3种Dawson型杂多酸对酪氨酸酶的抑制作用

谢乐芳，李莉莉，陈丙年，王力，*

（1.集美大学食品与生物工程学院，福建厦门361021；2.厦门大学附属中山医院演武分院，福建厦门361005）

3种Dawson型杂多酸对酪氨酸酶的抑制作用

谢乐芳1，李莉莉1，陈丙年2，王力1，*

（1.集美大学食品与生物工程学院，福建厦门361021；2.厦门大学附属中山医院演武分院，福建厦门361005）

合成3种Dawson型杂多酸H8[P2Mo17Zn（OH2）O61]、H8[P2Mo17Cu（OH2）O61]和H7[P2Mo17Fe（OH2）O61]（分别简写为P2Mo17Zn、P2Mo17Cu和P2Mo17Fe），并用红外和紫外光谱进行结构表征。进而用酶动力学方法研究3种化合物对酪氨酸酶二酚酶的抑制作用（包括抑制效果、抑制机理、抑制类型）。结果表明：P2Mo17Zn、P2Mo17Cu和P2Mo17Fe 3种化合物对酪氨酸酶二酚酶均有明显的抑制效果，对应的IC50值分别为0.346 2、0.361 5、0.383 1 mmol/L。3种化合物均属于可逆竞争型，抑制常数KI分别为0.106 8、0.068 2、0.057 2 mmol/L。综合比较，3种化合物的抑酶效果依次是P2Mo17Zn＞P2Mo17Cu＞P2Mo17Fe。

酪氨酸酶；抑制作用；杂多酸；酶动力学

Abstract：Three kinds of Dawson-type heteropoly acids H8[P2Mo17Zn（OH2）O61]，H8[P2Mo17Cu（OH2）O61]and H7[P2Mo17Fe（OH2）O61]were synthesised（abbreviated as P2Mo17Zn，P2Mo17Cu and P2Mo17Fe）.The structures of these compounds were characterized by the UV and IR spectroscopy.And then these compounds'inhibitory effect on tyrosinase were studied by enzyme kinetic method （including inhibition effects，inhibition mechanism and inhibition type）.The results showed that three compounds had obvious inhibitory effects on tyrosinase，and the IC50values of P2Mo17Zn，P2Mo17Cu and P2Mo17Fe were 0.346 2，0.361 5 and 0.383 1 mmol/L，respectively.Moreover，the three kinds of compounds were reversible competitive inhibitiors，and their inhibition constants（KI）were 0.106 8，0.068 2 and 0.057 2 mmol/L，respectively.Comprehensive comparison，the order of the inhibiting ability of three kinds of compounds on tyrosinase was P2Mo17Zn＞P2Mo17Cu＞P2Mo17Fe.

Key words：tyrosinase；inhibitory effect；heteropoly acid；enzyme kinetic method

酪氨酸酶（tyrosinase，EC 1.14.18.1）结构复杂，含有多个亚基，其活性中心含有铜离子，是一种氧化还原酶[1-3]。微生物、动植物以及人体中都分布有酪氨酸酶，它是生物体合成黑色素的关键限速酶，兼具单酚酶和二酚酶活性[4-6]：催化L-酪氨酸羟基化为L-多巴和氧化L-多巴形成多巴醌[3-4，7-8]，多巴醌经进一步复杂反应生成黑色素。而黑色素的过量表达则会引起色素沉着等相关疾病[1-2，8]和果蔬的酶促褐变，严重影响美观和经济效益。因此通过抑制酪氨酸酶活性来控制黑色素的生成量，进而治疗或防止色素沉着和延缓酶促褐变的研究也越来越多[7]。目前，抑制酪氨酸酶活性的研究主要集中在天然提取物[5，7-11]、人工合成的有机化合物[2-3，6，11-13]以及少量的无机化合物[14]。因此，研发和寻找高效无毒、特异性强的酪氨酸酶抑制剂已成为医药、农学、食品等领域的研究热点[5]。

