系统性红斑狼疮小鼠IL-22细胞因子的表达及其意义*

王园园，赵令，刘涛，马红爽，姜振宇

（吉林大学第一医院 风湿科，吉林 长春 130021）

系统性红斑狼疮小鼠IL-22细胞因子的表达及其意义*

王园园，赵令，刘涛，马红爽，姜振宇

（吉林大学第一医院 风湿科，吉林 长春 130021）

目的对系统性红斑狼疮小鼠白细胞介素22（IL-22）细胞因子的表达情况进行研究，探讨IL-22在系统性红斑狼疮发病中的意义。方法将80只小鼠随机分为系统性红斑狼疮组和对照组，每组各40只。系统性红斑狼疮组小鼠经尾静脉注射活化的脾细胞复制系统性红斑狼疮模型，对照组小鼠经尾静脉注射等量的生理盐水。比较模型复制后第4周和第8周时两组小鼠肾脏HE染色、血清抗双链DNA抗体滴度、血清IL-22水平、肾脏组织和淋巴组织IL-22 mRNA表达、肾脏和淋巴结组织中IL-22蛋白的表达。结果系统性红斑狼疮组小鼠肾小管上皮细胞变性，肾间质内见大量炎症细胞浸润，肾小球系膜细胞增生，对照组小鼠肾脏组织形态正常。系统性红斑狼疮组小鼠第4周和第8周时血清抗双链DNA抗体滴度与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），系统性红斑狼疮组高于对照组。系统性红斑狼疮组复制模型第4周和第8周时小鼠血清IL-22和对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；肾脏组织IL-22 mRNA水平与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；淋巴组织IL-22 mRNA水平和对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。IL-22蛋白在系统性红斑狼疮小鼠肾脏中呈强阳性表达，在肾小球中比较集中，在对照组小鼠肾脏中表达不明显。IL-22蛋白在两组小鼠淋巴组织中均没有表达。结论系统性红斑狼疮小鼠肾脏出现系统性红斑狼疮肾的病理学改变，肾脏组织中IL-22 mRNA和IL-22蛋白的表达升高。

系统性红斑狼疮；小鼠；白细胞介素22；HE染色

Abstract:ObjectiveTo study the expression of interleukin-22(IL-22)in mice with systemic lupus erythematosus (SLE),and explore the significance of IL-22 in the pathogenesis of SLE.MethodsEighty mice were randomly divided into SLE group(40 cases)and control group(40 cases).The mice of the SLE group were injected with activated splenocytes through caudal vein to establish SLE mouse model.Those of the control group were injected with the same amount of normal saline through caudal vein.In the 4th and 8th weeks after model establishment,the kidney morphology on HE sections,the titer of serum anti-double stranded DNA antibody,serum IL-22 level,the expressions of IL-22 mRNA and protein in the kidney and lymphoid tissues were compared between the two groups.ResultsHistological study revealed degeneration of renal tubular epithelial cells,a large number of inflammatorycell infiltration in the renal interstitium,and proliferation of mesangial cells in the SLE group;but normal renal morphology in the control group.In the 4th and 8th weeks after modeling,the serum titer of anti-double stranded DNA antibody in the SLE group was higher than that in the control group(P＜0.05);the serum level of IL-22 in the SLE group was not statistically different from that in the control group (P＞0.05);the expression of IL-22 mRNA in the kidney tissues of the SLE group was higher than that of the control group(P＜0.05);but the expression of IL-22 mRNA in the lymphoid tissues of the SLE group was not statistically different from that of the control group(P＞0.05).The expression of IL-22 protein in the kidneys of the SLE group was strongly positive and concentrated in the glomeruli,while IL-22 protein was not obviously expressed in the kidneys of the control group.IL-22 protein was not expressed in the lymphoid tissues of either group.ConclusionsThe systemic lupus erythematosus mice have the pathological changes of systemic lupus erythematosus in the kidneys.The expressions of IL-22 mRNA and protein are increased in the renal tissues.

