滋养叶细胞增殖基因及间质细胞凋亡检测在水泡状胎块诊断中的价值*

张燕，陆萍，杨淑玲，刘璇，张琳，王一

（上海市普陀区妇婴保健院1.病理科，2.妇科，上海 200062）

滋养叶细胞增殖基因及间质细胞凋亡检测在水泡状胎块诊断中的价值*

张燕1，陆萍1，杨淑玲1，刘璇1，张琳2，王一1

（上海市普陀区妇婴保健院1.病理科，2.妇科，上海 200062）

目的探讨滋养叶细胞增殖相关基因及间质细胞凋亡检测在水泡状胎块（HM）病理诊断中的价值。方法应用免疫组织化学标记技术，检测100例HM（其中完全性HM 61例，部分性HM 39例）及40例绒毛水肿的病理组织标本滋养叶细胞的Ki67、Livin与Bcl-2的表达，并应用TUNEL法对绒毛间质凋亡细胞进行原位观察。结果Ki67阳性表达在绒毛水肿组、部分性HM组、完全性HM组趋势呈逐渐增强，各组间比较均差异有统计学意义（P＜0.05）；绒毛水肿组及HM组绒毛间质内AI指数比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；Livin及Bcl-2表达差异无统计学意义（P＞0.05）；Ki67表达与AI指数呈正相关（P＜0.05）。结论间质细胞凋亡联合滋养叶细胞中Ki67表达检测可用于HM的诊断与分型，也可用于鉴别HM与绒毛水肿。

HM；Ki67；Livin；Bcl-2

Abstract:ObjectiveTo investigate the value of trophoblastic cell proliferation-related gene and interstitial cell apoptosis in the diagnosis of hydatidiform moles.MethodsImmunohistochemical technique was used to detect the expressions of Ki67,Livin and Bcl-2 in trophoblast cells.TUNEL was used to detect apoptosis of villous stroma cells of 100 cases of hydatidiform moles(including 61 cases of complete hydatidiform moles and 39 cases of partial hydatidiform moles)and 40 cases of villous edema.ResultsThe expression of Ki67 in the trophoblastic cells of the villous edema group,partial hydatidiform mole group and complete hydatidiform mole group gradually increased,the differences among the 3 groups were statistically significant(P＜0.05).There were no significant differences in the expression of Livin or Bcl-2 among the 3 groups(P＞0.05).There was a positive correlation between Ki67 expression and AI index(P＜0.05).ConclusionsThe detection of Ki67 expression in trophoblastic cells and apoptosis in villous stroma cells can be used for the diagnosis and classification of villous edema,partial hydatidiform mole and complete hydatidiform mole.

Keywords:hydatidiform mole;Ki67;Livin;Bcl-2

水泡状胎块（hydatidiform mole，HM），又称为葡萄胎，是我国最常见的妊娠并发症之一，病变主要在于滋养叶细胞增生及胎盘绒毛过度生长，依据预后程度，可将HM分为完全性HM与部分性HM 2类，大多数为良性妊娠滋养叶细胞病变，但仍有部分患者清除病变组织后转化为恶性HM，严重者可恶化为绒毛膜癌。但更为严峻的问题是，截止目前，HM病理学特征不典型，难以与流产的水肿绒毛区别，因此如何诊断并分型HM仍是妇产科病理诊断的难题，即使有经验的病理医师也面临诊断困难，并且诊断的可重复性差，造成HM漏诊或误诊，引发分歧并造成医疗纠纷[1-3]。文献显示HM的流产病例中细胞滋养层细胞增殖速度较低，增殖活性下降[4]，本院早期针对HM的形态学进行了细致的回顾性研究，发现绒毛间质的核碎片/凋亡小体的出现对于区分HM及绒毛水肿差异有统计学意义，部分病理还显示了滋养层向间质内折叠呈凹字形，可见HM的增殖/凋亡平衡可能被打破，Ki67是细胞增殖标记物，主要用于鉴别肿瘤增生，近年来越来越多的学者着眼于探索Ki67表达与反应性增生病变的关联[5]。Livin与Bcl-2基因属于凋亡抑制基因，可通过多种途径抑制细胞凋亡作用，过度表达可抑制细胞凋亡，有利于细胞的异常增殖和恶性转化，但两者在正常组织中几乎不表达[6-7]。基于以上论述，本研究挑选HM及绒毛水肿病例应用TUNEL法原位检测间质层细胞凋亡，免疫组织化学染色方法检测滋养叶细胞增殖标记物Ki67及凋亡相关蛋白Livin、Bcl-2表达，初步探讨2种细胞的增殖及凋亡状况与HM的关系，为诊断并分型HM提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 资料

