Ⅱ～Ⅲ期上皮性卵巢癌原发灶及转移灶中miR-199a-5p表达变化及其意义

彭靓,叶萍,陈国庆,谢晓英

(赣南医学院第一附属医院, 江西赣州 341000)

·临床研究·

Ⅱ～Ⅲ期上皮性卵巢癌原发灶及转移灶中miR-199a-5p表达变化及其意义

彭靓,叶萍,陈国庆,谢晓英

(赣南医学院第一附属医院,江西赣州341000)

目的观察Ⅱ～Ⅲ期上皮性卵巢癌原发灶及转移灶中miR-199a-5p表达变化，并探讨其临床意义。方法选择52例Ⅱ～Ⅲ期上皮性卵巢癌患者卵巢癌组织标本为卵巢癌原发组，卵巢癌盆腔淋巴结转移灶标本为卵巢癌转移组，29例良性上皮性卵巢肿瘤患者的肿瘤组织标本为良性组，32例因子宫肌瘤行子宫附件切除术患者的正常卵巢组织标本为对照组。采用实时荧光定量PCR法检测四组标本中miR-199a-5p表达量，并分析上皮性卵巢癌组织miR-199a-5p表达量与上皮性卵巢癌FIGO分期、病理分级及组织学类型的关系。结果卵巢癌原发组、卵巢癌转移组、良性组、对照组标本miR-199a-5p表达量分别为1.058±0.306、0.704±0.343、4.335±0.666、4.414±0.470。卵巢癌原发组miR-199a-5p表达量低于良性组和对照组(P均<0.05)，卵巢癌转移组miR-199a-5p表达量低于良性组和对照组(P均<0.05)，卵巢癌转移组miR-199a-5p表达量低于卵巢癌原发组(P<0.05)，良性组和对照组miR-199a-5p表达量相比P>0.05。上皮性卵巢癌组织miR-199a-5p表达量和卵巢癌FIGO分期有关(P<0.05)，与病理分级和组织学类型无关(P均>0.05)。结论Ⅱ～Ⅲ期上皮性卵巢癌原发病灶和盆腔淋巴结转移灶组织中miR-199a-5p表达降低。检测上皮性卵巢癌原发病灶组织中miR-199a-5p表达量有助于判断上皮性卵巢癌的FIGO分期。

卵巢癌；上皮性卵巢癌；微小RNA；微小RNA199a-5p

卵巢癌是妇科常见三大恶性肿瘤之一，据国家癌症中心最新数据估计，2013 年卵巢癌发病例数为5万例，发病率约为7.53/10万，位居女性恶性肿瘤发病的第10位[1]。上皮性卵巢癌是最常见的卵巢恶性肿瘤，5年生存率一直徘徊在30%～40%，严重威胁妇女生命和健康[2]。因此，明确上皮性卵巢癌发病机制，并寻找早期诊断和治疗方法至关重要。微小RNA(miRNA)是一类大小19～25个核苷酸的内源性非编码RNA，其与肿瘤的关系是目前的研究热点[3，4]。MiR-199a-5p是miRNA的一种，在各种肿瘤组织中表达不一，其在宫颈癌[10]、肝癌[11]组织中表达下调，而在胃癌[12]、结直肠癌[13]组织中表达上调。但是目前未有miR-199a-5p在上皮性卵巢癌组织中表达情况的研究报道。本研究观察了Ⅱ～Ⅲ期上皮性卵巢癌原发灶及转移灶组织中miR-199a-5p表达变化，并分析其与上皮性卵巢癌FIGO分期、病理分级、组织学类型的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择赣南医学院第一附属医院妇科2014年5月～2015年12月收治的52例Ⅱ～Ⅲ期上皮性卵巢癌患者的卵巢癌组织标本为卵巢癌原发组，淋巴结转移灶组织标本为卵巢癌转移组。患者年龄 22～71岁，平均47岁。均经术后病理检查证实。按FIGO2009卵巢癌诊断及分级标准，FIGO分期Ⅱ期22例，Ⅲ期30例；病理分级G1级13例，G2级23例，G3级16例；组织学类型浆液性腺癌 25例、黏液性腺癌21例，子宫内膜样癌 4 例，透明细胞癌2例。所有患者术前均未接受过放疗、化疗或激素治疗。选择29例良性上皮性卵巢肿瘤患者的卵巢肿瘤组织标本为良性组，患者年龄18～68岁，平均45岁。选择因子宫肌瘤行子宫附件切除术的32例患者的正常卵巢组织标本为对照组，患者年龄19～62岁，平均47岁。三组患者均未合并其他器官肿瘤或内外科合并症。三组患者年龄相比P>0.05。本研究已获得医院伦理委员会批准，患者均已签署知情同意书。

