SERS检测三聚氰胺的不确定度分析

刘晓莹，郑大威，张萍，*，师炜，林太凤，王惠琴，曹智

（1.北京工业大学生命科学与生物工程学院，北京100124；2.北京市密云区食品药品监督管理局，北京 101500）

SERS检测三聚氰胺的不确定度分析

刘晓莹1，郑大威1，张萍1，*，师炜2，林太凤1，王惠琴1，曹智1

（1.北京工业大学生命科学与生物工程学院，北京100124；2.北京市密云区食品药品监督管理局，北京 101500）

不确定度是一类表征测试结果可靠性的重要参数，对于规范试验操作具有重要意义。表面增强拉曼光谱技术（surface enhanced Raman spectroscopy，SERS）作为一种用于物质定性和半定量分析的分子振动光谱，具有快速、简便和灵敏度高等特点，在食品安全与质量控制领域中广泛应用。利用SERS技术对三聚氰胺进行测定试验，并对该方法的不确定度进行分析。经辨识，确认715 cm-1处的峰为三聚氰胺的特征峰，该峰的峰强与三聚氰胺的浓度呈正相关。选取675 cm-1处的峰为内标峰，在0.1 μg/mL～5.0 μg/mL范围内，以I715/I675和浓度为参数进行线性回归分析。标准方程相关系数达到0.995 4，该方法的检出限为0.068 6 μg/mL。围绕标准工作曲线的建立，分析SERS测定三聚氰胺结果的不确定度来源并对其进行评定。通过不确定度分析，为确保测定结果的可比性与溯源性提供了参考价值。

表面增强拉曼光谱；三聚氰胺；不确定度

Abstract：Uncertainty is a class of important parameters to represent the reliability of the measurement results.It has an important significance to standardize the experimental operation.Surface enhanced Raman spectroscopy（SERS）is a molecular vibrational spectroscopy for both qualitative and semi-quantitative detection of analytes.Recently，SERS had been widely used in the food safety and quality control areas owning to its several merits of fast detection，simple sample preparation，high sensitivity，etc.The quantitative detection of melamine had been established using SERS，and the uncertainty of SERS method had been analyzed meanwhile.Melamine showed the characteristic Raman peak at 715 cm-1steadily when mixed with Au nanoparticles.And the peak intensity of 715 cm-1had a positive relationship with the concentration of melamine.Taken 675 cm-1as the internal standard peak，there was a linear regression between I715/I675and the concentration of melamine in the range of 0.1 μg/mL-5.0 μg/mL.The correlation coefficient was 0.995 4，and the detection limit reached 0.068 6 μg/mL.The major uncertainty of SERS method was calculated and which mainly arise from the establishing of the standard curve by the least square method.Uncertainty analysis of SERS method would be benefit for the comparability and traceability of the measurement results.

Key words：surface enhanced Raman spectroscopy；melamine；uncertainty

近年来，食品污染事件频发，严重威胁着人类的身体健康。为了满足现场快速检测的需求，各种快速检测方法在逐步建立。表面增强拉曼光谱技术（surface enhanced Raman spectroscopy，SERS）是指吸附在粗糙化金属表面的待测样品的拉曼信号显著增强的一种拉曼技术[1]。因其具有快速、简便、可实现无损检测等特点，在食品领域中广泛地应用于添加剂[2-5]、农兽药残留[6-8]及食品微生物污染[9-11]等方面的检测。2008年突发三聚氰胺事件之后，有关部门调查发现，在许多食品中都出现了三聚氰胺非法添加现象。针对这一现象，已经有学者利用SERS技术建立三聚氰胺的快速检测方法。陈安宇等[12]第一个采用增强拉曼检测技术实现牛奶中三聚氰胺的快速检测；徐晨曦[13]、汤俊琪[14]等也进行了相关方面的研究。程劼等[15]应用SERS技术，在5 min内实现对宠物饲料中三聚氰胺的快速检测，发现在55个批次宠物饲料中，有7个含量超标的样品，与传统的气相色谱质谱联用法（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法相比，结果准确可靠。Cheng等[16]在30 min内实现对鸡蛋中三聚氰胺污染的SERS检测，为蛋制品的质量控制及市场流通监控提供可能。Mecker等[17]使用便携式拉曼光谱仪测定7种食品中非法添加的三聚氰胺，在无需复杂的样品处理前提下，实现对食品中非法添加三聚氰胺的现场快速鉴别。他们的研究为保障食品安全建立各类食品中三聚氰胺SERS检测方法，但对保证测定结果可靠性的不确定度没有进一步分析。

1978年由国际计量局提出不确定度概念，其意义是指与测量结果相关联的，表征合理地赋予被测量之值的分散性的参数[18]，主要通过测定数据与已有信息来进行计算，具有可操作性，现多用于保证测定结果的可比性和溯源性[19]。不确定度分析对于物质测量至关重要，目前我国已经出台相关政策，要求实验室在物质测量方面进行不确定度分析[20]。在三聚氰胺检测方面的不确定度分析，主要是针对于液相色谱方法[21]进行的，而对SERS检测方面的研究比较少。本文根据国家技术监督局发布的JJF1059-2012《测量不确定度评定与表示》[18]，讨论应用SERS方法检测三聚氰胺过程中多种因素的不确定度，在实际工作中具有较高的参考价值。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