Keywords:systemic lupus erythematosus,mouse,interleukin-22,HE staining

系统性红斑狼疮的发生发展和多种因素有关，是一种炎症反应性疾病[1]，细胞因子在其发病过程中发挥重要作用，系统性红斑狼疮的炎症范围和严重性取决于促炎细胞和抗炎细胞因子之间的平衡状态[2]。白细胞介素22（Interleukin-10，IL-22）和白细胞介素10（Interleukin-10，IL-10）的结构比较相似，是IL-10家族成员之一，IL-22由免疫细胞产生，其作用于组织细胞，调节组织细胞的功能，而不是作用于免疫细胞。IL-22增加促炎细胞因子[肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素8（Interleukin-8，IL-8）和白细胞介素6（Interleukin-6，IL-6）]mRNA的表达，增加细胞因子信号抑制物的表达。IL-22在银屑病和结肠炎等免疫系统疾病中发挥重要作用[3-5]，为研究IL-22和系统性红斑狼疮发病中的作用，本研究对系统性红斑狼疮小鼠IL-22细胞因子的表达进行研究，探讨IL-22在系统性红斑狼疮发病中的意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性、清洁级、7～8周龄、体重20～25 g、BALB/c近交系小鼠90只，购自上海斯莱克实验动物有限公司。

1.2 主要试剂和仪器

引物序列（上海生工生物工程技术服务有限公司），Trizol试剂（美国Sigma公司），逆转录酶（上海博尚生物技术有限公司），ELISA试剂盒、免疫组织化学试剂盒（美国Fermentas公司），苏木素、伊红（国药集团化学试剂有限公司），离心机、切片机及PCR仪（美国Sigma公司），石蜡包埋机（美国Thermo公司）。

1.3 方法

1.3.1 小鼠分组 取10只小鼠用于制备活化的脾细胞，剩余80只小鼠随机分为系统性红斑狼疮组和对照组。

1.3.2 复制系统性红斑狼疮小鼠模型[6]水合氯醛麻醉成功后，取10只小鼠的脾脏，磷酸盐缓冲液进行冲洗，研磨后收集脾细胞，制成脾细胞悬液，用刀豆蛋白A活化脾细胞，共3 d，将脾细胞浓度调整为2×106个/ml。取40只小鼠用于复制系统性红斑狼疮模型，每只小鼠给予活化的脾细胞尾静脉注射，每周1次，共3周，取小鼠的尿液进行测定，尿蛋白浓度为0.1～1.0 g/L为系统性红斑狼疮小鼠复制模型成功；对照组40只小鼠在相同时间经尾静脉注射等量的生理盐水。模型复制后第4周测定每个小鼠的尿蛋白浓度，系统性红斑狼疮组小鼠的尿蛋白浓度均为0.1～1.0 g/L，对照组小鼠的尿蛋白浓度均正常，表明系统性红斑狼疮模型复制成功。

1.3.3 实验取材 系统性红斑狼疮模型复制成功后第4周和第8周两组各取20只进行实验。每只小鼠从眼眶取1 ml全血，室温放置2 h后离心，取上清液用于血清抗双链DNA抗体滴度和IL-22表达的测定，水合氯醛麻醉成功后，切开小鼠腹腔，摘取小鼠腹腔淋巴结和双侧肾脏，用于石蜡切片和实时逆转录聚合酶链反应（real-time reverse transcriptionpolymerase chain reaction，real-time RT-PCR）。

1.3.4 制作石蜡切片 将小鼠的肾脏组织在甲醛中固定，脱水机中进行脱水并浸蜡，石蜡包埋后用切片机切成4μm厚的切片备用。

肾脏组织HE染色：将小鼠肾脏组织脱蜡脱苯后进行HE染色。

1.3.5 肾脏组织和淋巴结组织IL-22 mRNA的检测 提取小鼠肾脏组织总mRNA：切取部分小鼠肾脏组织，放入离心管中，加入Trizol裂解细胞，加入氯仿震荡，离心，取上清液加入异丙醇混匀，离心，弃去上清液，乙醇洗涤上清液，离心，加入DEPC水溶液，采用核酸蛋白测定仪测定总mRNA的纯度和浓度。在PCR仪中将总mRNA逆转录为cDNA，将cDNA加入PCR反应体系中进行扩增，总反应体系为20μl，正反引物和cDNA各0.6μl，10μl Taq PCR Master Mix，8.2μl DEPC水，反应条件为95℃变性15 min，然后94℃20 s，58℃10 s，72℃ 15s，共40个循环；小鼠淋巴结组织IL-22 mRNA的real-time RT-PCR检测步骤同肾脏组织。

