不同测定因素对凯氏定氮法粗蛋白测定的影响

2017-10-11杨文华

中国畜牧兽医文摘 2017年9期

关键词：硼酸盐酸消化

杨文华

（内蒙古民族大学动物科学技术学院，内蒙古通辽 028000）

不同测定因素对凯氏定氮法粗蛋白测定的影响

杨文华

（内蒙古民族大学动物科学技术学院，内蒙古通辽 028000）

本试验依据凯氏定氮法测定粗蛋白含量的步骤，研究了不同消化温度、消化时间、催化剂用量、硼酸吸收液是否加减、蒸馏时间以及盐酸浓度等对饲料中粗蛋白含量测定值的影响。

测定因素凯氏定氮法粗蛋白

蛋白质是饲料中含氮化合物的总称，是支持生命活动的先决条件，更是构成生命体细胞和抗体等不可或缺的关键成分[1]。饲料中蛋白质含量的高低直接影响到动物个体生长和新陈代谢速度，因而，准确测定饲料中的蛋白质含量显得尤为重要[2]。

粗蛋白质的测定方法很多，包括凯氏定氮法、过氧化氢测定法、国标法和双缩脲法等[3]。由于凯氏定氮法测定简单，试剂和试验条件容易获得，因而在实际中使用最多、应用范围最广。诸多实践证明，凯氏定氮法较适用于单一饲料粗蛋白、浓缩饲料粗蛋白等测定。凯氏定氮法的原理是用浓硫酸对试样进行消化，使试样中的蛋白质等含氮物的氮素转化为氨[4]，被硫酸吸收生成硫酸铵，其后加入碱液进行蒸馏，当氨逸出后用硼酸予以吸收，最后用酸标准溶液完成滴定得到含氮量进行粗蛋白质换算。由于测定时涉及消化、吸收、蒸馏和滴定等众多环节，因而凯氏定氮法的影响因素相应较多，如消化温度、消化时间、催化剂、蒸馏时间、盐酸浓度等。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本试验选用进口鱼粉、玉米秸秆和大豆粕为试验材料，试样粉碎并通过0.45mm分样筛，分别混合均匀后置于密封容器中保存待用。试剂按照《GB/T6432-1994饲料中粗蛋白测定方法》[5]准备。粗蛋白测定仪器为KDN-08凯氏定氮仪。

1.2 试验方法

试验采用单因子试验设计，分别研究不同消化温度、消化时间、催化剂用量、硼酸吸收液加碱量、蒸馏时间、盐酸浓度对凯氏定氮测定结果的影响。

1.2.1 消化温度的影响试验试验过程中选用材料为大豆粕。将消化温度设为380 ℃、400 ℃、420 ℃、440 ℃、460 ℃共5个处理，使用凯氏定氮法对样品进行消化蒸馏滴定，比较在不同消化温度条件下的测量结果。

1.2.2 消化时间的影响试验试验过程中选用材料为大豆粕。将消化时间设为30min、60min、120min、180min、240min、300min共6个处理，使用凯氏定氮法对样品进行消化蒸馏滴定，比较在不同消化时间条件下的测量结果。

1.2.3 不同催化剂用量的影响试验选用大豆粕为试验样品，选用硫酸铜和硫酸钾两种混合催化剂进行对比试验，其比例为1：15，催化剂用量设为3.4 g、4.4 g、5.4 g、6.4 g、7.4 g共5个处理，使用凯氏定氮法对样品进行消化蒸馏滴定，比较在不同催化剂用量条件下的测量结果。

1.2.4 硼酸吸收液加碱的影响试验在试验过程中参照《GB/T6432-1994饲料中粗蛋白测定方法》[5]中硼酸的配置方法，同时设置2个处理，分别在1000 ml硼酸吸收液中加入0.5 ml 4%氢氧化钠和不加氢氧化钠。每个处理测定3个平行。

1.2.5 蒸馏时间的影响试验选用大豆粕为试验样品，试验过程中将蒸馏时间设为3min、4min、5min、6min、7 min共5个处理，依据凯氏定氮法进行消化蒸馏滴定。