CAS108-78-1三聚氰胺标准品（纯度99%）：sigma；AL204 电子天平：Mettler Toledd 公司；JW-1 型号便携式拉曼光谱仪：北京芥微科技有限公司；超声波清洗机：昆山市超声仪器有限公司；UH4150紫外可见近红外分光光度计：日本日立公司；动态光散射粒度仪：法国Cordouan公司。

1.2 三聚氰胺标准溶液的配制

配制过程见图1。准确称取0.010 0 g三聚氰胺标准品于容量瓶中，用超纯水制成1 000 μg/mL母液。准确吸取1 mL母液于100 mL容量瓶中，用超纯水制得10 μg/mL标准储备液。用10 μg/mL标准储备液配制出5.0、2.0、1.0、0.5、0.1 μg/mL 的标准工作液。配制过程中使用的10 mL和100 mL A级单标线容量瓶和1、2、5 mL A级分度吸管，均来自于BOMEX公司。

图1 三聚氰胺标准溶液配制过程示意图Fig.1 Preparation process of melamine standard solution

1.3 纳米金溶胶的合成

参考Lee等[22]的文献研究，本试验采用柠檬酸钠还原法合成SERS检测用纳米金溶胶。合成的纳米金溶胶，呈红棕色，紫外可见最大吸收峰在532 nm左右，平均粒径为45 nm。

1.4 SERS检测及数据分析

便携式拉曼光谱仪（长宽高为45 cm×30 cm×20 cm）的检测条件：激发光波长为785 nm，200 mW，扫描光谱范围为 400 cm-1～1 800 cm-1，分辨率为 2 cm-1，积分时间为10 s，每个样品重复扫描3次取平均值。取100 μL合成的金纳米溶胶至样品瓶内，再取10 μL样品与其混匀后，立即检测。利用便携式拉曼光谱仪自带软件对原始图谱进行基线校正、峰形拟合等预处理，以特征峰和内标峰的峰强比与质量浓度作线性拟合。数据处理及绘图分别用GraphPad 5.0或Origin 8.0软件进行。

2 结果与讨论

2.1 三聚氰胺SERS图谱及标准曲线的建立

不同质量浓度的三聚氰胺标准溶液经过基线校正的SERS原始图谱见图2。

由图2（a）中可以看出，715 cm-1为三聚氰胺的特征峰，为三聚氰胺的环面内变形振动，其峰强度会随着质量浓度的增加而逐渐增强。选取675 cm-1作为内标峰，以 I715/I675峰强比作线性拟合（见表1），图 2（b）为计算得到I715/I675峰强比与质量浓度间的标准曲线。标准方程为 y=（0.816 8±0.154）x+（0.481 9±0.037 9），在0.1 μg/mL～5.0 μg/mL 内，其相关系数 r2=0.995 4。对标准方程进行显著性检验，在显著水平0.01下，计算得到P＜0.000 1，说明三聚氰胺的I715/I675峰强比与浓度间线性关系极显著相关。

图2 三聚氰胺标准溶液的SERS图谱及标准曲线Fig.2 SERS spectra of melamine solution and standard curve

利用检出限、精密度与准确度3个指标分别对检测方法进行评价。检出限主要是通过CL=KiSi公式[23]进行计算，式中Ki为置信因子，一般取值为3；Si为重复测量10次同一份浓度接近于空白值的标准溶液的标准偏差。本试验用水配制三聚氰胺标准溶液，通过对溶剂重复测定10次，计算得到该方法的检出限CL为0.068 6μg/mL。

精密度一般用相对标准偏差RSD[23]来表示，其公式为，式中：s为方法的标准偏差；Xi为第i次测定值；X为n次测定值的平均值；n为测定次数。通过对1.0 μg/mL三聚氰胺水溶液重复测定10次，计算得到该方法的RSD为0.126。

2.2 不确定度来源的评定

利用便携式拉曼光谱仪进行三聚氰胺的SERS检测过程中，主要是从三聚氰胺母液的配制、标准工作溶液的配制以及标准工作曲线线性拟合等方面引入不确定度。

2.2.1 配制母液产生的相对标准不确定度u1rel（X）[24]

配制母液产生的相对标准不确定度u1rel（X）主要包括标准品纯度产生的相对标准不确定度u11rel（X）、称量标准品产生的相对标准不确定度u12rel（X）和母液定容体积产生的相对标准不确定度u13rel（X）三部分。

