生鲜乳中金黄色葡萄球菌检测及性状分析

柳海宾，张燕，杜欣军，李萍，王硕

（天津科技大学食品营养与安全重点实验室，天津 300457）

生鲜乳中金黄色葡萄球菌检测及性状分析

柳海宾，张燕，杜欣军，李萍，王硕

（天津科技大学食品营养与安全重点实验室，天津 300457）

对天津市周边9家奶场原料奶中金黄色葡萄球菌污染水平、肠毒素基因的携带情况及耐药性进行调查研究。采集原料奶样品共432份，按照GB4789.10-2010对原料奶中金黄色葡萄球菌进行检验，并对筛选出来的金黄色葡萄球菌进行肠毒素基因研究、生物膜形成能力分析和耐药性分析。结果表明：采集的432份原料奶中，金黄色葡萄球菌阳性样本有14个，阳性率为3.24%，筛选出来的14株金黄色葡萄球菌携带SEA的概率为100%；14株菌中有10株分离株可以形成生物膜，其中2株可以形成中等粘附的生物膜；金黄色葡萄球菌分离株对氯霉素耐药率（100%）最高，对头孢西丁钠（21.43%）、阿米卡星（14.29%）、万古霉素（14.28%）、苯唑西林（28.57%）耐药率较高，所有菌株对环丙沙星敏感。其中有4株分离株为多重耐药株。结论：所选取的9家奶厂中，原料奶中金黄色葡萄球菌污染率相对较低，但金黄色葡萄球菌分离株肠毒素A基因检出率较高，生物膜形成能力较强，耐药情况比较严重，并且存在多重耐药和万古霉素耐药菌株，本研究为奶源性金黄色葡萄球菌的污染溯源和控制提供了相应的数据支持。

金黄色葡萄球菌；毒素基因；耐药；生物膜

Abstract:To investigate the contamination and enterotoxin of Staphylococcus aureus in raw milk from 9 dairy farms around Tianjin city,to un⁃derstanding the dairy product safety.432 raw milk were collected,according to GB4789.10-2010,the contamination of Staphylococcus aure⁃us were detectedand the analysis of Staphylococcus aureus enterotoxin gene and biofilm formation ability and the antibiotic resistance were carried out.Results:Staphylococcus aureus was detected in 14 raw milk samples,with a total detection ratio of 3.24%.The detection ratio of en⁃terotoxin gene A of Staphylococcus aureus was 100%.In this experiment,14 Staphylococcus aureus were isolated,in which 10 strains have the abili⁃ty of forming biofilm.For the Staphylococcus aureus isolated from milk,the highest drug-resistance of all strain was chloramphenicol(100%),many isolates were resistant to cefoxitin(21.43%),amikacin(14.29%),vancomycin(14.28%),oxacillin(28.57%),all the isolates were suscepti⁃ble to ciprofloxacin.4 isolates were multi-drug resistance.Conclusion:The Staphylococcus aureus pollution was not very serious in raw milk in Tianjin city.But the isolates of Staphylococcus aureus enterotoxin and biofilm forming ability is not optimistic.In addition,there were multiple drug resistance and vancomycin resistant strains.This study provided the supporting data for control pollution traceability of Staphylococcus aure⁃us.

Key words:Staphylococcus aureus;enterotoxin gene;drug-resistance;biofilm.

0 引言

金黄色葡萄球菌是常见的食源性致病菌之一，其产生的肠毒素是食物中毒的主要原因，金黄色葡萄球菌毒素中毒主要发生在乳及乳制品的食用中[1]，当食物中金黄色葡萄球菌数达到2.4×103g－1时，就有产生肠毒素的风险[2]。金黄色葡萄球菌肠毒素中SEA为最主要的类型，极易污染食品[3]。

金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的主要致病菌。目前奶牛乳房炎的治疗主要依赖于抗生素，而抗生素的滥用会导致耐药菌株的出现[4-5]，有研究者提出这是由于细菌形成生物膜，使菌体对抗生素的抵抗作用增强[6]。而且生物膜的形成可以增强细菌对周围环境的耐受性[7-8]。

本研究共采集原料奶432份，对其中金黄色葡萄球菌污染状况进行调查，为乳制品企业确定安全生产关键控制点治奠定基础。

1 实 验

1.1 材料

7.5%NaCl肉汤，血琼脂平板，脑心浸出液肉汤（BHI），卵黄增菌液，baird parker(B-P)培养基，冻干兔血浆，甘露醇氯化钠琼脂培养基，Taq酶，Buffer，dNTP以及细菌基因组DNA提取试剂盒，甲醇，乙醇，四环素，阿米卡星，硫酸庆大霉素，红霉素，头孢西丁钠，氯霉素，环丙沙星，卡钠霉素，万古霉素，苯唑西林。