1.2.6 盐酸浓度的影响试验试验过程中分别选用鱼粉、大豆粕、玉米秸秆为试验样品，每个试验样品的盐酸浓度依次设为0.10、0.05、0.01 mol/L共3个处理，依据凯氏定氮法进行消化蒸馏滴定。

1.3 数据处理

试验采用单因子完全随机化设计，数据采用SAS8.1统计软件中的广义线性模型（GLM）进行方差分析和多重比较（SNK）。

2 结果

2.1 消化温度的影响

试验结果表明，在380℃和400℃的消化管中的溶液为不透明的黑色，意味着其未能完全消化，其他温度下消化试管中均为蓝色透明。各处理的凯氏定氮法测定结果见图1，图1表明，消化温度为420℃时所测得的粗蛋白相对含量高于其他处理，测定结果更准确。

图1 不同消化温度对凯氏定氮测定结果的影响

2.2 消化时间的影响

试验结果表明，30min消化后的样品为黑色，而60min消化的样品为淡蓝色，其他消化时间的样品颜色均为蓝色透明。各处理的凯氏定氮法测定结果见图2，当样品消化时间为30min时，其蛋白质含量偏低，随着消化时间的逐渐增加，蛋白质测定值逐渐提高。当其消化时间为2h时，到达临界点增长速度放缓，甚至和消化5h后的蛋白质含量无明显差异，由此可以得出结论，消化时间控制在2h时最为适中。

图2 不同消化温度对凯氏定氮测定结果的影响

2.3 催化剂用量的影响

试验结果表明，当催化剂用量为3.4g和4.4g时，消化后试验样品颜色为黑色。当催化剂用量为6.4g时，消化后试验样品为蓝色透明，当催化剂用量为7.4g时，试验组消化管内存有黑色物体。

图3 不同催化剂用量对凯氏定氮测定结果的影响

2.4 硼酸吸收液加碱的影响

试验结果表明，硼酸吸收液加碱与否对试验结果有直接影响。从表1中可知，硼酸加碱所测得的空白值大于不加碱的处理，但对样品粗蛋白的测定结果的影响极小，可以忽略不计。

表1 硼酸吸收液加碱对粗蛋白相对含量测定结果的影响

2.5 蒸馏时间的影响

试验结果见图4，由图可知，当蒸馏时间在5～7min时，粗蛋白测定值较为接近，可认为试验消化管中存有的游离氨可被全部蒸馏出来，被硼酸完全吸收；当蒸馏时间为3～4min时，粗蛋白测定值偏低，可认为消化管内游离氨未蒸发完全；表明当蒸馏时间控制在5min时，消化管内的游离氨完全蒸发。

图4 不同蒸馏时间对凯氏定氮测定结果的影响

2.6 盐酸浓度的影响

试验结果如表2所示。试验结果表明，在鱼粉粗蛋白的测定中，盐酸的浓度越低，试验测定差异就越大。在豆粕粗蛋白的测定中，盐酸的浓度越低，试验测定差异就越大。而玉米秸秆粗蛋白的测定中，盐酸浓度越高，测定误差越大。

表2 不同样品盐酸滴定的平均消耗用量，ml

3 讨论

3.1 消化温度的影响

凯氏定氮法测定粗蛋白过程中，消化温度会直接影响样品的消化速度，一般要求控制消化温度不使消化速度过快，刚开始时以小火为宜，等到样品焦化后再提高温度。必要时可以晃动瓶身消除因消化而产生的泡沫，避免消化不完全。研究发现，当消化温度低于420℃时，数据结果偏小。但若温度升温过快，部分含氨物质无法在规定时间内转化为硫酸铵，甚至是以气体形式损失掉，则容易造成测定结果偏低。《GB/T6432-1994饲料中粗蛋白测定方法》[5]中规定消化温度为360℃～410℃，但实际消化时可针对实际情况进行适当调整，当然消化温度一般不超过450℃，否则造成蛋白质分解，影响试验结果准确性[6]。