1.3.6 免疫组织化学法检测小鼠肾脏组织中IL-22的表达 采用免疫组织化学法测定小鼠肾脏组织中IL-22的表达，实验步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.7 血清抗双链DNA抗体滴度和IL-22水平的测定 将小鼠全血离心后取上清液，采用ELISA法测定血清抗双链DNA抗体滴度和IL-22水平。

1.4 主要观察指标

两组小鼠肾脏HE染色、血清抗双链DNA抗体滴度和IL-22水平、肾脏组织IL-22 mRNA表达和淋巴组织IL-22 mRNA的表达情况、小鼠肾脏和淋巴结组织中IL-22蛋白的表达。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，以均数±标准差（±s）表示，同一组两时间点比较采用配对t检验，同一时间点两组间比较采用两独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组小鼠肾脏HE染色结果

系统性红斑狼疮组小鼠在模型复制后第4周时肾小管上皮细胞变性，肾间质内有少量炎症细胞浸润（见图1A）；第8周时肾小管上皮细胞变性，肾间质内见大量炎症细胞浸润，肾小球系膜细胞增生（见图1C）。对照组小鼠第4周和第8周时肾脏病理均没有出现异常（见图1B、1D）。两组小鼠的HE染色结果提示：系统性红斑狼疮模型复制成功。

图1 两组小鼠肾脏HE染色结果 （×400）

2.2 两组小鼠血清抗双链DNA抗体滴度比较

系统性红斑狼疮组小鼠模型复制后第4周和8周血清抗双链DNA抗体滴度与对照组比较，差异有统计学意义（t=4.226和21.845，P=0.014和0.000），系统性红斑狼疮组高于对照组；系统性红斑狼疮组小鼠第8周血清抗双链DNA抗体滴度与第4周比较，差异有统计学意义（t=19.436，P=0.000），对照组小鼠第4周和第8周血清抗双链DNA抗体滴度比较差异没有统计学意义（t=0.856，P=0.745），表明系统性红斑狼疮模型复制成功。见表1。

2.3 两组小鼠血清IL-22的表达比较

将对照组小鼠第4周时血清中IL-22的含量定为1，其他各组值为其倍数变化。系统性红斑狼疮组第4周和第8周时小鼠血清IL-22和对照组比较，差异均没有统计学意义（t=1.246和0.961，P=0.167和0.237）。见表2。

2.4 两组小鼠肾脏组织IL-22 mRNA的表达比较

系统性红斑狼疮组第4周和第8周时小鼠肾脏组织IL-22 mRNA水平与对照组比较，差异有统计学意义（t=5.347，8.642，P=0.003、0.000）。见表3。

2.5 两组小鼠淋巴组织IL-22 mRNA的表达比较

系统性红斑狼疮组第4周和第8周小鼠淋巴组织IL-22 mRNA水平和对照组比较，差异无统计学意义（t=1.201和1.624，P=0.127和0.157）。见表4。

2.6 两组小鼠肾组织IL-22蛋白表达比较

免疫组织化学染色结果显示，IL-22蛋白在系统性红斑狼疮小鼠肾脏中呈强阳性表达，在肾小球中比较集中，在对照组小鼠肾脏中表达不明显。见图2。

表1 两组小鼠血清抗双链DNA抗体滴度比较（n=20，μg/ml，±s）

表1 两组小鼠血清抗双链DNA抗体滴度比较（n=20，μg/ml，±s）

表2 两组小鼠血清IL-22的表达比较（n=20，±s）

表2 两组小鼠血清IL-22的表达比较（n=20，±s）

组别系统性红斑狼疮组对照组第8周1.23±0.04 1.22±0.14 1.00±0.01 1.17±0.16t值 1.246 0.961P值 0.167 0.237第4周

表3 两组小鼠肾脏组织IL-22 mRNA的表达比较（n=20，±s）

表3 两组小鼠肾脏组织IL-22 mRNA的表达比较（n=20，±s）

组别系统性红斑狼疮组对照组第8周2.12±0.16 3.64±0.17 0.87±0.12 1.57±0.22t值 5.347 8.642P值 0.003 0.000第4周

表4 两组小鼠淋巴组织IL-22 mRNA的表达比较（n=20，±s）

表4 两组小鼠淋巴组织IL-22 mRNA的表达比较（n=20，±s）

组别系统性红斑狼疮组对照组第8周0.42±0.11 0.51±0.13 0.48±0.14 0.66±0.16t值 1.201 1.624P值 0.127 0.157第4周