1.2 设备

1.3 方法

1.3.1 金黄色葡萄球菌的分离鉴定

在天津市周围9个奶场采集原料奶，共计432份，所采集的原料奶密封于无菌采样袋内，低温下3 h内送至实验室，按照GB4789.10-2010[9]选取B-P平板上黑色菌落周围有浑浊带和透明圈的疑似菌落，进行溶血试验和血浆凝固酶实验，经过一系列生化鉴定的菌株加入终体积分数为20%的甘油，于-80℃保存备用。

1.3.2 进一步筛选金黄色葡萄球菌

经过国标法生化实验筛选出来的菌株，在甘露醇氯化钠琼脂培养基上接种后37℃培养24 h，分别挑选金黄色的菌落和白色菌落接种LB培养基上活化至OD值为0.6，将筛选出的菌株加入终体积分数为20%的甘油后，于-80℃冰箱中保存备用。

1.3.3 PCR验证

将1.3.2筛选出来的金黄色菌落和白色菌落进一步用PCR方法进行验证是否存在nuc基因，引物的设计参考文献，由苏州金唯智生物技术有限公司合成，引物序列如表1所示。

表1 nuc及肠毒素引物

nuc基因PCR扩增程序为：94℃预变性10 min；94 ℃变性2 min；56 ℃退火2 min；72 ℃延伸30 s；35个循环；最后72℃延伸10 min。然后精确移取6 uL扩增产物，用2%的琼脂糖凝胶电泳检测。

目前，国内的《人民日报》、搜狐、新浪等媒体上线的VR新闻大部分以360度全景视频为主，而国外的《纽约时报》在报道VR新闻时甚至采用直升机拍全景，观众在观看视频时只需一个智能手机或者利用VR眼镜即可。VR视频的原型机在拍摄视频时根本不需要边框，所以其与传统视频的拍摄方式存在着较大的差异。由于拍摄的角度为360度，因此观众站在某个角度观看视频便成为拍摄者心中的谜。[3]视频的脚本设计者在设计时具有故事性的视频时变得愈加困难，由于技术含量较低，推广人员便放弃了推广。

1.3.4 金黄色葡萄球菌毒素基因分析

在2 mL营养肉汤培养基上接种筛选出来的金黄色葡萄球菌，置于摇床上，37℃恒温过夜，使金黄色葡萄球菌复苏，然后将菌液在19 800 g的离心力下离心5 min，收集菌体。金黄色葡萄球菌基因组DNA用试剂盒提取，用PCR检测上述金黄色葡萄球菌基因组DNA中各肠毒素血清型分布情况，PCR引物见表1。PCR反应程序为：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，55℃退火2 min，72℃延伸30 s，35个循环，72℃后延伸10 min，得到的扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。

1.3.5 金黄色葡萄球菌生物膜形成能力及药敏分析

依据文献方法[10]，将过夜活化的菌株按1∶100稀释，取稀释后的菌株200 μL于无菌96孔板中，同时做阴性对照（只加入空白LB）和阳性对照（ATCC35984），37 ℃静置培养24 h，吸弃培养液，用250 μL的ddH2O溶液洗涤3次，除去未黏附的悬浮菌体及培养基，加入200 μL体积分数99%的甲醇固定15 min，吸弃甲醇，室温干燥。加入200 μL质量分数为2%的结晶紫染色5 min，吸弃结晶紫，流水冲洗多余染液，室温干燥。加入220 μL体积分数为33%乙醇溶解，混匀，用酶标仪测定595 nm处的OD值。OD值可以反映生物膜与接触物表面结合的牢固程度，依据空白对照组的OD值（ODC）对生物膜的黏附能力进行分类：OD≤ODC为不黏附；ODC＜OD≤2ODC为弱黏附；2ODC＜OD≤4 ODC为中等黏附；OD＞4ODC为黏附能力强。依据CLSI推荐的琼脂稀释法进行抗菌药物的药敏性试验。选取临床常用的10种抗生素进行测试，抗生素质量浓度和判断标准如表2所示。具有3种或3种以上抗生素抗性的菌株定义为多重耐药性菌株。