1.2 miR-199a-5p检测 采用实时荧光定量PCR法。标本离体后10 min内置于去除RNase的冻存管中，经液氮罐迅速冷冻后置-196 ℃保存待测。检测时取各组标本用液氮研磨法磨成粉末并称取合适量，加入总RNA提取试剂NcmZolReagent，按NcmZolReagent试剂说明书的步骤提取总RNA。分光光度计检测RNA溶液D260/D280比值，计算RNA浓度和纯度，比值若在1.8～2.1，说明提取的总RNA较纯，进行后续实验，否则弃用。行逆转录，反应条件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 40 min，85 ℃ 10 min。行实时荧光定量PCR，以U6 为内参照。引物购自上海吉玛生物技术有限公司。miR-199a-5p上游引物5′-GTCGATACCAGTGCGTGTCGTCCTGTCGGC-3′，下游引物5′AATTGCACTGGATACGACAGCCTAT-3′。U6上游引物 5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。PCR 反应条 件 ：95 ℃变性 5 min， 94 ℃ 30 s、60 ℃ 20 s、70 ℃ 45 s共40个循环。重复3次。 用2-ΔΔCt表示各组miR-199a-5p表达量。

2 结果

2.1 各组标本miR-199a-5p表达量比较 卵巢癌原发组、卵巢癌转移组、良性组、对照组标本miR-199a-5p表达量分别为1.058±0.306、0.704±0.343、4.335±0.666、4.414±0.470。卵巢癌原发组miR-199a-5p表达量低于良性组和对照组(P均<0.05)，卵巢癌转移组miR-199a-5p表达量低于良性组和对照组(P均<0.05)，卵巢癌转移组miR-199a-5p表达量低于卵巢癌原发组(P<0.05)，良性组和对照组miR-199a-5p表达量相比P>0.05。

2.2 上皮性卵巢癌组织miR-199a-5p表达量和卵巢癌临床病理参数的关系 见表1。上皮性卵巢癌组织miR-199a-5p表达量和卵巢癌FIGO分期有关(P<0.05)，与病理分级和组织学类型无关(P均>0.05)。

3 讨论

上皮性卵巢癌是最常见的卵巢恶性肿瘤，占卵巢恶性肿瘤的85%～90%，病死率高居妇科恶性肿瘤之首。由于卵巢恶性肿瘤的生成是多环节、多因素作用的结果，基因功能和表达的异常通常直接参与卵巢癌的发生发展过程，如原癌基因的激活和抑癌基因的突变等，而侵袭转移是导致恶性肿瘤患者死亡的最关键因素之一。探寻参与上皮性卵巢癌发生、侵袭、转移过程的基因并加以干预有可能为治疗上皮性卵巢癌提供新的途径。

表1 上皮性卵巢癌组织miR-199a-5p表达量和卵巢癌临床病理参数的关系

研究表明，miRNAs调控着人类1/3基因的表达，参与肿瘤发生发展[5，6]。Calin等[7]首次证实了miRNA在人类恶性肿瘤慢性淋巴细胞性白血病中的作用，miR-15a/miR-16-1被确定为肿瘤抑制因子。miR-200a高表达与卵巢癌组织学类型和分期有关，淋巴结转移患者转移灶中miR-200c表达显著升高，血浆中的miR-200a和miR-200c可能是诊断卵巢癌的标记物[8]。miR-199a-5p是由其基因转录初产物pri-miR-199a经酶剪切并加工成熟后形成的，miR-199a由位于19号染色体和1号染色体上的2种基因剪切产生[9]。由于组织细胞中存在多种miRNA的表达，并且同一种miRNA在不同组织中的表达情况也各不一样，因此有报道miR-199a-5p在各类肿瘤组织中的表达报道不一，其在宫颈癌[10]及肝癌[11]中表达下调，而在胃癌[12]及结直肠癌[13]中表达上调。He等[12]研究发现，相比正常胃黏膜组织，miR-199a-5p在胃癌组织中显著上调，并且miR-199a-5p能够增加胃癌细胞迁移和侵袭能力，晚期肿瘤或是有淋巴结转移患者中miR-199a-5p表达水平相对较高。邹阮敏等[14]的研究报道了miR-199a-5p在宫颈癌及宫颈上皮内瘤变组织中的表达低于正常组织，并且miR-199a-5p表达与宫颈癌的组织分化程度存在一定相关性，而宫颈癌小细胞的miR-199a-5p表达低于其他组织分化类型的标本。miR-199a-5p在宫颈癌组织中的异常表达。miR-199a-5p有望成为宫颈癌新的治疗靶点。

