上海市犬类巴尔通体感染情况调查

陈琦 杜玉明 杨德全 杨君 袁聪俐 俞向前 周锦萍*

（1，上海市动物疫病预防控制中心 201103;2，上海交通大学农业与生物学院 200240;3，上海市浦东新区动物疫病预防控制中心 201200）

上海市犬类巴尔通体感染情况调查

陈琦1杜玉明2杨德全1杨君2袁聪俐2俞向前3周锦萍1*

（1，上海市动物疫病预防控制中心 201103;2，上海交通大学农业与生物学院 200240;3，上海市浦东新区动物疫病预防控制中心 201200）

为了解上海市犬类巴尔通体感染情况，根据已发表的巴尔通体保守基因序列合成1对PCR引物，对上海市6个区县采集149份犬全血样品进行检测。25份样品扩增出特异性条带，阳性率为16.78%，对阳性样品进行测序，证实为B.vinsoniiberkhoffii菌株。结果表明，上海市犬的中存在不同程度的巴尔通体感染情况。

犬;巴尔通体;感染;检测;上海市

巴尔通体（Bartonella）是由秘鲁科学家Alberto Barton在1909年从Oroya热病人的红细胞中发现的一种微生物,并于1913年正式命名为巴尔通体。巴尔通体属于细菌域（Bacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、 α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）、根瘤菌目（Rhizobiales）、巴尔通体科（Bartonellaceae）、巴尔通体属（Bartonella）。巴尔通体的宿主范围比较广泛,目前已发现确认的宿主或潜在宿主的有猫、犬、兔、牛和鼠以及野生动物如蝙蝠、美洲狮和狐狸等[1]。昆虫是大部分巴尔通体菌的传播媒介,如白蛉、虱、跳骚、蜱和螨虫等。目前已发现至少发现30个种及亚种,其中至少有9种对人有致病性。人类可能通过与携带巴尔通体的犬、猫接触或被跳蚤、虱子叮咬而感染[2]。随着城市犬、猫的增多,接触日益密切,了解城市犬中的巴尔通体感染状况具有一定的兽医公共卫生意义。

1 材料与方法

1.1 阳性对照菌株

巴尔通体标准菌株Bartonella henselae作为对照（来源于上海交通大学）。

1.2 样品采集与保存

2016年2月到2016年6月,在上海市6个区县,包括宝山区、虹口区、杨浦区、普陀区、浦东新区和崇明县,采集家养宠物犬和农村犬全血装于抗凝管中,共采集犬血液样本149份,置-70℃超低温冰柜保存。

1.3 样品核酸的提取

采用OMEGA公司的BloodDNA kit抽提血液样本中的DNA,具体步骤按试剂盒说明书进行。

1.4 检测引物及反应条件

通过查阅相关文献,找到巴尔通体基因组的保守基因RpoB,根据基因序列,利用Premier6.0设计一对引物RpoB Forwards和RpoB Rewards。 参见表1。

表1 PCR反应引物

根据2×HieffTMPfu Master Mix的说明书配制25μl反应体系, 反应条件是：95℃,2min； 95℃,10s； 60℃,20s；72℃,30s； 34cycles； 72℃,7min； 12℃保存。

1.5 遗传进化分析

对PCR阳性样本进行记录之后,再进行大体系扩增RpoB片段,对片段切胶回收之后,按照TA克隆的说明书构建TA克隆,鉴定出克隆阳性样品送测序,对测序结果进行BLAST分析,确定巴尔通体种属,利用软件MEGA7.0进行了进化关系的分析,构建进化树。

2 结果与分析

2.1 巴尔通体检测结果

PCR检测犬的血液样本149份,其中感染巴尔通体的阳性样本25份,总阳性率为16.78%。各区县的犬均有不同程度的感染情况,感染阳性率从6.67～23.53%。具体情况见表2。部分样品电泳图见图1。

2.2 遗传进化分析结果

在犬的血液样本检测过程中,我们将2份阳性PCR样品构建TA克隆之后送去上海铂尚生物公司测序。我们对测序结果进行分析,利用Clusta W进行序列比对,发现一株新的菌株,命名为Bartonella SH.CN strain1。利用Blast在线软件和MEGA7.0构建进化树（图2）。根据进化树结果,我们发现的这株巴尔通体菌与B.vinsoniiberkhoffii的同源性较高,所以Bartonella SH.CN strain1是B.vinsoniiberkhoffii菌株,是上海地区犬感染的主要的巴尔通体。

