大肠杆菌的分离及生化鉴定

张培东

（高密市畜牧局，山东高密 261500）

大肠杆菌的分离及生化鉴定

张培东

（高密市畜牧局，山东高密 261500）

大肠杆菌病是危害世界养鸡业的重要传染病。大肠杆菌是定居在人和动物肠道内的正常菌群，正常情况下是不致病的。在特定的条件下，某些血清型的大肠杆菌能够引起一系列的感染，但是随着抗生素在各个领域中的频繁、超量使用引起了大肠杆菌高耐药性和多重耐药性，给临床治疗带来了难度，使得多种抗生素在治疗大肠杆菌的效果也不尽人意；文章针对潍坊某肉鸡养殖场的发病情况，采集病死鸡的病料进行致病性大肠杆菌的分离鉴定，为今后指导该养殖场的临床治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料

从潍坊某肉鸡养殖场无菌采集疑似大肠杆菌病（包心包肝）的病死鸡肝脏，连续采集3批次，每次共8个鸡舍，每舍采6～10只不等。

1.1.2 培养基

麦康凯、普通营养琼脂、三糖铁、营养肉汤；葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水、枸橼酸盐等微量发酵管均购自杭州天和微生物试剂有限公司；

1.1.3 试剂

0.5%苯酚生理盐水、吲哚试剂、M-R试剂、V-P试剂均为实验室自行配制。

1.1.4 主要仪器

医用净化工作台、电热恒温培养箱、空气浴振荡器、冰箱、电热恒温水浴锅、六联电子调温万用电炉、台式离心机、高速冷冻离心机、电子天平、可调式微量移液器。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离培养及形态学观察

无菌采集肝脏病料，分别接种于普通培养基、麦康凯培养基上，划线分离，37℃培养18～24h，在麦康凯培养基上形成圆形、扁平、边缘整齐、表面光滑湿润的红色菌落，在普通培养基上形成灰白色边缘整齐的菌落为大肠杆菌可疑菌落；选择可疑菌落继续进行划线分离培养，得到纯化好的单个菌落后，用白枪头接种到盛有5mL营养肉汤的试管中，37℃空气浴振荡器中200rpm振荡培养8h，得到呈均匀浑浊细菌菌液。挑选符合特征的单菌落进行革兰氏染色，镜检，革兰氏阴性短杆菌者为疑似，进行后续的生化鉴定。

1.2.2 生化鉴定

用五糖发酵、IMViC、三糖铁、尿素酶试验进行生化鉴定。按照常规方法用灭菌接种环挑取一环事先保存的菌液，接种于麦康凯培养基上，37℃培养18～24h，得到单一菌落后，进行纯培养，进行三糖铁、五糖发酵、IMViC、尿素酶试验进行生化鉴定；能分解葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇产酸产气，不分解蔗糖，三糖铁斜面和底部均为黄色，且有气体产生，不产H2S，IMViC的实验结果为“++--”的细菌判定为大肠杆菌。

2 结果与分析

2.1 细菌的分离培养及形态学观察

麦康凯培养基上形成圆形、扁平、边缘整齐、表面光滑湿润的红色菌落，在普通培养基上形成灰白色边缘整齐的菌落，普通肉汤中呈均匀浑浊生长；革兰氏染色镜检可见多是散在排列的粉红色、两端钝圆的短杆菌。共分离130株菌株。

2.2 生化试验结果

将分离到130株菌株按照常规方法采用五糖发酵、三糖铁、IMVIC试验，进行生化鉴定，结果见表1。

表1 130株大肠杆菌的生化鉴定结果

以上实验结果通过乳糖发酵试验，以及吲哚试验及乳糖发酵实验结果可以看出，分离到的130株菌株，其中120株符合大肠杆菌的生化特性。

3 讨论

通常大肠杆菌的测定是通过在培养基上培养，显微镜镜检，以及生化实验来鉴定的。生化实验通常用五糖发酵、IMViC、三糖铁等试验进行鉴定。大肠杆菌大部分能够分解乳糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露醇并产酸产气；三糖铁斜面和底部均为黄色，且底部有气体产生，但不产H2S，不能利用枸橼酸盐，吲哚试验为阳性，M-R试验阳性，V-P试验阴性，即IMViC为“++--”。但在上述结果中并不是每个菌株都符合大肠杆菌标准的实验结果，从不符合标准的菌株中挑选了两株进行测序，结果证明这两株是大肠杆菌，故除可以用生化实验进行大肠杆菌的鉴定之外，还可以配合16Sr RNA测序进行细菌的鉴定。

4 小结

经分离鉴定得到120株大肠杆菌，为以后筛选敏感的治疗药物和血清型鉴定奠定基础。