2 结 果

2.1 金黄色葡萄球菌检出情况

通过GB/T4789.10-2010对采集的432份原料奶进行检验，共得到63株疑似金黄色葡萄球菌分离株。16S rRNA测序分析后发现其中混有变形杆菌，将国标法筛选出来的疑似菌落划线于甘露醇氯化钠琼脂培养基上，37℃培养24 h后，平板上的菌落分为两种典型形态，一种为金黄色，表面光滑凸起；另一种为乳白色。63株筛选的疑似金黄色葡萄球菌在甘露醇氯化钠琼脂培养基上有14株形成金黄色菌落，其余形成乳白色菌落或者在甘露醇氯化钠琼脂培养基上不能生长。

表2 金黄色葡萄球菌药敏试验抗生素信息 μg/mL

2.2 PCR验证

选取甘露醇氯化钠琼脂培养基上金黄色菌落和白色菌落，提取基因组DNA，用PCR法检验是否存在nuc基因，电泳结果表明，甘露醇氯化钠琼脂培养基上的金黄色菌落均能扩增出nuc基因，而白色菌落不能扩增出nuc基因。经PCR验证表明，从样品中筛选出来的金黄色葡萄球菌为14株，分别来自14个原料奶样品，样品金黄色葡萄球菌阳性率为3.24%。

图1 nuc基因PCR验证结果

2.3 PCR检验肠毒素基因

根据金黄色葡萄球菌SEA基因验证电泳图，14株金黄色葡萄球菌均存在SEA基因，SEA基因的检出率为100%，SEB，SEC，SED，SEE基因的检出率为0。

2.4 金黄色葡萄球菌分离株生物膜形成能力比较

实验结果表明，14株金黄色葡萄球菌中有10株分离株可以形成生物膜，其中2株可以形成中等黏附的生物膜，8株生物膜的黏附能力弱，有4株金黄色葡萄球菌分离株不能形成生物膜。

2.5 金黄色葡萄球菌分离株的耐药性结果

图2 金黄色葡萄球菌SEA基因验证结果

表3 生物膜形成能力鉴定

参照CLSI（2010），对耐药结果进行分析，统计出耐药、中介、敏感的金黄色葡萄球菌菌株数，并计算耐药率，本研究中14株分离株对10种抗生素的耐药率统计如表4所示，所有的分离株至少对一种抗生素存在耐药情况，并且有两株菌对万古霉素耐药，对3种或3种以上抗生素耐药定义为多重耐药菌株，依据图3，多重耐药菌株占28.57%。

3 讨 论

是否产生血浆凝固酶是金黄色葡萄球菌鉴定中的黄金标准，但一些非金黄色葡萄球菌产生活性较大的蛋白酶也可以使冻干兔血浆凝固，导致假阳性的出现。另外变形杆菌和金黄色葡萄球菌在鉴定试验中有很多相似之处，即使在Baird-parker培养基上反复分离，挑取单菌落，仍很难区分，因此本实验在国标法检测金黄色葡萄球菌的基础上，增加了甘露醇氯化钠选择性培养基，长出的金黄色菌落为疑似金黄色葡萄球菌，用PCR方法验证这些菌落均存在nuc基因。nuc基因为金黄色葡萄球菌上高度保守区域，该基因编码的耐热核酸酶为金黄色葡萄球菌所特有，胡瑜等[11]曾将nuc基因作为金黄色葡萄球菌PCR鉴定的参照基因。因此，本研究建立了一种简便的筛选食品中金黄色葡萄球菌的方法，即7.5%NaCl肉汤增菌-三区划线于Baird-parker培养基-挑取有浑浊带和透明圈的黑色菌落划线于甘露醇氯化钠琼脂培养基-PCR验证，简化了筛选步骤的同时提高了筛选结果的准确性。

表4 14株金黄色葡萄球菌体外药物敏感性

图3 14株金黄色葡萄球菌药物敏感性分布

本研究采集的原料奶样品有3.24%被金黄色葡萄球菌污染，显著低于文献报道的结果（19.33%张静[12]，任敏11.5%[13]，彭洋7.55%[14]），且各文献报道的结果也存在差异，这表明不同地区生鲜乳中金黄色葡萄球菌的污染存在差异，同时也反映出天津周边地区奶场卫生状况优良。

对原料奶中金黄色葡萄球菌肠毒素基因携带情况进行检测，结果发现100%的金黄色葡萄球菌分离株携带肠毒素基因，且均为SEA，即所有的金黄色葡萄球菌分离株肠毒素基因阳性。卫沛楠等[15]对金黄色葡萄球菌分离株肠毒素基因调查发现，84.95%的分离株携带肠毒素基因。杨静等[16]用PCR方法检测各类食品中的金黄色葡萄球菌分离株，结果显示肠毒素基因的携带率为100%。颜文光等[17]研究发现有34.27%的金黄色葡萄球菌分离株携带肠毒素基因。由此可以看出，不同地区、不同来源的金黄色葡萄球菌分离株间肠毒素基因的携带率有差异，且肠毒素基因的多样性间存在差异。这些差异可能与样本大小、样本多样性及地区有关。