图2 两组小鼠肾脏中IL-22表达情况 （×200）

2.7 两组小鼠淋巴组织IL-22蛋白表达比较

免疫组织化学染色结果显示，IL-22蛋白在两组小鼠淋巴组织中均没有表达。见图3。

图3 两组小鼠淋巴组织中IL-22表达情况 （×200）

3 讨论

系统性红斑狼疮是一种炎症性疾病，由自身免疫介导，其病理学变化为免疫复合物沉积以及自身抗原抗体的异常反应引起的组织损伤[7-8]，系统性红斑狼疮的发病机制尚不十分清楚，目前的研究认为多种免疫异常，尤其是T淋巴细胞以及细胞因子失去平衡在系统性红斑狼疮发病过程中发挥重要作用。根据功能和分泌细胞因子的不同，T淋巴细胞可以分为Th1细胞、Th2细胞、调节性T细胞、Th22细胞滤泡性辅助性T细胞以及Th17细胞等细胞亚群，其中Th22细胞主要分泌IL-22细胞因子[9-10]，Th22细胞的功能主要通过IL-22实现的[11]，IL-22能够诱导肺上皮细胞分泌抗炎介质，对抗肺部的炎症反应；能够阻止肝细胞的凋亡防止肝损害；能够诱导皮肤生成抗微生物肽，阻止角质化细胞分化，促进其增殖；IL-22同时又可以引起银屑病患者的上皮细胞增生，诱导结肠肌纤维母细胞和支气管上皮细胞的促炎反应。

IL-22作为独特的细胞因子，在自身免疫性疾病和炎症性疾病中的作用越来越引起关注，IL-22在炎症反应中发挥抗炎和促炎两种作用，在银屑病中介导皮肤炎症[12]，在溃疡性结肠炎中减轻肠道炎症反应[13]，系统性红斑狼疮患者血清中IL-22水平降低[14-17]。本研究通过对系统性红斑狼疮小鼠IL-22细胞因子的表达情况进行研究，探讨IL-22在系统性红斑狼疮发病中的意义。结果发现：系统性红斑狼疮组小鼠肾小管上皮细胞变性，肾间质内见大量炎症细胞浸润，肾小球系膜细胞增生，对照组小鼠肾脏组织形态正常。系统性红斑狼疮组小鼠4周和8周时血清抗双链DNA抗体滴度均高于对照组；血清IL-22和对照组比较，差异没有统计学意义；肾脏组织IL-22 mRNA水平均高于对照组；小鼠淋巴组织IL-22 mRNA水平和对照组比较差异没有统计学意义。IL-22蛋白在系统性红斑狼疮小鼠肾脏中呈强阳性表达，在肾小球中比较集中，在对照组小鼠肾脏中表达不明显。IL-22蛋白在两组小鼠淋巴组织中均没有表达。表明系统性红斑狼疮小鼠肾脏出现系统性红斑狼疮肾的病理学改变，肾脏组织中IL-22 mRNA和IL-22蛋白的表达升高。本研究结果发现小鼠血清中IL-22水平和正常小鼠血清中IL-22水平比较差异没有统计学意义，和系统性红斑狼疮患者血清中IL-22水平降低的结果不一致，考虑可能为小鼠和人血清中IL-22的表达情况存在差异，小鼠和人外周血IL-22可能来源不同，小鼠IL-22是Th17的效应细胞因子，人外周血中IL-22有Th22细胞产生。IL-22 mRNA和IL-22蛋白在系统性红斑狼疮小鼠肾脏组织中表达显著增加，表明IL-22在狼疮鼠肾炎的发生过程中起到局部促炎的作用，随着病情的发展，IL-22 mRNA和IL-22蛋白表达增加，表明IL-22在参与肾炎发生的同时促进疾病的进展。由此可见，IL-22和狼疮鼠疾病的发生发展关系密切。

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（张西倩 编辑）

Expression of IL-22 in mice with systemic lupus erythematosus and its significance*

Yuan-yuan Wang,Ling Zhao,Tao Liu,Hong-shuang Ma,Zhen-yu Jiang
(Department of Rheumatology,the First Hospital of Jilin University, Changchun,Jilin 130021,China)

R-332

A

2016-11-30

国家自然科学基金青年基金项目（No：81501343JC）

姜振宇，E-mail：jlujzyaliyun.com.cn；Tel：0431-88782060

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.22.002

1005-8982（2017）22-0007-06