经院内伦理委员会同意，收集2006～2013年上海市普陀区妇婴保健院经常规病理诊断为HM的病例100例，另随机挑选自然流产常规病理诊断为绒毛水肿的病例40例为对照组。所有病例经p57kip2及CD34免疫组织化学检验，结果由2名经验丰富的妇科病理医师共同确定诊断并进一步对100例HM进行分型，完全性HM 61例，部分性HM 39例。

1.2 试剂

兔抗人Ki67单克隆抗体（英国Abcam公司，克隆号：SP6）、Bcl-2单克隆抗体（美国Abnova公司，克隆号：SP66）和兔抗人Livin多克隆抗体（英国Abcam公司，克隆号：ab97350）均购自福州迈新生物技术开发有限公司；凋亡检测试剂盒（英国abcam公司，克隆号：QIA33-1EA）购自艾博抗上海贸易有限公司。

1.3 指标检测

全部标本均为常规外检组织，经多聚甲醛液固定、脱水、石蜡包埋和切片，分别行HE和免疫组织化学法染色。

1.3.1 免疫组织化学法检测 EnVision法检测胎块滋养叶细胞中Ki67、Livin与Bcl-2的表达操作按试剂盒说明书步骤进行，一抗：兔抗人Ki67单克隆抗体、兔抗人Livin多克隆抗体和Bcl-2单克隆抗体，用PBS代替一抗为阴性对照，在光镜下观察。Ki67、Livin和Bcl-2的阳性表达均为棕黄色或黄色颗粒，其中Ki67定位于细胞核，Livin定位于细胞质，Bcl-2定位于细胞膜和细胞质，选取200个滋养叶细胞观察，Ki67、Livin和Bcl-2的表达为阳性细胞数/计数细胞总数×100%。

1.3.2 TUNEL法检测 操作按试剂盒说明书步骤进行，脱水、封片和干燥，在光学显微镜下观察。结果判定标准：以绒毛间质细胞着棕色为阳性细胞，计数10个连续高倍镜（×400）视野的绒毛间质细胞的阳性细胞数，计算出凋亡指数（apoptosis Index，AI）=绒毛间质凋亡细胞数/mm2。

1.4 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用方差分析，有统计学意义后，采用q检验作两两比较。Ki67、Livin与Bcl-2表达与AI指数的相关性分析采用Pearson积差相关分析法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料比较

绒毛水肿组、部分性HM组和完全性HM组3个组别的年龄、体重指数、妊娠时间和是否初产妇等一般情况比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。见表1。

2.2 3组胎块的Ki67、Livin与Bcl-2表达比较

3组胎块Livin、Bcl-2表达差异无统计学意义（P＞0.05），与绒毛水肿组比，部分性HM组和完全性HM组的Ki67表达增高（P＜0.05），与部分性HM组比，完全性HM组的Ki67表达增高（P＜0.05）。见表2、图1。

表1 3个组别的临床资料比较

表2 3组胎块的Ki67、Livin与Bcl-2表达比较 （±s，%）

表2 3组胎块的Ki67、Livin与Bcl-2表达比较 （±s，%）

注：1）与绒毛水肿组比较，P＜0.05，2）与部分性HM组比较，P＜0.05

组别Bcl-2绒毛水肿组（n=40） 7.31±1.53 42.08±6.48 38.67±5.47部分性HM组（n=39） 18.84±4.271）44.87±5.97 39.12±5.39完全性HM组（n=61） 31.64±8.171）2）43.27±7.04 40.26±5.12F值 208.58 1.78 1.22P值 0.000 0.17 0.30Ki67Livin

图1 3组胎块的Ki67、Livin与Bcl-2表达比较 （×200）

2.3 3组胎块的间质细胞凋亡比较

绒毛水肿组绒毛间质中几乎无凋亡细胞，部分性HM组与完全性HM组均可见凋亡细胞，散在分布，与绒毛水肿组比较，部分性HM组和完全性HM组的AI增高（P＜0.05），部分性HM组和完全性HM组的AI比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表3和图2。

2.4 Ki67、Livin与Bcl-2与AI的相关性比较

Ki67、Livin与Bcl-2与AI的相关系数分别为0.54（P＜0.05）、0.27（P＞0.05）与0.31（P＞0.05），Ki67与AI呈正相关（P＜0.05）。

表3 3组胎块的AI比较

图2 3组胎块间质细胞凋亡比较 （×400）

3 讨论

HM属于印迹基因比例严重异常的疾病，发生与异常受精有关。根据病理和预后分型为部分性HM与完全性HM，前者来源于父系和母系基因组的三倍体，后者为来源于父系的二倍体。