金黄色葡萄球菌生物膜是金黄色葡萄球菌一个重要的毒力因子，含有多种毒素，生物膜的形成使得微生物易感染宿主细胞，并且对机体免疫清除作用的抵抗增强[18]，对外界环境的耐受性增加[19]。细菌以生物膜的形式附着在食品加工环境中，常规的清洗和消毒方法难以将其清除，并且耐药性会明显增强（10～1 000倍[20]）。生物膜形成后，将细菌包被于胞外基质中，形成膜屏障作用，并且生物膜可以诱导耐药基因的高表达[21]，随之出现的是微生物耐药性更加严重[22]。本研究从原料奶中筛选出来的金黄色葡萄球菌中，有71.43%的菌株可以形成生物膜，张伟松[23]，周欢欢[24]，李延荣[25]等分离出的金黄色葡萄球菌中，具有生物膜形成能力的菌株分别占100%，75%，74%，消费者食用了被金黄色葡萄球菌污染的食品，除肠毒素会引发相关疾病外，还会引发与生物膜相关的疾病[26]，如龋齿，肺炎，支气管炎等。

细菌的耐药问题是食品和卫生领域普遍关注的问题，随着抗生素在医药领域的广泛使用，导致多重耐药菌株的出现，给人类的健康和生活带来很大的威胁。从本研究药敏检测结果来看，奶源性金黄色葡萄球菌分离株对氯霉素的耐药率为100%，对万古霉素的耐药率达到14.28%，万古霉素是目前治疗金黄色葡萄球菌感染最有效的药物，这些菌株进一步发展可能会成为超级耐药菌株。赵俊利[27]等对内蒙古地区奶牛源金黄色葡萄球菌的耐药性进行调查，发现多重耐药菌株占33.9%，没有发现万古霉素耐药菌株，刘琪[28]等对东北地区奶牛源金黄色葡萄球菌的耐药性进行调查，青霉素、氨苄西林、红霉素、卡那霉素和环丙沙星的耐药率分别为：50%，50%，62.5%，50%和25%，对苯唑西林、四环素、万古霉素均敏感。

本研究分析了天津市周围9家奶厂中金黄色葡萄球菌的污染和耐药情况，金黄色葡萄球菌污染率较低，但金黄色葡萄球菌分离株中耐药性较为普遍，并且存在多重耐药和万古霉素耐药菌株，本研究为奶源性金黄色葡萄球菌的污染溯源和控制提供了相应的数据支持。

[1]焦焱，唐晓磊，刘成文，等.西宁市生鲜乳中金黄色葡萄球菌及其肠毒素污染状况调查[J].医学动物防制2015,31(8):885-887.DOI:10.7629/yxdwfz201508020.

[2]CARMO L S,DIAS R S,LINARDI V R,et al.Food poisoning due to enterotoxigenic strains of Staphylococcus present in Minas cheese and raw milk in Brazi[J].Food Microbiology,2002,19(1):9-14.DOI:10.1006/fmic.2001.0444

[3]SVEDOVA J,TSURUTANI N,Liu W,et al.TNF and CD28 Signal⁃ing Play Unique but Complementary Roles in the Systemic Recruit⁃ment of Innate Immune Cells after Staphylococcus aureus Enterotoxin A Inhalation[J].The Journal of Immunology,2016,196(11):4510-4521.DOI:10.4049/jimmunol.1600113.

[4]胡晓宁,苏诚玉,权玉玲,等.甘肃省生鲜乳中金黄色葡萄球菌及肠毒素污染状况调查[J].中国卫生检验，2013,23(4)：984-986.

[5]ELDHOLM V,BALLOUX F.Antimicrobial Resistance in Mycobac⁃terium tuberculosis:The Odd One Out[J].Trends in microbiology,2016,24(8):637-648.DOI:org/10.1016/j.tim.2016.03.007

[6]李自然，施春雷，宋明辉，等.上海市食源性金黄色葡萄球菌分布状况[J].食品科学，2013,34(1):268-271.

[7]JUNG Y G,CHOI J,KIM S K,et al.Embedded biofilm,a new bio⁃film model based on the embedded growth of bacteria[J].Applied and environmental microbiology,2015,81(1):211-219.DOI:10.1128/AEM.02311-14.

