固相微萃取气质联用法测定原料乳中的苯甲酸

舒平，赵浩军，徐幸

(大理州质量技术监督综合检测中心，云南大理 671000)

固相微萃取气质联用法测定原料乳中的苯甲酸

舒平，赵浩军，徐幸

(大理州质量技术监督综合检测中心，云南大理 671000)

以固相微萃取-气相色谱质谱联用法（SPME-GC/MS），分析测定原料乳中苯甲酸。采用75 μm carboxen/聚二甲基硅氧烷（CAR/PDMS）萃取纤维，以1,2-二氯苯作为内标，对苯甲酸进行定量。结果表明，苯甲酸在检测范围0.5～20 mg/L内，具有良好的线性关系（R2=0.9913）。原料乳中苯甲酸的检出限和定量限分别为0.2 mg/L和0.5 mg/L，平均回收率为83.2%～97.9%，相对标准偏差（RSDs）为4.8%～9.3%。该方法操作简便、准确可靠，适合用于原料乳中苯甲酸的确证分析。

苯甲酸；1,2-二氯苯；固相微萃取-气质联用法（SPME-GC/MS）；原料乳

Abstract:A method for solid phase micro extraction and gas chromatography mass spectrometry(SPME-GC/MS)was developed for the de⁃termination of benzoic acid in raw milk.75 μm carboxen/polydimethylsiloxane(CAR/PDMS)fiber was selected for extraction in this study.1,2-dichlorobenzene was used as an internal standard for quantifying benzoic acid.The results showed that the linear relationships between ratio of peak area and concentration of benzoic acid(R2=0.9913)was good enough from 0.5 to 20 mg/L.The limits of detection(LOD)and limits of quantification(LOQ)for benzoic acid were 0.2 mg/L and 0.5 mg/L,respectively.The average recoveries was 83.2%～97.9%,and the relative standard deviations(RSDs)was 4.8%～9.3%.This method is convenient and reliable,and it is suitable for the determination of benzoic acid in raw milk.

Key words:Benzoic acid;1,2-dichlorobenzene;SPME-GC/MS;Raw milk

0 引言

苯甲酸（benzoic acid）能抑制微生物生长，是重要的防腐剂[1]。按国家标准的规定，牛乳中不能使用苯甲酸用于防腐[2]。然而牛乳中天然存在少量的苯甲酸[3，4]，主要为马尿酸或苯丙氨酸转化而来[5-7]。当牛乳变质时，苯甲酸也会增加[8]，测定原料乳中苯甲酸不仅可以监测添加防腐剂的情况，也可监测牛乳是否新鲜。

目前测定苯甲酸的方法，主要有气相色谱法[9]、液相色谱法[10]、离子色谱法[11]、气质联用法等[12]和液质联用法[13]。这些前处理方法需有机溶剂提取富集，步骤繁琐且污染。固相微萃取技术（solid phase micro ex⁃traction，SPME），可顶空萃取目标物[14]，操作简便。本研究采用固相微萃取和气质联用法，内标法定量，建立原料乳中苯甲酸的检测方法。

1 实验

1.1 仪器与试剂

Agilent 7890-240离子阱气质联用仪，Combi PAL GC多功能自动进样器，75 μm carboxen/聚二甲基硅氧烷（CAR/PDMS）固相萃取纤维头，苯甲酸标准溶液（编号GBW(E)100006，质量浓度为1 g/L），1，2-二氯苯（纯度≥98.0%），苯甲酸钠（分析纯），无水乙醇（色谱纯），浓硫酸（优级纯），测试的原料乳样品是从当地养殖户收购获得。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液的配制

内标工作液：准确称取100 mg的1，2-二氯苯标准品，用无水乙醇溶解并定容于100 mL的容量瓶中，摇匀备用，质量浓度为1 g/L的1，2-二氯苯标准储备液，将标准储备液用无水乙醇稀释成10 mg/L标准工作液。

分别吸取2.5，5，10，25，50 μL和100 μL的苯甲酸标准溶液于20 mL的顶空瓶中，再分别加入10 μL质量浓度为10 mg/L的1，2-二氯苯标准工作液，加入超纯水使溶液总体积为5 mL，分别配制成质量浓度为0.5，1，2，5，10 mg/L和20 mg/L的标准溶液系列。

1.2.2 样品处理

准确吸取5 mL牛乳样品置于20 mL的顶空瓶中，加入10 μL浓度为10 mg/L的1，2-二氯苯标准储备液作为内标，加入200 μL浓度为1 mol/L的硫酸溶液酸化，涡旋混匀1 min。

1.2.3 气质联用的分析条件

样品预热温度为70℃，用75 μm CAR/PDMS纤维头萃取吸附20 min，然后将萃取纤维头插入温度为240℃的进样口解吸5 min；不分流进样模式。以DB-1701毛细柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）为分离色谱柱；色谱条件为：50℃保持5 min，以10℃/min的速率升温至100℃，再以30℃/min的速率升温至250℃，保持0.2 min；氦气流速为1.2 mL/min；质谱分析条件为：电子轰击（EI）离子源；接口温度为240℃；阱温为100℃；离子源温度180℃；以选择离子存储（SIS）模式扫描特征离子，参数如表1所示。