多金属氧酸盐（Polyoxometalates，简写为 POMs），是一类分子金属氧化物，具有结构多样性和特殊的物理化学性质，在催化、分子基功能材料、磁性分子、仿生学和多功能材料[15]方面已经有广泛的应用。尤其是，多金属氧化簇能够接受额外的电子进行可逆的氧化还原反应，同时保持结构不变[16]。这些性质使其能够成为具有吸引力的氧化还原催化剂，作为分子材料和设备的功能单位[17]。不仅如此，许多研究发现多金属氧酸盐可能成为潜在的有效酶抑制剂[18-19]。为此，本实验室对多金属氧酸盐用于抑制酪氨酸酶活性进行了研究，发现Keggin型多金属氧酸盐对酪氨酸酶具有很好的抑制作用[20-25]，为进一步研究其他类型多酸对酪氨酸酶的抑制作用，对Dawson型多酸的抑酶效果进行研究，以期研制出更新颖、更安全有效的酪氨酸酶抑制剂，为扩展多金属氧酸盐的应用以及果蔬保鲜甚至色素沉着性疾病的治疗提供有用信息。因此，本文按照文献方法合成并研究了 H8[P2Mo17Zn（OH2）O61]、H8[P2Mo17Cu（OH2）O61]和H7[P2Mo17Fe（OH2）O61]（分别简写为P2Mo17Zn、P2Mo17Cu和P2Mo17Fe）对酪氨酸酶的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

H8[P2Mo17Zn（OH2）O61]、H8[P2Mo17Cu（OH2）O61]和 H7[P2Mo17Fe（OH2）O61]按文献方法自行合成，用红外、紫外光谱进行结构表征[26-28]；酪氨酸酶（2 687 U/mg）、L-3，4-二羟基苯丙氨酸（L-DOPA）、二甲基亚砜（DMSO）：Sigma-Aldrich化学公司；其它试剂均为分析纯；实验用水均为超纯水。

Cintra 2020型紫外-可见分光光度计：澳大利亚GBC仪器公司；Nicolet Avatar 330型傅立叶变换红外光谱仪：美国Thermo Electron公司。

1.2 方法

1.2.1 二酚酶抑制活性测定

根据文献[29]对酪氨酸酶活力进行测定，原理是基于L-DOPA经酪氨酸酶催化生成的黑色素在475 nm处有最大吸收峰，吸收系数ε=3 700 L/（cm·mol）。在1 cm比色皿中，临时配制3 mL NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液（50 mmol/L，pH=6.8）测活体系：首先加入 0.1 mL不同浓度的抑制剂（溶于DMSO，终浓度为3.33%），然后加入2.8 mL经30℃水浴10 min的0.5 mmol/L的多巴底物，最后加入0.1 mL酪氨酸酶溶液（对照组为0.1 mL DMSO），立即混匀，测定反应体系的吸光度值随时间变化的曲线，根据直线的斜率计算酶活力。

1.2.2 二酚酶抑制活性的动力学分析

运用上述3 mL测活体系，改变加入的酶量和抑制剂量，测定反应体系的酶活力，从而判定抑制剂对酪氨酸酶的抑制机理。通过改变加入的底物浓度，测定不同浓度抑制剂作用下的酪氨酸酶活力，经Lineweaver-Burk作图，以所得直线的斜率和Y轴的截距分别对抑制剂浓度进行二次作图，可求得抑制剂常数KI（游离酶）和KIS（酶－底物络合物），从而判断抑制剂对酪氨酸酶的抑制类型[22]。

1.3 数据统计与分析

采用Origin 8.0统计分析软件进行数据整理和分析，用SPSS17.0软件进行统计学显著性分析，显著差异水平：显著（P＜0.05）；极显著（P＜0.01）。

2 结果与分析

2.1 抑制剂的光谱表征

用红外光谱和紫外光谱对化合物进行结构表征，P2Mo17Zn、P2Mo17Cu和 P2Mo17Fe的红外谱图（图 1）和紫外谱图（图2）如图所示。

图1 P2Mo17Zn（A）、P2Mo17Cu（B）和P2Mo17Fe（C）的红外谱图Fig.1 IR spectrum of P2Mo17Zn（A），P2Mo17Cu（B）and P2Mo17Fe（C）

