宫颈癌组织中Ang-2及其受体Tie-2的表达变化

任新萍，邵伟伟，薛金玲

(盐城市第一人民医院，江苏盐城224006)

宫颈癌组织中Ang-2及其受体Tie-2的表达变化

任新萍，邵伟伟，薛金玲

(盐城市第一人民医院，江苏盐城224006)

目的观察宫颈癌组织中血管生成素-2(Ang-2)和其受体酪氨酸激酶受体2(Tie-2)表达变化，并探讨其临床意义。方法选择2014年1月～2017年1月收治的86例宫颈癌患者的手术切除宫颈癌组织标本为观察组，同期收治的86例子宫肌瘤患者的正常宫颈组织标本为对照组。采用免疫组化法定性检测两组Ang-2、Tie-2蛋白表达情况。采用RT-PCR法定量检测两组Ang-2、Tie-2 mRNA表达量，采用Western blotting法定量检测两组Ang-2、Tie-2蛋白表达量。分析宫颈癌组织Ang-2、Tie-2蛋白定性表达情况与宫颈癌临床病理参数的关系。结果观察组Ang-2、Tie-2 mRNA及蛋白表达量均高于对照组(P均<0.05)。免疫组化染色结果观察组Ang-2表达阳性51例(59.30%)、Tie-2表达阳性54例(62.79%)，对照组Ang-2表达阳性35例(40.70%)、Tie-2表达阳性37例(43.02%)，观察组Ang-2、Tie-2蛋白阳性表达率均高于对照组(P均<0.05)。宫颈癌组织Ang-2、Tie-2阳性表达与宫颈癌FIGO分期、淋巴结转移有关(P均<0.05)，与年龄、组织学类型、分化程度无关(P均>0.05)。结论宫颈癌组织Ang-2和其受体Tie-2表达上调。检测宫颈癌组织Ang-2和其受体Tie-2表达有助于判断宫颈癌患者的FIGO分期和淋巴结转移情况。

宫颈肿瘤宫颈癌；血管生成素-2；络氨酸激酶受体2

宫颈癌为妇科临床十分厂家的恶性肿瘤，对女性健康造成严重威胁。临床研究发现，造成宫颈癌患者死亡的直接原因是肿瘤细胞自身增殖、浸润以及转移等，肿瘤新生是存在于以上过程的一个共同特征[1，2]。新生血管形成过程十分复杂，受到多种生长因子以及细胞因子的共同调控，并且此两类因子保持动态平衡。如血管生长因子水平上升或血管生成抑制类因子减少，二者平衡状态被打破，则会造成肿瘤新生血管大量生成。血管生成素能够对肿瘤血管生成产生重要调控作用[3，4]。血管生成素家族成员血管生成素2(Ang-2)能够和内皮细胞独有的一种激酶受体络氨酸激酶受体2(Tie-2)相结合，参与乳腺癌、肺癌的新生血管生成。但是宫颈癌组织中Ang-2及其受体Tie-2表达变化及其临床意义尚不明确。本研究观察了宫颈癌组织Ang-2和其受体Tie-2表达变化，并探讨其临床意义。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2014年1月～2017年1月收治的86例宫颈癌患者的手术切除宫颈癌组织标本为观察组。纳入标准：①符合WHO关于宫颈癌的有关诊断标准[5]；②年龄≥35岁；③入组前均未实施过放化疗或生物免疫治疗。排除标准：①有严重的心、肝、肾等有关脏器功能不全者；②有其他类型的恶性肿瘤者；③病历资料缺失者。患者年龄35～64(46.81±2.13)岁，其中<40岁者29例，≥40岁者57例。FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期51例，Ⅲ～Ⅳ期35例。鳞癌59例，腺癌27例。分化程度低分化22例，中分化36例，高分化28例。有淋巴结转移者29例，无淋巴结转移者57例。另选同期因子宫肌瘤接受手术治疗的86例患者的正常宫颈组织标本为对照组。患者年龄35～62(46.84±2.05)岁。两组患者年龄相比P>0.05。本研究已经我院医学伦理委员会批准，入组患者均已签署知情同意书。

1.2 Ang-2、Tie-2 mRNA检测 采用RT-PCR法。用Trizol法提取总RNA，逆转录后行RT-PCR。用β-actin为内参照。Ang-2上游引物5′-CTTATGAGCGAGAATGGG-3′，下游引物5′-TAGGTTGTTGGGTTGTTT-3′，扩增产物长度181 bp。Tie-2上游引物5′-TGAACCTTGTAACGGATAG-3′，下游引物5′-TAGGTTGTTGGGTTGTTT-3′，扩增产物长度245 bp。内参照β-actin上游引物5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，下游引物5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′，扩增产物长度250 bp。PCR反应条件95 ℃ 5min，然后94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，进行28个循环。取5 μL的PCR产物行凝胶电泳，Ang-2/Tie-2 mRNA表达量用Ang-2/Tie-2 条带与内参照β-actin条带灰度值之比表示。

