建立基于脱氧次黄嘌呤核苷修饰等位基因PCR方法检测EGFR基因热点突变*

杨永辉，李辉，朱桂云，李秀武，陈宁，任雪飞

[河北省胸科医院（河北省肺癌防治研究中心），河北 石家庄 050041]

建立基于脱氧次黄嘌呤核苷修饰等位基因PCR方法检测EGFR基因热点突变*

杨永辉，李辉，朱桂云，李秀武，陈宁，任雪飞

[河北省胸科医院（河北省肺癌防治研究中心），河北 石家庄 050041]

目的建立基于脱氧次黄嘌呤修饰等位基因特异荧光聚合酶链反应（dI-AS-PCR）方法，检测表皮生长因子受体（EGFR）基因热点突变L858R和19del（2235～2249，2236～2250）。方法设计包含扩增EGFR基因L858R和19del热点突变在内的特异性引物、荧光探针和内参体系；且特异检测基因突变的等位基因PCR引物3’-末端n-1或n-2位置采用脱氧次黄嘌呤（dI）修饰。建立标准品和质控样品，应用荧光PCR检测，并分析结果。结果dI-AS-PCR能够在野生型背景下检测低于0.1%的突变，对50例肺癌临床样本进行检测，有9例（18%）EGFR基因发生L858R突变，14（28%）例19del基因突变。EGFR基因热点突变率为46%，其检测结果与DNA测序完全一致。结论基于dI-AS-PCR技术的特异荧光PCR检测EGFR基因热点突变，敏感性高，特异性强，可以应用于临床EGFR基因突变检测，指导个性化用药及酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗耐药监测。

EGFR热点突变；等位基因PCR；脱氧次黄嘌呤；肺癌

Abstract:ObjectiveTo establish a method to test the mutations ofEGFRgene hotspots L858R and 19 del (2235-2249,2236-2250)based on deoxyinosine-modified allele-specific PCR (dI-AS-PCR).MethodsA dI-ASPCR primer system was designed to detect the mutations ofEGFRgene hotspots(L858R and 19 del),which included specific primers modified by deoxyinosine at the n-1 or n-2 position of the primer 3'-terminal,fluorescent probe and internal control primers.Standard substance and quality control samples were built and analyzed by the dI-AS-PCR system.ResultsThe detection limit of dI-AS-PCR was less than 0.1%under the background of wild type template.The dI-AS-PCR system was used to screen 50 lung cancer samples,in which 9 samples(18%)had L858R mutation ofEGFRgene and 14 cases(28%)had 19 del mutation.The hotspot mutation rate ofEGFRgene was 46%,which was consistent with the results of DNA sequencing(P＞0.05).ConclusionsThe dI-AS-PCR is a sensitive and specific assay,which could be widely used to detectEGFRmutations,guide patient-specific treatment and monitor the drug resistance of TKI-therapy in clinic.

Keywords:EGFRgene hotspot mutation;allele specific PCR;deoxyinosine;lung cancer

肺癌是当今最常见的恶性肿瘤之一，也是高致死率的癌症之一，其中80%～85%的患者为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancers，NSCLC）[1-2]。《2012中国肿瘤登记年报》报道，我国癌症发病率和死亡率分别为286/10万和181/10万，相当于每分钟就有5、6个人确诊为癌症，平均每5位癌症患者3个人死亡。在所有的肿瘤类别中，肺癌发病率和死亡率在我国高居第一，高达54/10万和45/10万，换句话说，每分钟确诊的6位癌症患者中，就有一个是肺癌，死亡率极高；而且我国癌症的发病率持续升高，2003～2009年6年间，癌症的发病率上升一半以上（57%）[3]。

大多数肺癌患者被确诊时已经是晚期，采用传统化疗方案以化学药物实现肿瘤细胞的杀伤或抑制，在治疗过程中不可避免会对正常组织和器官造成极大地损伤[4]。同时给患者带来极大的身心痛苦，也增加了患者的医疗负担，临床的治疗成功率以及治疗后5年存活率效果并不佳[3-5]。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）为靶点的酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine kinase inhibitor，TKI）在非小细胞肺癌治疗中日渐突出[6-9]；TKI能特异的杀伤肿瘤细胞，效果显著。但并非所有的患者都能从TKI治疗中获益，研究表明，携带EGFR基因18～21外显子基因突变患者接受TKI治疗效果显著[10-11]。因此，TKI治疗前检测EGFR基因突变十分必要。