[8]LIU Y,TANG H,LIN Z,et al.Mechanisms of acid tolerance in bacte⁃ria and prospects in biotechnology and bioremediation[J].Biotechnology advances,2015,33(7):1484-1492.DOI:org/10.1016/j.biotechadv.2015.06.001.

[9]中华人民共和国国家标准,GB/T4789.10-2010食品卫生微生物学检验金黄色葡萄球菌检验[S].北京：中国标准出版社,2010.

[10]桂中玉，李琳，李冰，等.金黄色葡萄球菌耐药性与生物被膜能力鉴定[J].现代食品科技,2014(30)DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2014.03.021.

[11]胡瑜.金黄色葡萄球菌耐热核酸酶的功能鉴定及表达调控[D].上海：上海交通大学,2013.

[12]张静.不同来源金黄色葡萄球菌的污染状况调查及药敏性、毒力基因、PFGE分型研究[D].杨凌：西北农林科技大学,2012.

[13]任敏.金黄色葡萄球菌毒力基因多重PCR方法的建立及杨凌市售生鲜牛乳中该军污染状况调查[D].杨凌：西北农林科技大学，2014

[14]彭洋.广州部分公共场所葡萄球菌污染状况和耐药谱及其分子特征研究[D].广东：广州药学院,2015.

[15]卫沛楠.食源性金黄色葡萄球菌肠毒素基因检测及基因分型研究[D].石家庄：河北医科大学,2013.

[16]杨静，杨军，黄继超，等.食源性金黄色葡萄球菌肠毒素基因分布与时序性表达[J].中国农业科学2012,45(19):4057-4066,DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2012.19.018.

[17]颜文光.不同来源金黄色葡萄球菌的肠毒素基因分布与SCCmec，spa及MLST分型研究[D].扬州:扬州大学,2015.

[18]MCCARTHY H,RUDKIN J K,BLACK N S,et al.Methicillin re⁃sistance and the biofilm phenotype in Staphylococcus aureus[J].Front Cell Infect Microbiol,2015,5(1).

[19]LIU Y,TANG H,LIN Z,et al.Mechanisms of acid tolerance in bac⁃teria and prospects in biotechnology and bioremediation[J].Biotech⁃nology advances,2015,33(7):1484-1492.DOI:org/10.1016/j.bio⁃techadv.2015.06.001.

[20]陈铁柱,李晓声,曾文魁,等.细菌生物膜耐药机制的研究与进展[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(12):2205-2208.

[21]任晓镤,陈伟，张利莉.不同理化因素对表皮葡萄球菌生物膜形成的影响[J].西北农业学报，2011,20(12):1-5.

[22]FERRAN A A,LIU J J,TOUTAIN P L,et al.Comparison of the In vitro Activity of Five Antimicrobial Drugs against Staphylococcus pseudintermedius and Staphylococcus aureus Biofilms.Frontiers in Microbiology 7.DOI:10.3389/FMIB.2016.01187

[23]张伟松.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性及生物膜形成能力的研究[D].杨凌：西北农林科技大学,2014.

[24]周欢欢,刘子琦,李槿年,等.乳源耐甲氧西林葡萄球菌的耐药性、产毒性与生物膜形成能力检测[J].安徽农业大学学报，2015,42(4):529-535，doi:10.13610/j.cnki.1672-352x.20150625.003

[25]李延荣.新疆囊激昂地区奶牛乳房炎性金黄色葡萄球菌生物膜形成及影响因素的研究[D].阿拉尔:塔里木大学硕士学位论文,2013

[26]MONDS R D,O’TOOLE G A.The developmental model of micro⁃bial biofilms:ten years of a paradigm up for review[J].Trends in Micro⁃biology,2009,17(2):73-87.DOI:org/10.1016/j.tim.2008.11.001.

[27]赵俊利.内蒙古地区奶牛临床型子宫内膜炎致病葡萄球菌超抗原基因分布、耐药性及分型研究[D].呼和浩特：内蒙古农业大学，2014.

[28]刘琪.中国东北地区奶牛源葡萄球菌耐药现状调查及用药指导[D].长春：吉林农业大学，2014.

Prevalence and characterization of Staphylococcus aureus isolated from raw milk

LIU Haibin,ZHANG Yan,DU Xinjun,LI Ping,WANG Shuo
(Key Laboratory of Food Nutrition and Safety,Ministry of Education,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457)

TS252.2，TS252.7

A

1001-2230(2017)09-0017-05

2017-02-28

国家十二五规划项目(2013BAD18B11);天津科技大学优秀博士学位论文创新基金(2016003)。

柳海宾（1989-），女，博士研究生，研究方向为致病菌的污染调查及快速检测。

王硕