从红外谱图可以看出，在4 000 cm-1～400 cm-1范围内可以观察到有Dawson结构的特征吸收峰，以P2Mo17Fe为例：3 429.0 cm-1是水分子的弯曲振动、1 618.0 cm-1是O-H伸缩振动、1 062.5 cm-1对应P-Oa键反对称伸缩振动、954.5 cm-1对应Mo-Od键反对称伸缩振动、871.5 cm-1对应Mo-Ob键反对称伸缩振动、790.5 cm-1对应Mo-Oc键反对称伸缩振动。P2Mo17Zn和P2Mo17Cu在对应的波数范围内也出现了相应的特征吸收峰，与参考文献相符[26-27]。

图 2 P2Mo17Zn（A）、P2Mo17Cu（B）和 P2Mo17Fe（C）的紫外谱图Fig.2 UV spectrum of P2Mo17Zn（A），P2Mo17Cu（B）and P2Mo17Fe（C）

由图2可看出，P2Mo17Zn、P2Mo17Cu和 P2Mo17Fe的紫外谱图均在213 nm波长附近出现了强的吸收峰，对应于Dawson型结构多酸的特征吸收峰，与参考文献相符[26-27]，说明所合成的化合物确实为Dawson型多酸。

2.2 抑制剂对酪氨酸酶二酚酶抑制活性的影响

P2Mo17Zn（A）、P2Mo17Cu（B）和 P2Mo17Fe（C）对酪氨酸酶的抑制效果如图3所示。

图3 P2Mo17Zn（A）、P2Mo17Cu（B）和P2Mo17Fe（C）对酪氨酸酶的抑制效果Fig.3 Inhibitory effects of P2Mo17Zn（A），P2Mo17Cu（B）and P2Mo17Fe（C）on tyrosinase

分别以P2Mo17Zn、P2Mo17Cu和P2Mo17Fe为抑制剂，研究其对酪氨酸酶二酚酶催化L-DOPA生成黑色素的活力的影响，由图3可看出，随着抑制剂浓度的增大，酪氨酸酶的相对酶活力不断下降，存在明显的剂量效应，说明P2Mo17Zn、P2Mo17Cu和P2Mo17Fe 3种化合物对酪氨酸酶均有明显的抑制效果。根据抑制曲线可得导致酶活力下降50%时P2Mo17Zn、P2Mo17Cu和P2Mo17Fe的浓度（IC50）分别为 0.346 2、0.361 5、0.383 1 mmol/L，表明3种化合物对酪氨酸酶确实有明显的抑制作用，且P2Mo17Zn对酪氨酸酶的抑制效果优于P2Mo17Cu，P2Mo17Cu优于P2Mo17Fe。

2.3 抑制剂对酪氨酸酶二酚酶的抑制机理

分别以不同浓度的P2Mo17Zn、P2Mo17Cu和P2Mo17Fe为抑制剂，改变加入的酶量，测定不同浓度抑制剂作用下酪氨酸酶的酶活力，结果如图4所示。

由图4可以看出，以酶活力对加入的酶量作图，得到的一组直线均经过原点，且随着抑制剂浓度的增加，直线斜率不断减小，说明3种化合物对酪氨酸酶进行可逆抑制，即3种化合物均是与酶进行非共价可逆结合，从而降低酪氨酸酶的活力。

图 4 P2Mo17Zn（A）、P2Mo17Cu（B）和 P2Mo17Fe（C）对酪氨酸酶二酚酶抑制机理的测定Fig.4 Inhibitory mechanism of P2Mo17Zn（A），P2Mo17Cu（B）and P2Mo17Fe（C）on tyrosinase

2.4 抑制剂对酪氨酸酶二酚酶的抑制类型及其抑制常数

在3 mL 50 mmol/L的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液（pH=6.8）测活体系中，通过改变加入的底物和抑制剂浓度，测定不同浓度抑制剂作用下酪氨酸酶酶活力，结果如图5所示。

图 5 P2Mo17Zn（A）、P2Mo17Cu（B）和 P2Mo17Fe（C）对酪氨酸酶二酚酶抑制类型及其抑制常数的测定Fig.5 Inhibitory types and the inhibitory constants of P2Mo17Zn（A），P2Mo17Cu（B）and P2Mo17Fe（C）on tyrosinase