目前检测EGFR基因突变方法很多，等位基因特异聚合酶链反应（allele specific PCR，AS-PCR）、突变扩增系统（amplification refractory mutation system，ARMS）又称等位基因特异性扩增法（allele specific amplification，ASA）、高分辨率溶解曲线分析（high-resolution melting，HRM）和基因测序等[12-15]。本文建立基于脱氧次黄嘌呤修饰的等位基因聚合酶链反应（deoxyinosine modified specific allele PCR，dI-AS-PCR）方法检测EGFR基因突变，在等位基因PCR引物3'-末端n-1或n-2位置采用脱氧次黄嘌呤（dI）修饰替代。dI为天然存在的碱基，常用于简并性引物中，在DNA聚合酶作用下能与A、G、C和T碱基结合；但共价结合力很弱。本研究探讨在等位基因PCR引物中引入dI修饰后对其检测能力的影响，从而验证dI-AS-PCR检测EGFR基因热点突变的可行性。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

dNTP（美国Promega公司），AmpliTaq Gold®DNA Polymerase（美国ABI公司），T-载体（PMD18-T Vector，日本TaKaRa公司）,DH5α（日本TakaRa公司），TB-DNA定量标准品（1×107～1×104个/ml，中山大学达安基因股份有限公司），DNA定量试剂盒（荧光法）（美国Sigma公司），人EGFR基因突变检测试剂盒（中国雅康博生物科技有限公司），Eppendorf核酸蛋白定量仪（D30，德国Eppendorf公司），实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）仪（LightCycler®480II qRT-PCR系统，瑞士Roche公司）。

1.2 dI-AS-PCR引物及探针设计

等位基因PCR引物和探针采用Beacon Designer 8.0设计；构建质粒引物用primer 5设计，引物探针由上海辉睿生物技术有限公司合成（见表1）。

1.3 质粒构建

选用经 DNA测序明确EGFR基因 19del（2235～2249，2236～2250）和L858R突变样本克隆质粒。50μl PCR体系包含：50 ng DNA，1×PCR buffer，200 nmol dNTP，3 mmol Mg2+，200 nmol正反向引物（19-Seq-F/R，或21-Seq-F/R），1U AmpliTaq Gold®DNA Polymerase。PCR扩增程序为：①酶激活，95℃10 min；②扩增：95℃30 s，55℃50 s，72℃50 s，8个循环；随后95℃50 s，72℃ 50 s扩增5个循环；最后30个循环，95℃30 s，55℃50 s，72℃50 s；③延伸，72℃延伸5 min。PCR产物经凝胶成像鉴定后经产物纯化连接至T-载体中，然后经DH5α转化、摇菌、质粒提取、酶切和测序鉴定后保存备用。

1.4 构建标准品

1.4.1 建立质粒标准品Ⅰ 质粒浓度首先应用Eppendorf核酸蛋白定量仪初步定量，计算浓度稀释至105个/μl备用。然后使用TB-DNA定量标准品应用荧光PCR对质粒进行定量，按照荧光PCR定量浓度稀释突变质粒为1×104、1×103、1×102、10、5、3和1个/μl建立敏感性标准品I。野生型质粒依次稀释至1×106、4×105、1×105、4×104、1×104、4×103和1×103个/μl建立耐受标准品I备用。

1.4.2 建立质粒标准品Ⅱ 将DNA定量试剂盒中的标准品稀释至200、100、50、30、15和10 ng/μl构建耐受标准品Ⅱ。敏感性标准品Ⅱ：10 ng/μl耐受标准品Ⅱ中分别加入1 000、100、10和5个突变质粒，即相当于1万个野生背景下含有10%、1%、0.1%和0.05%突变。

1.4.3 测试标准品 购置的10例EGFR突变样品来源于北京雅康博生物科技有限公司，其中19del和L858R各5例构建测试标准品。测试标准品分为3份用于测试结果的重复性。

表1 检测EGFR热点突变的引物和探针

1.5 qRT-PCR

50μl荧光 PCR体系：1×buffer，2.5 mmol Mg2+，250 nmol dNTP，1U DNA聚合酶，2μl DNA模板，80 nmol Ctrl-F，80 nmol Ctrl-R，60 nmol Ctrl-P及各150 nmol的EGFR突变引物和探针。荧光PCR扩增条件：95℃，10 min预变性，95℃30 s，60℃30 s，72℃25 s，循环15次；再按95℃30 s，64℃40 s，72℃20 s，循环30次，并于64℃40 s时采集荧光信号分析。