目前临床鉴别完全性HM、部分性HM与流产伴绒毛水肿仍然主要依赖于组织学特征。与完全性HM比，部分性HM的病理变化较少，这点容易鉴别完全性HM与部分性HM，但部分性HM的病理变化非常细微，临床医师或病理医师容易将部分性HM误认为自然流产，从而容易造成部分性HM漏诊或误诊，耽误了治疗。

结合笔者早期的研究，本研究对HM及早期正常妊娠绒毛的形态学特征进行了深入观察，发现绒毛水肿、绒毛水池形成、滋养叶细胞增生（包括增生模式、增生程度及增生不典型性）和间质细胞凋亡在HM分型和鉴别HM与绒毛水肿胎块鉴别有重要价值。

对于滋养叶细胞增生，本检测了凋亡/增殖相关蛋白Ki67、Livin与Bcl-2，3者均明显增高。Ki67是细胞增殖标记物，可用于鉴别肿瘤与反应性增生病变，Ki67表达在除G0期以外其他细胞周期的细胞，甄别细胞增殖活性和良恶性组织生长状态[11]。本次实验中，Ki67在各组绒毛的细胞滋养叶细胞均有不同程度的阳性表达，在绒毛水肿组、部分性HM组和完全性HM组呈逐渐增多，各组间均差异有统计学意义，与ALIREZA等[12]的研究一致，说明HM的绒毛滋养细胞增殖活性要高于普通的绒毛组织。Livin基因（又称KIAP、ML-1AP），是凋亡抑制基因家族中的成员，可以通过多种途径发挥抑制细胞凋亡作用，Livin在正常组织中低表达或未见表达，而在许多肿瘤细胞中都呈高表达[13]。Bcl-2基因是最早被发现的抗凋亡基因，可通过阻止细胞凋亡促进癌细胞的增殖以及存活，导致肿瘤的发生。CANDELIER等[14]研究发现其在HM恶性发展的诊断价值。但在本研究中未发现Livin及Bcl-2蛋白在HM与绒毛水肿的滋养叶细胞中的表达仅有增高趋势，但差异无统计学意义，有可能与纳入病例较少有关，需要进一步扩大样本验证，因此Livin及Bcl-2蛋白在滋养叶细胞的表达是否有助于提高鉴别绒毛水肿、部分性HM和完全性水泡状的准确性还需试验验证。

HM的绒毛间质可见杂乱分布的核碎片与凋亡小体，但在正常早期绒毛间质中难以见到，核碎片与凋亡小体的数量与病变程度密切相关，因此这类形态指标可用于鉴别完全性、部分性HM与早期正常绒毛组织。有研究证实，HM间质细胞核碎裂与凋亡比率明显高于正常早期胎盘[8-9]，而且HM恶变与滋养细胞的凋亡活性相关，可见多种凋亡相关因子参与了绒毛组织的病变过程[6]。本研究采用TUNEL法原位检测间质细胞凋亡情况，结果显示绒毛间质细胞中的凋亡细胞数在HM组和绒毛水肿组表达差异有统计学意义，前者的凋亡细胞高于后者，与早前研究中光镜下观察到的绒毛间质凋亡小体/核碎片的情况相一致，但在完全性与部分性HM之间细胞凋亡差异有统计学意义。另外滋养叶细胞的Ki67的表达与AI指数呈正相关，提示HM病例并存绒毛滋养叶细胞的高增殖活性及绒毛间质细胞的高度凋亡。

综上所述，难以依赖于病理形态学的改变进行HM的诊断与分型是妇产科病理诊断的难点。本次研究结果提示，检测间质细胞的凋亡联合滋养叶细胞Ki67表达可用于HM的诊断与分型，也可用于鉴别HM与绒毛水肿。

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（张西倩 编辑）

Value of trophoblastic cell proliferation-related gene and interstitial cell apoptosis in diagnosis of hydatidiform moles*

Yan Zhang1,Ping Lu1,Shu-ling Yang1,Xuan Liu1,Lin Zhang2,Yi Wang1
(1.Department of Pathology,2.Department of Gynecology,Maternity and Infant Health Care Hospital of Putuo District,Shanghai 200062,China)

R737.33

A

2016-12-08

上海市普陀区卫生系统自主创新科研资助项目（No：普KW2012308）；上海市普陀区临床重点专科建设项目（No：PW-2-14-02）

王一，E-mail：wangyi6151@126.com；Tel：13681713686

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.22.004

1005-8982（2017）22-0020-05