通过Lineweaver-Burk双倒数作图，得到一组相交于一点的直线，交点非常接近Y轴，并且随着抑制剂浓度的增加，直线斜率增大，米氏常数Km值增大，由此判断3种化合物对酪氨酸酶的抑制类型为竞争型，即抑制剂与底物竞争酪氨酸酶的活性结合位点。进一步以直线的斜率对抑制剂的浓度作图，从图中可计算得到3种化合物对酪氨酸酶游离酶的抑制常数KI分别为 0.106 8、0.068 2、0.057 2 mmol/L（见图 5插图）。

3 结论

通过酶动力学方法研究3种不同过渡金属取代的Dawson型磷钼酸对酪氨酸酶二酚酶的抑制效果、机理以及类型。结果表明：3种化合物对酪氨酸酶均有明显的抑制作用（与经典酪氨酸酶抑制剂熊果甙IC50=5.30 mmol/L[30]比较），其 IC50分别为 0.346 2、0.361 5、0.383 1 mmol/L。3种化合物对酪氨酸酶的抑制均属于可逆竞争型抑制，抑制常数KI分别为0.106 8、0.068 2、0.057 2 mmol/L。综合比较，P2Mo17Zn对酪氨酸酶的抑制作用优于其他两种化合物。因此，本试验可能为研制出更新颖、更安全有效的酪氨酸酶抑制剂，为扩展多金属氧酸盐的应用以及果蔬保鲜甚至色素沉着性疾病的治疗提供有用信息。

[1]陈清西,林建峰,宋康康.酪氨酸酶抑制剂的研究进展[J].厦门大学学报(自然科学版),2007,46(2):274-282

[2]Tang J,Liu J,Wu F.Molecular docking studies and biological evaluation of 1,3,4-thiadiazole derivatives bearing Schiff base moieties as tyrosinase inhibitors[J].Bioorganic Chemistry,2016,69:29-36

[3]Liu J,Cao R,Yi W,et al.A class of potent tyrosinase inhibitors:Alkylidenethiosemicarbazide compounds[J].European Journal of Medicinal Chemistry,2009,44(4):1773-1778

[4]胡泳华,贾玉龙,陈清西.酪氨酸酶抑制剂的应用研究进展[J].厦门大学学报(自然科学版),2016,55(5):760-768

[5]关天旺,杨航,刘嘉煜,等.龙眼核多酚提取物对酪氨酸酶抑制作用的研究[J].食品研究与开发,2016,37(17):15-20

[6]Lee S Y,Baek N,Nam T G.Natural,semisynthetic and synthetic tyrosinase inhibitors[J].Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry,2016,31(1):1-13

[7]傅佳愈,杨远帆,倪辉,等.茶花粉提取物对酪氨酸酶的抑制作用[J].中国食品学报,2015,15(7):66-72

[8]Di Petrillo A,González-Paramás A M,Era B,et al.Tyrosinase inhibition and antioxidant properties of Asphodelus microcarpus extracts[J].BMC Complementary and Alternative Medicine,2016,16(1):453-461

[9]徐莉,李彩霞,宋海,等.绿茄叶黄酮的响应面优化提取及其对酪氨酸酶的抑制作用[J].中兽医医药杂志,2016,35(5):8-13

[10]陈怡,梁伟,郑思琦,等.茯苓三萜类化合物对酪氨酸酶的抑制作用[J].新经济,2016(Z1):156

[11]程水明,雷霄宇,刘冰洁,等.茯苓皮三萜抑制酪氨酸酶机理研究[J].食品研究与开发,2016,37(9):18-22

[12]王庆华,何云,王晓艺.复合抑制剂对酪氨酸酶反应动力学的影响[J].食品研究与开发,2015,36(19):36-40

[13]苏明星,王伟,唐建阳.庚酸-3,4-二羟基苯酯和3,4-二羟基苯甲酸己酯对蘑菇酪氨酸酶抑制效应[J].中国食品学报,2011,11(2):42-46

[14]李莉莉,邢蕊,邓阳阳,等.酪氨酸酶抑制剂的研究新进展[J].食品工业,2016,37,(8):235-239

[15]Nie Y,Chen W,Liu Z,et al.Synthesis and photocatalytic hydrogen evolution activity of three Keggin-type polyoxometalates with different central atoms[J].Inorganic Chemistry Communications,2015,61:184-186