1.3 Ang-2、Tie-2蛋白检测 ①定性检测：采用免疫组化SP法。将两组石蜡标本4 μm连续切片，65℃下烤片过夜，而后脱蜡水化，用3%的过氧化氢对其中的内源型过氧化物酶行10 min的灭活处理，再给予2 min的PBS冲洗，共冲洗3遍。再行抗原热修复，pH=9.0条件下70℃孵育20 min，给予20 min的PBS冲洗。在室温下用羊血清封闭约10 min，加入一抗在室温下孵育1 h，PBS冲洗，加入二抗在室温下孵育约25 min，PBS冲洗3遍。而后用DAB显色液对其显色7 min，PBS冲洗。用苏木精复染，脱水、透明、并封固切片。显微镜下观察，细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性染色，随机选择10个高倍镜视野，阳性染色细胞比例≥5%为阳性表达。②定量检测：采用Western blotting法。将两组标本匀浆，加入尿素裂解液冰上裂解1 h，4 ℃下3 000 r/min离心20 min，收集上清液用12%的SDSPAGE电泳分离蛋白，半干法转印到PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭60 min，加入一抗4 ℃孵育过夜，加入二抗37 ℃孵育50 min，ECL显影，凝胶成像系统成像。以β-actin为内参照，Ang-2/Tie-2 蛋白表达量用Ang-2/Tie-2 条带与内参照β-actin条带灰度值之比表示。

2 结果

2.1 两组Ang-2、Tie-2 mRNA及蛋白表达比较 观察组、对照组Ang-2、Tie-2 mRNA及蛋白表达量见表1。观察组Ang-2、Tie-2 mRNA及蛋白表达量均高于对照组(P均<0.05)。免疫组化染色结果观察组Ang-2表达阳性51例(59.30%)、Tie-2表达阳性54例(62.79%)，对照组Ang-2表达阳性35例(40.70%)、Tie-2表达阳性37例(43.02%)，观察组Ang-2、Tie-2蛋白阳性表达率均高于对照组(P均<0.05)。

2.2 宫颈癌组织Ang-2、Tie-2阳性表达与宫颈癌病理病理参数的关系 见表2。宫颈癌组织Ang-2、Tie-2阳性表达与宫颈癌FIGO分期、淋巴结转移有关(P均<0.05)，与年龄、组织学类型、分化程度无关(P均>0.05)。

表1 两组Ang-2、Tie-2的mRNA及蛋白表达量比较

注：与对照组相比，*P<0.05。

表2 宫颈癌组织Ang-2、Tie-2阳性表达与宫颈癌病理病理参数的关系(例)

3 讨论

伴随宫颈细胞学类型检查技术在临床的推广普及，宫颈癌的发病率以及病死率均明显下降，但我国低龄人群宫颈癌发病率以及病死率仍不断上升。宫颈癌目前仍然是威胁我国女性生命健康的重要杀手之一。有关宫颈癌预防及治疗的相关研究仍需大力开展[6]。目前已经证实肿瘤细胞自身浸润以及转移等活动均依赖血管生成，且血管生成受到各项调节因子的精准调控[7，8]。新生血管既能够为肿瘤组织供应营养，同时还为癌细胞顺利进入血液循环系统进行血行扩散以及远处转移等创造必要条件。研究发现Ang和血管生成关系密切，并且其中Ang-2及其受体Tie-2对肿瘤组织血管生成及转移等非常重要[9～11]。

本研究结果显示，宫颈癌组织Ang-2、Tie-2蛋白阳性表达率、mRNA表达量和蛋白表达量均高于正常宫颈组织，这与戴珍珍等[12，13]的报道相符，提示宫颈癌组织内Ang-2、Tie-2表达上调，血管新生活跃。这可能与二者的形成及作用机制有关。具体来说，Ang家族包括4种蛋白，目前了解较多的为Ang-1和Ang-2。Ang-1为Tie-2的激活剂，有助于维持血管完整性，并对血管成熟起到关键作用。Ang-2为Ang-1的一种天然拮抗剂，能对Ang-1的稳定血管功能起到抑制作用。研究发现，Ang-2自身无刺激血管增殖功能，且其对血管生成所发挥的调节作用存在两面性[14，15]。首先，Ang-2可和Tie-2受体相结合，进而抑制细胞内信号发生传导，使得内皮细胞和血管外周细胞二者间相互作用遭到破坏。并且导致介导基质和原本存在的血管基底膜等破解，造成血管内皮以及基质等稳定状态被打破。在此类不稳定状态环境中，血管内皮细胞和其周围基质均提升自身对生长因子所表现的敏感性，因此，当有生长因子存在情况下，Ang-2能够促进血管形成，诱发血管出芽，进而使得血管重建。而Tie-2为Ang-2的受体，其能够在胚胎时期于血管内皮中表达。当成年之后，Tie-2通常表达于人体肺脏以及卵泡等具备血管生成活跃特点的血管内皮上，并能够帮助维护血管完整性。研究[16，17]证实，Ang-2/Tie-2系统会对肿瘤血管新生发挥关键调控作用，表现为当Ang-2与Tie-2相结合之后并不会引起Tie-2的磷酸化，而是使血管内皮细胞和其周围细胞之间的连接发生离断，进而参与新生血管生成。

本研究同时分析了宫颈癌组织Ang-2、Tie-2阳性表达与宫颈癌病理病理参数的关系，结果显示宫颈癌组织Ang-2、Tie-2阳性表达与宫颈癌患者年龄、组织学类型、分化程度无关，与宫颈癌FIGO分期、淋巴结转移有关，FIGO分期高者和有淋巴结转移者Ang-2、Tie-2阳性表达率相对较高。这提示了病情严重的宫颈癌患者具有更高的Ang-2和Tie-2阳性表达率。原因考虑是因为Ang-2与Tie-2的阳性表达会对肿瘤组织以及其周围组织等血管生成起到促进作用，利于癌细胞的增殖，因此可能会进一步加重癌症病情[18～20]。这也提示检测宫颈癌组织Ang-2和其受体Tie-2表达有助于判断宫颈癌患者的FIGO分期和淋巴结转移情况。

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江苏省科技计划项目(BK2015113)。

薛金玲(E-mail：xuejinling_1964@papmedhos.club)。