788-1791.

[10]Abadie JM, Koelseh AA. Performance of the Roche second generation hemoglobin A1c immunoassay in the presence of HB-S or HB-C traits[J]. Ann Clin Lab Sci, 2008, 38(1)：31-36.

[11]Urrechaga E. High-resolution HbAlc separation and hemoglobinopathy detection with capillary electrophoresis[J]. Am J Clin Pathol, 2012,138(3): 448-456.

[12]American Diabetes Association. Standards of medical care in diabetes-2013[J]. Diabetes Care, 2013, 36(Suppl 1): S11-S66.

Comparisonofearly-warningabilityoffivedifferentdetectionsystemsforerroneousglycosylatedhemoglobinresultsfromcompandheterozygotesofhemoglobulinNewYorkacompainyingβ-thalassemia

SUOMing-huan,WENDong-mei,WANGWei-jia,ZHANGDe-cai,HUTing,WANGXia

(DivisionofClinicalLaboratory,ZhongshanHospitalofSunYat-senUniversity,Zhongshan528403,Guangdong,China)

R446；R587.1

A

2017-03-20)

(本文编辑王海燕)

广东省科技计划项目(20138021800112)；中山市卫生局课题(2014J040)；中山市科技局重大项目(2015B1002)。

索明环，1982年生，女，副主任技师，硕士，主要从事临床化学研究。

温冬梅，主任技师，硕士，E-mail：swan4130@163.com。

10.13602/j.cnki.jcls.2017.09.03