1.6 DNA测序

敏感性标准品Ⅱ DNA测序：标准品中含有突变质粒，因此采用2种方式进行测序验证：①采用19-Seq-F/R和21-Seq-F/R测序，该方法同时可以扩增野生型DNA和突变质粒（Normal-PCR/DNA测序）；②特异扩增耐受标准品中突变质粒，采用引物19-Seq-F/Marker-Seq-R和21-Seq-F/Marker-Seq-R（Marker-PCR/DNA测序）进行扩增，产物经凝胶成像分析纯化后送往上海生工生物工程股份有限公司测序。临床样本测试，采用 19-Seq-F/R和21-Seq-F/R引物扩增后进行测序。

1.7 临床样本检测

NSCLC石蜡切片标本来自河北省胸科医院，且经临床、影像以及病理诊断为非小细胞肺癌患者，共50例。其中男性27例，女性23例；腺癌45例，鳞癌5例。标本使用经过患者及家属知情同意，遵循医院的患者隐私保密规矩并经过医院伦理委员会批准。

1.8 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，结果以均数±标准差（±s）表示，采用t检验，P＜0.05为有差异有统计学意义。

2 结果

2.1 敏感性及耐受范围

2.1.1 敏感性 为了方便评价dI-AS-PCR方法检测基因突变，以EGFR基因L858R突变为研究对象，同时设计dI-AS-PCR引物（L858R-F）、AS-PCR引物（L858R-F1）和ARMS引物（L858R-F2）进行对比分析。采用敏感性标准品I测试dI-AS-PCR、AS-PCR和 ARMS，同时质粒荧光 PCR体系（PMD-18-F/R/P）作为阳性对照，PCR阴性对照为水。研究结果表明，dI修饰等位基因PCR引物敏感性与AS-PCR基本一致，可以检测低至5个突变，对于3和1个检测效果并不好；而ARMS的敏感性则只能检测10个左右的突变。因此，AS-PCR引物经dI修饰后，敏感性没有受到干扰（见图1）。

图1 dI-AS-PCR、AS-PCR和ARMS的敏感性

2.1.2 耐受范围 应用耐受标准品 I评价dI-AS-PCR，40个阳性质粒作为阳性参考，进行3次重复实验。实验结果为：ARMS耐受性最好，可以耐受高达10万个的野生背景；dI-AS-PCR次之，可耐受4×104个野生型背景；AS-PCR最高可以耐受4×103个野生型背景。在同一浓度（1×106、4×105和1×105）条件下，dI-AS-PCR的检测结果（由于PC的值不同，选择对各自重复实验和浓度下的Ct值与PC差值进行统计学分析）与AS-PCR和ARMS检测结果相比，差异没有统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.2 阈值及检测能力

应用dI-AS-PCR检测DNA样品前，需要在检测EGFR基因突变的体系引入内参引物和探针（Ctrl-F/R/P）建立双重荧光PCR体系。其目的：①确定是否有待检测DNA样品加入。②指示加入样品DNA的浓度。运用耐受标准品Ⅱ，测试dI-AS-PCR的耐受性。结果表明，dI-AS-PCR可以耐受30 ng以上的野生型DNA的干扰。考量到核酸蛋白定量仪定量DNA的误差，将DNA上样的浓度标准定为10 ng。

应用 dI-AS-PCR、Normal-PCR-DNA测序、Marker-PCR-DNA测序和质粒荧光PCR（PMDPCR）方法同时检测敏感性标准品Ⅱ，评价dI-ASPCR的检测能力。结果表明：Normal-PCR-DNA测序方法无法检测出敏感性标准品中含有10%以下的突变；通过Marker-PCR DNA测序再次验证，敏感性标准品中确实含有EGFR基因突变。dI-ASPCR检测结果与 Marker-PCR DNA测序和PMD-PCR检测结果一致。见表3。

表2 耐受标准品I测试dI-AS-PCR

表3 多种方法检测敏感性标准品Ⅱ

可以确定在10 ng野生型DNA干扰下，dI-ASPCR可以检测0.05%左右的突变。因此本研究以10 ng DNA检测样本为上样阈值，检测EGFR基因突变。

2.3EGFR基因突变的稳定性

通过对构建的测试标准品的检测明确的EGFR基因突变样品10例，其中L858R和19del各5例，分为3等份分别交给3人应用dI-AS-PCR检测，评价其的稳定性。结果表明，3人检测结果一致，差异无统计学意义（P＞0.05），dI-AS-PCR体系检测EGFR突变的稳定性良好。