表1 目标物的保留时间和特征离子

2 结果与分析

2.1 仪器条件的选择

通过离子阱气质联用仪全扫描模式，获得了苯甲酸和1，2-二氯苯的质谱图，如图1所示，由质谱图可以看出目标物的特征离子，由此来选定目标物的定量与定性离子，采用选择离子存储（SIS）模式对特征离子进行扫描。

图1 全扫描质谱图

通过离子阱气质联用仪的SIS模式分析检测苯甲酸和1，2-二氯苯的标准溶液，获得了选择离子扫描图，如图2所示。

图2 苯甲酸和1,2-二氯苯标准溶液的选择离子扫描结果

2.2 固相微萃取条件的选择

苯甲酸分子含有苯环和羧基，羧基具有极性，因此选择能吸附极性物质的CAR/PDMS萃取纤维头，且苯甲酸具有挥发性，可以用顶空法进行萃取。本研究考察了不同温度萃取苯甲酸的峰面积变化情况，结果如图3所示。由图3可以看出，随着萃取温度的升高，苯甲酸的峰面积增大，在70℃时达到较高的响应值，由于苯甲酸的峰面积在80℃时没有明显高于70℃时，故选择了萃取温度为70℃。

图3 萃取温度对苯甲酸萃取效果的影响

2.3 酸化条件的选择

苯甲酸分子具有挥发性，在顶空时可以被萃取纤维头吸附，而苯甲酸钠不具有挥发性，难以被萃取纤维头吸附，由于人为添加防腐剂时，可能会选择添加苯甲酸钠，因此，在测定样品中的苯甲酸钠，需要将其酸化为苯甲酸进行测定。GB 5009.28-2016《食品安全国家标准食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》中，采用盐酸对苯甲酸钠进行酸化[15]，由于盐酸具有挥发性，顶空萃取时，可能会将萃取纤维头溶胀，故选择不具有挥发性的硫酸来进行酸化。本研究考察了不同体积浓度为1 mol/L的硫酸溶液对苯甲酸钠的酸化效果，如图4所示，添加100 μL以上的硫酸溶液，苯甲酸钠转化为苯甲酸的量达到相对平衡，由于酸化的目的是将样品中的苯甲酸钠尽可能地转化为苯甲酸，添加硫酸需要过量，而同时又不能使样品的总体积有太大的变化，因此，选择添加200 μL浓度为1 mol/L的硫酸溶液进行酸化。

图4 硫酸对苯甲酸钠酸化效果的影响

2.4 方法验证

以苯甲酸对1，2-二氯苯的峰面积比值作为纵坐标，苯甲酸的浓度作为横坐标进行线性回归，结果表明苯甲酸质量浓度在0.5～20 mg/L时，回归方程为Y=0.4952X+0.2173（R2=0.9913），线性关系良好。根据3倍和10倍信噪比（S/N）分别计算检出限和定量限，在原料乳中检出限和定量限分别为0.2 mg/L和0.5 mg/L，与GB 5009.28-2016 相比[15]，检出限更低，灵敏度更高。

分别在原料乳样品中添加苯甲酸三个浓度水平的回收率实验，每份样品重复测定6次，平均回收率的计算方法为：（平均实测值－本底值）/加标质量浓度×100%，结果如表2所示。由表2可以看出，苯甲酸的平均回收率为83.2%～97.9%，相对标准偏差为4.8%～9.3%。

表2 苯甲酸在原料乳中的回收率和精密度实验（n=6）

2.5 实际样品的测定

按照本实验所建立的方法对17份收购的原料乳样品进行检测，结果显示苯甲酸在原料乳中存不同程度的残留，最高质量浓度达到13.2 mg/L，最低质量浓度为0.8 mg/L，含量小于1 mg/L的样品为2个，质量浓度在1～5 mg/L的样品为11个，质量浓度在5～10 mg/L的样品为3个，质量浓浓大于10 mg/L的样品为1个，分析抽检样品的结果，绝大多数的苯甲酸质量浓度都较低，基本排除人为在原料乳中添加苯甲酸及其钠盐的情况，而根据文献报道，当牛乳变质，导致酸度升高时，苯甲酸质量浓度可能会有所增加[8]。

3 结 论

采用固相微萃取和气质联用技术，以及添加1，2-二氯苯作为内标物，建立了原料乳中苯甲酸的检测方法。此方法前处理方式简单，无需采用有机溶剂提取，对环境和实验人员都具有保护作用，且采用质谱分析，对于目标物的定性确证更加准确，避免了误判的情况。同时本文还对原料乳样品进行抽样检测，检测结果可为今后的食品安全风险监测，以及原料乳中苯甲酸本底值的研究，提供参考依据。

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Determination of benzoic acid in raw milk by SPME-GC/MS

SHU Ping，ZHAO Haojun，XU Xing
(Dali Comprehensive Inspection Centre of Quality and Technical Supervision,Dali 671000,China)

TS252.7

A

1001-2230（2017）09-0057-03

2017-02-07

舒平（1975-），男，高级工程师，研究方向为食品质量安全检测。

徐幸