2.2.1.1 标准品纯度产生的相对标准不确定度u11rel（X）

三聚氰胺的纯度≥99%，不确定度半宽a1=1%，可认为服从均匀分布，所以

其相对标准不确定度为

2.2.1.2 称量标准品产生的相对标准不确定度u12rel（X）

称量标准品时，使用的是分辨率为0.1 mg的电子天平，检定证书中表明该天平的最大允许误差为±0.1mg，采用均匀分布，所以

称取三聚氰胺标准品的重量为10.0 mg，相对标准不确定度为

2.2.1.3 母液定容体积产生的相对标准不确定度u13rel（X）

1）容量瓶校准产生的标准不确定度u13-1（X）

根据JJG196-2006《常用玻璃量器检定规程》[25]，10 mL容量瓶的容量允许误差为0.020 mL，则：u13-1（X）=

2）容量瓶定容温度与校准温度不同产生的标准不确定度u13-2（X）

容量瓶的校准温度为20℃，定容时假定实验室温度在（20±5）℃范围内，水的膨胀系数为2.1×10-4/℃，则温度变化引起的体积变化范围为u13-2（X）=±5℃×

假定其为均匀分布，则定容母液时产生的标准不确定度为

其相对标准不确定度为

综上分析，配制母液产生的相对标准不确定度为

2.2.2 配制标准工作溶液产生的相对标准不确定度u2rel（X）

配制工作液的过程中用到1、2、5 mL的A级分度吸管、10 mL和100 mL的A级容量瓶，其允许误差分别为 0.008、0.012、0.025、0.020、0.10 mL。

试验过程中用到的6个10mL容量瓶和1个100 mL容量瓶，按均匀分布考虑，，则单个10 mL和100mL容量瓶的标准不确定度分别为0.012 mL和，相对标准不确定度梯度稀释中使用的1、2、5 mL分度吸管，按三角分布考虑，，则单个1、2、5 mL分度吸管的标准不确定

2.2.3 标准工作曲线线性产生的相对标准不确定度

表1 标准曲线数据集Table 1 The dataset of the standard curve

对表1采用最小二乘法分析，得到标准工作曲线线性方程：y=（0.816 8±0.015 4）x+（0.481 9±0.037 9），其相关系数r2=0.995 4。

一份三聚氰胺样液平行测定两次，其计算得到的所得到的I715/I675分别为y1=1.378 7和y2=1.329 7，利用拟合得到的标准工作曲线计算得到三聚氰胺的浓度x分别为1.098 μg/mL和1.038 μg/mL，平均值=1.068 μg/mL。由最小二乘法拟合标准曲线所引入的标准不确定度为

标准曲线数据集见表1。表1中的y为计算得到的不同质量浓度下三聚氰胺标准溶液的I715/I675，每个质量浓度重复测定3次。度为

标准工作液稀释过程中，用1 mL分度吸管移取1 mL溶液共4次，其引入的相对标准不确定度为

用5 mL分度吸管移取5 mL溶液共1次，其引入的相对标准不确定度为

用2 mL分度吸管移取2 mL溶液共1次，其引入的相对标准不确定度为

综上分析，配制标准工作溶液产生的相对标准不确定度为

式中：X0为三聚氰胺样液的浓度；Xi为拟合工作曲线的第i个标准溶液浓度；a为拟合工作曲线的斜率；b为拟合工作曲线的截距；P为样品平行测定次数，P=2；n为标准曲线测定总次数，每个标准溶液测定3次为参与拟合标准曲线的三聚氰胺标准溶液的平均浓度；yi为第i次标准溶液计算得到的I715/I675峰强比。

将各参数代入以上两个公式中，得到s=0.1030，标准不确定度u3（X）=0.0972，由标准工作曲线计算的三聚氰胺溶液相对标准不确定度为0.0565。

2.2.4 扩展不确定度

各分量的相对标准不确定度见表2。

表2 各分量的相对标准不确定度Table 2 The relative standard uncertainty of each component

SERS测定三聚氰胺含量的相对合成标准不确定度为

取k=2、置信水平为95%的条件下，其相对扩展不确定度为

利用SERS技术测定1份未知浓度的三聚氰胺样品，经计算得到该样品的I715/I675为1.354 2，根据标准曲线估算其浓度为1.068 μg/mL，则其扩展不确定度为U（X）=Urel（X）×1.068=0.123 1 μg/mL。说明在95%的置信水平下，利用SERS测定该三聚氰胺样品，其浓度为0.944 9 μg/mL～1.191 1 μg/mL。

3 结论

本文利用SERS方法对三聚氰胺进行检测，并对不确定度进行了分析。该方法结果准确，满足食品领域中快速检测的需求；通过不确定度分析，表征测定结果的可靠性，发现配制标准工作液和确定标准工作曲线是产生不确定度的主要来源。因此在试验过程中，应严格规范操作、增加测试数据量，以减小误差对测定结果造成的影响。

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Uncertainty Analysis of SERS Determination of Melamine

LIU Xiao-ying1，ZHENG Da-wei1，ZHANG Ping1，*，SHI Wei2，LIN Tai-feng1，WANG Hui-qin1，CAO Zhi1
（1.College of Life Science and Bioengineering，Beijing University of Technology，Beijing 100124，China；2.Food and Drug Administration of Beijing Miyun District，Beijing 101500，China）

2017-01-22

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.035

刘晓莹（1993—），女（汉），硕士研究生，研究方向：生物医学工程。

*通信作者：张萍，副教授，博士，研究方向：拉曼光谱快速检测。