2.4 临床样本结果

经过多方面测试，建立了dI-AS-PCR，可以用于检测临床样本。随机收集的50例临床样本，应用dI-AS-PCR和DNA测序方法进行比较分析，对检测结果有出入的样本采用EGFR基因检测试剂盒进行确认分析。经检测dI-AS-PCR的检测结果与DNA测序完全一致。随机选择10例应用EGFR基因检测试剂盒进行确认检测，结果与dI-AS-PCR和DNA测序一致，差异无统计学意义（P＞0.05）。

50例临床样本中，23例检测EGFR基因突变阳性，EGFR基因热点突变率为46%；其中19del 14例（28%），L858R基因突变9例（18%）。且这23例EGFR基因突变样本均为腺癌，5例鳞癌中未检测出基因突变。由于样本量的限制，本文中EGFR基因突变率并不能反映当地真实NSCLC患者的EGFR基因突变水平。

3 讨论

大量的研究表明EGFR基因突变患者接受TKI治疗，疗效要高于野生型患者[16-19]。因此临床已经建立基于EGFR基因突变类型的NSCLC个性化靶向治疗方案，并在我国广泛推广。目前，提高EGFR基因突变检测率的方法主要有2种：一是研究和开发高敏感的基因突变检测技术；另一种是提高待检组织肿瘤细胞的均质性，尽可能的获得均质的肿瘤组织，但是受限于取材的影响，这点很难满足。

因此，提高检测方法的检测能力是提高突变检测率的主要手段，基于此很多基因突变的检测方法问世，如：单分子测序、变性高效液相质谱（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）[20]、基质辅助激光解析离子化-飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/Ionization time of flight，MALDI-TOF）[12]等，这些方法操作复杂，检测周期较长。虽然基因测序为EGFR基因突变检测的“金标准”[21-22]，但是由于其敏感性低[12，23]，操作复杂[24]，国内外市场推广的主要是基于AS-PCR或ARMS的EGFR基因突变检测试剂盒，如scropion-ARMS、TaqMan-ARMS以及ADX-ARMS等，其敏感性可达到1%。

本文补充的一种AS-PCR引物设计方法，也可以理解为一种新的ARMS引物设计方法。AS-PCR检测基因突变，利用Taq DNA聚合酶缺乏3’-5’校正功能，将检测突变的碱基设计于3'-末端来检测基因突变，由于AS-PCR需要反复优化引物浓度、Taq DNA聚合酶含量、Mg2+浓度及Tm值等。在AS-PCR引物3’-末端n-1或n-2位置人为引入错配的ARMS得到追捧；这样可以有效地降低野生型模板干扰，但是同时也降低了敏感性。dI是自然天然存在的碱基，与碱基A、G、C和T均能结合，结合力依次为dI∶dC＞dI∶dA＞dI∶dG＞dI∶dT。但是其与碱基共价结合能力很弱，引物中引入一定数量的dI可以有效降低PCR非特异扩增，如寡核苷酸引物（Dual Priming Oligonucleotide，DPO）系统。因此本文中，将AS-PCR引物n-1或n-2位置的碱基采用dI修饰替换。经dI修饰的AS-PCR对野生型模板的耐受及特异性有很大的提高，可以耐受104个以上的野生型模板干扰，同时敏感性又未受到干扰，可以检测低至0.05%的基因突变；应用dI-AS-PCR和DNA测序检测50例临床样本，其结果完全一致。

综上所述，AS-PCR引物中引入dI修饰，不但可以提高引物对野生型模板的耐受，同时对引物系统检测的敏感性无干扰。这样拓展了AS-PCR有效检测范围。因此dI-AS-PCR可以应用于临床检测EGFR基因突变。采用dI修饰的AS-PCR引物无疑是设计等位基因PCR或ARMS检测基因突变一个比较好的选择。dI-AS-PCR可以推广于临床检测EGFR基因突变，指导临床个性化用药。

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（张蕾 编辑）

Establishment of a method for detection ofEGFRgene hotspot mutations based on deoxyinosine-modified allele-specific PCR*

Yong-hui Yang,Hui Li,Gui-yun Zhu,Xiu-wu Li,Ning Chen,Xue-fei Ren
(Hebei Lung Cancer Prevention Research Center,Hebei Chest Hospital, Shijiazhuang,Hebei 050041,China)

R734

A

2016-11-28

河北省卫生和计划生育委员会重点跟踪项目（No：GL2014061）

朱桂云，E-mail：zgyblk@163.com

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.22.003

1005-8982（2017）22-0013-07