[16]Li N,Sun Z,Liu R,et al.Enhanced power conversion efficiency in phthalocyanine-sensitized solar cells by modifying TiO2photoanode with polyoxometalate[J].Solar Energy Materials and Solar Cells,2016,157:853-860

[17]Zhang S,Liu L,Li F,et al.Synthesis,characterization and photoelectric properties of Dawson-type polyoxometalate covalently linked to zinc(II)porphyrin[J].Inorganica Chimica Acta,2016,453:179-185

[18]Sun X,Wu Y,Gao W,et al.CD39/ENTPD1 Expression by CD4+Foxp3+RegulatoryTCellsPromotesHepaticMetastaticTumorGrowth in Mice[J].Gastroenterology,2010,139(3):1030-1040

[19]Fraqueza G,Ohlin C A,Casey W H,et al.Sarcoplasmic reticulum calcium ATPase interactions with decaniobate,decavanadate,vanadate,tungstate and molybdate[J].Journal of Inorganic Biochemistry,2012,107(1):82-89

[20]Xing R,Wang F,Dong L,et al.Inhibitory effects of Na7PMo11CuO40on mushroom tyrosinase and melanin formation and its antimicrobial activities[J].Food Chemistry,2016,197:205-211

[21]Chen B,Xing R,Wang F,et al.Inhibitory effects of α-Na8SiW11CoO40on tyrosinase and its application in controlling browning of freshcut apples[J].Food Chemistry,2015,188:177-183

[22]Xing R,Zheng A,Wang F,et al.Functionality study of Na6PMo11FeO40as a mushroom tyrosinase inhibitor[J].Food Chemistry,2015,175:292-299

[23]邢蕊,郑阿萍,王芳,等.钒取代的多酸盐对酪氨酸酶抑制机理的研究[J].分子科学学报,2015,31(5):436-440

[24]郑阿萍,陈丙年,陈发河,等.钒取代硅钨氧酸盐对酪氨酸酶的抑制作用[J].应用化学,2013,30(2):165-170

[25]郑阿萍,王芳,邢蕊,等.两种多酸型酪氨酸酶抑制剂的性能研究[J].高等学校化学学报,2014,35(3):476-481

[26]高丽华,赵月,赵慧珍,等.Dawson结构钼磷过渡元素三元杂多酸稳定性的研究[J].哈尔滨师范大学自然科学学报,1993,9(2):52-56

[27]王恩波,高丽华,刘景福,等.具有Dawson结构的钼钒磷杂多酸的制备和性质研究[J].化学学报,1988(8):757-762

[28]Jing S,Wang Z,Zhu W,et al.Oxidation of cyclohexane with hydrogen peroxide catalyzed by Dawson-type vanadium-substituted heteropolyacids[J].Reaction Kinetics,Mechanisms and Catalysis,2006,89(1):55-61

[29]Hu Y,Zhuang J,Yu F,et al.Inhibitory effects of cefotaxime on the activity of mushroom tyrosinase[J].Journal of Bioscience and Bioengineering,2016,121(4):385-389

[30]宋康康,邱凌,黄璜,等.熊果甙作为化妆品添加剂对酪氨酸酶抑制作用[J].厦门大学学报(自然科学版),2003,42(6):791-794

The Inhibition of Three Kinds of Dawson-type Heteropoly Acids on Tyrosinase

XIE Le-fang1，LI Li-li1，CHEN Bing-nian2，WANG Li1，*
（1.Food and Bioengineering College of Jimei University，Xiamen 361021，Fujian，China；2.YanWu Affiliated Hospital of Zhongshan Hospital Xiamen University（Xiamen University Hospital），Xiamen 361005，Fujian，China）

2017-01-16

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.038

国家自然科学基金项目（21371072）

谢乐芳（1992—），女（汉），在读硕士研究生，研究方向：生物学。

*通信作者：王力，教授，博士，研究方向：多酸化学。