本研究结果显示，卵巢癌原发灶和转移灶组织中 miR-199a-5p 表达量明显低于良性卵巢肿瘤及正常卵巢组织，提示 miR-199a-5p与上皮性卵巢癌的发病具有密切联系。卵巢癌转移灶中 miR-199a-5p表达量低于原发灶，提示miR-199a-5p可能参与卵巢癌的转移过程。有研究表明，复发性卵巢癌和原发性卵巢癌组织中miR-199a-5p表达具有差异性，且miR-199a-5p表达量与患者无进展生存、总生存率有关[15]。这一研究进一步提示我们miR-199a-5p表达量与卵巢癌转移及预后有关。国内李燕彬等[16]检测了miR-199a-5p在胃癌组织及癌旁正常组织表达情况，miR-199a-5p在胃癌中表达较正常胃黏膜组织明显下降，miR-199a-5p的表达量与肿瘤大小、分期、分化程度、有无淋巴结转移具有相关性。本研究结果显示上皮性卵巢癌原发灶miR-199a-5p表达量与上皮性卵巢癌FIGO分期有关，Ⅲ期上皮性卵巢癌原发灶miR-199a-5p表达量低于Ⅱ期上皮性卵巢癌，进一步表明miR-199a-5p参与上皮性卵巢癌的发生发展过程，并且与上皮性卵巢癌的进展相关。但本研究结果显示，上皮性卵巢癌原发灶miR-199a-5p表达量与上皮性卵巢癌病理分级、组织学类型无关。考虑为样本量较小导致的，今后如有条件，可进一步扩大样本量继续研究。

综上，Ⅱ～Ⅲ期上皮性卵巢癌原发病灶和盆腔淋巴结转移灶组织中miR-199a-5p表达降低。检测上皮性卵巢癌原发病灶组织中miR-199a-5p表达量有助于判断上皮性卵巢癌的FIGO分期。在miR-199a-5p可能在上皮性卵巢癌发生、发展过程中发挥抑癌基因的功能，但这一功能的具体机制不明，今后可以对此进行研究，寻找相关分子通路上游或下游靶基因，进一步认识卵巢癌发病的分子机制，并加以干预。

[1] 陈万青,郑荣寿,张思维,等.2013年中国恶性肿瘤发病和死亡分析[J].中国肿瘤,2017, 26(1):1-7.

[2] 华克勤,丰有吉.实用妇产科学[M].3版.北京：人民卫生出版社,2013:567.

[3] Kavitha N, Vijayarathna S, Jothy SL, et al. MicroRNAs: biogenesis, roles for carcinogenesis and as potential biomarkers for cancer diagnosis and prognosis[J].Asian Pac J Cancer Prev, 2014,15(15):7489-7497.

[4] 宁莉,魏殿军.急性肾损伤相关miRNA的研究进展[J]. 山东医药, 2017，57(14).110-112.

[5] Krol J, Loedige I, Filipowicz W. The widespread regulation of microRNA biogenesis function and decay[J]. Nat Rev Genet, 2010,11(9):597-610.

[6] Acunzo M, Croce CM. MicroRNA in cancer and cachexia--a mini-review[J]. J Infect Dis, 2015,212(Suppl 1):74-77.

[7] Calin GA, Dumitru CD, Shimizu M, et al. Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002,99(24):15524-15529.

[8] Zuberi M, Mir R, Das J, et al. Erratum to: Expression of serum miR-200a, miR-200b and miR-200c as candidate biomarkers in epithelial ovarian cancer and their association with clinicopathological features[J].Clin Transl Oncol, 2015,17(10):779.

[9] Duan Q, Wang X, Gong W, et al. ER stress negatively modulates the expression of the miR-199a/214 cluster to regulates tumor survival and progression in human hepatocellular cancer[J]. PLoS One, 2011,7(2):31518.

[10] Huang L, Lin J X, Yu Y H, et al. Downregulation of six microRNAs is associated with advanced stage, lymph node metastasis and poor prognosis in small cell carcinoma of the cervix[J]. PLoS One, 2012,7(3):e33762.

[11] Shen Q, Cicinnati VR, Zhang X, et al. Role of miR-199a-5p and discoidin domain receptor 1 in human hepatocellular carcinoma invasion[J]. Mol Cancer, 2010,9(7):227.

[12] He XJ, Ma YY, Yu S, et al. Up-regulated miR-199a-5p in gastric cancer functions as an oncogene and targets klotho[J]. BMC Cancer, 2014,14(1):218.

[13] Hu Y, Liu J, Jiang B, et al. MiR-199a-5p loss up-regulated DDR1 aggravated colorectal cancer by activating epithelial-to-mesenchymal transition related signaling[J]. Dig Dis Sci, 2014,59(9):2163-2172.

[14] 邹阮敏,胡芝,陈昊,等.miR-199a在宫颈癌及宫颈上皮内瘤样病变中的表达及意义[J].医学研究杂志,2011,40(7):55-59.

[15] Marchini S, Cavalieri D, Fruscio R, et al. Association between miR-200c and the survival of patients with stage I epithelial ovarian cancer: a retrospective study of two independent tumour tissue collections[J]. Lancet Oncol, 2011,12(3):273-285.

[16] 李燕彬,胡宝光,李玉明,等.MicroRNA-199a-5p在胃癌组织中的表达及其意义[J].滨州医学院学报,2017,40(1):4-6.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.35.012

R737.31

B

1002-266X(2017)35-0039-03

2017-06-07)

国家自然科学基金项目(81360383)。

谢晓英(E-mail:xiexiaoying603@126.com)