表2 巴尔通体感染状况检测结果

图1 部分样品的PCR电泳图

图2 进化树图谱

3 讨论

巴尔通体是一种人畜共患病病原大多数哺乳动物如犬科、猫科、啮齿类、反刍类等动物,包括人类都是不同亚种巴尔通体的宿主。巴尔通氏体感染后可以引起菌血症、淋巴结炎症、中枢神经系统紊乱、关节炎等症状[3]。对人类有致病性的巴尔通体主要有汉赛巴尔通体（B.henselae）、伊丽莎白巴尔通体（B.elizabethae）、克氏巴尔通体（B.clarridgeiae）、五日热巴尔通体（B.quintana)）等9种,可引起人类战壕热、猫抓病 (cat scratch diease,CSD)、卡瑞恩病、心内膜炎、菌血症和杆菌样血管瘤等疾病[4-5]。

犬类是巴尔通体的自然宿主,已被确认能够感染包括Bartonella vinsonii berkhoffii,Bartonella henselae,Bartonella clarridgeiae等在内的多种巴尔通体亚型。中国山东从犬中分离到B.vinsonii berkhoffi；美国在犬中检出2.2～8.7%抗体阳性,巴西在犬中检出1.0～5.9%抗体阳性；研究表明,狗抗体阳性率与虱子感染严重程度有关[6-7]。巴尔通体感染犬导致的疾病主要有心内膜炎、心律失常、心肌炎、肉芽肿性淋巴结炎等[8-9]。文章调查显示在心内膜炎患者的瓣膜中扩增出文森巴尔通体,证实文森巴尔通体对于人类是有致病性的,也证实犬科动物是文森巴尔通体特异性宿主[9-10]。

本文中各区县犬感染巴尔通体的阳性率为6.67～23.53%不等,而从样品来源上看,普陀区等3个中心城区的犬只均为家庭饲养的宠物犬,饲养管理条件较好,而其他3个区县的犬只均为散养农村犬,饲养管理条件较差,带有跳蚤等体外寄生虫的可能性较大,故阳性率明显高于另3个区。这提醒我们应加强犬只卫生条件及体表寄生虫的去除,从而减少巴尔通体的感染情况。

随着上海等大城市中宠物犬只的数量日益增多,宠物与人类的接触也日渐频繁,同时流浪犬猫的数量也在急剧增长,与犬猫相关人畜共患病发生的概率也越来越高,相关疫病也越来越引起人们注意,其城市公共卫生安全的意义得以日益凸显。

[1]栗冬梅.一群古老又新鲜的致病菌：巴尔通体[J].中国媒介生物学及控制杂志,2016,27(1):84-88.

[2]Hongkuan Deng,Danielle Le Rhun,Jean-Philippe R Buffet,et al.Strategies of exploitation of mammalian reservoirs by Bartonella species[J].Veterinary Research.2012,43(1):1-14

[3]EDWARD B B,DORSEY L K.Bartonella Infection in Animals: Carriership,ReservoirPotential, Pathogenicity,and Zoonotic Potential forHuman Infection[J].Clinical Microbiology Reviews,2000,13(3):428-438.

[4]Henri-Jean Boulouis,Chao-Chin Chang,Jennifer B.Henn,et al.Factors associated with rapid emergencr of zoonotic Bartonella[J].Veterinary Research,2005,36(3):383-410.

[5]Angelakis E,Pulcini C,Waton J,et al.Scalp eschar and neck lymphadenopathy caused by Bartonella henselae after Tick Bite[J].Clin Infect Dis.2010,50(4):549-551.

[6]栗冬梅,孟凤霞,宋秀平,等.从山东省家犬血液中分离出致病性巴尔通体--文森巴尔通体伯格霍夫亚种.中国流行病学杂志.2006,27(4):333-338.

[7]Brenner E C,Chomel B B,Singhasivanon O U,et al.Bartonella infection in urban and rural dogs from the tropics:Brazil,Colombia,Sri Lanka and Vietnam[J].Epidemiol Infect,2013,141(1):54-61.

[8]Breitschwerdt EB,Atkins CE,Brown TT,et al.Bartonella vinsonii subsp.Berkhoffii and related members of the alpha subdivision of the proteobacteria in dogs with cardiac arrhythmias,endocarditis or myocarditis[J].J Clin Microb,1999,37(11):3618-3626.

[9]Henn J B,Gabriel M W,Kasten R W,et al.Infective endocarditis in a dog and the phylogenetic relationship of the associat-ed-Bartonella rochalimae strain with isolates from dogs,gray foxes,and a human[J].Journal of clinical microbiology,2009,47(3):787-790.

[10]Boulouis HJ,Chang CC,Henn JB,et al.Factors associated with the rapid emergence of zoonotic Bartonella infections.Vet Res,2005,36(3):383-410.

上海市市级农口系统青年人才成长计划 〔沪农青字（2015）第2-5号〕。

陈琦（1979-），男，汉族，湖南省攸县人，硕士，兽医师，研究方向：预防兽医学。

*为通讯作者。