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基于反向分子对接技术研究桂枝汤调和营卫的潜在作用靶点

2017-10-10施学丽郭超峰夏猛

中国药房 2017年25期
关键词:肌肉组织桂枝汤营卫

施学丽,郭超峰,夏猛

(1.广西中医药大学科技处,南宁530020;2.广西中医药大学第一附属医院国家药物临床试验机构办公室,南宁 530023;3.广西中医药大学基础医学院,南宁 530020)

·实验研究·

基于反向分子对接技术研究桂枝汤调和营卫的潜在作用靶点

施学丽1*,郭超峰2#,夏猛3

(1.广西中医药大学科技处,南宁530020;2.广西中医药大学第一附属医院国家药物临床试验机构办公室,南宁 530023;3.广西中医药大学基础医学院,南宁 530020)

目的:基于经方的“方证相应”关系和反向分子对接技术研究桂枝汤调和营卫的潜在作用靶点。方法:通过文献检索获得桂枝汤相关的活性成分,采用PharmMapper Server对活性成分进行反向分子对接,依据对接分数排序发现桂枝汤的潜在受体,通过AutoDock Vina进行正向分子对接试验考察配体与受体分子之间的亲和力。然后选取75只大鼠随机分为正常组、模型组和桂枝汤高、中、低剂量组(12、8、4 g/kg),每组15只,除正常组外的其余各组大鼠均复制营卫不和模型;成模后,各组大鼠每天ig给药1次,连续5 d;结束给药后检测大鼠脂肪组织和肌肉组织中11β-羟类固醇脱氢酶1型(11β-HSD1)表达水平。结果:对桂枝汤的活性成分进行反向分子对接发现11β-HSD1为频繁出现的受体,正向对接试验证实乌拉尔甘草皂苷b、甘草次酸、生胃酮等活性成分与11β-HSD1有较高的亲和力。动物实验结果显示,模型组大鼠脂肪组织和肌肉组织中11β-HSD1的表达水平较正常组大鼠升高(P<0.05);桂枝汤高剂量组大鼠脂肪组织和肌肉组织中11β-HSD1的表达水平较模型组降低(P<0.05)。结论:桂枝汤调和营卫的机制与11β-HSD1有一定的相关性;应用反向分子对接技术可以为“方证相应”关系的研究提供一条可行的技术途径。

桂枝汤;反向分子对接;11β-羟类固醇脱氢酶1型;方证关系

ABSTRACTOBJECTIVE:To study the potential targets of Guizhi decoction regulating Ying and Wei based on“correspondence between formulation and syndrome”relationship and reverse molecular docking technology.METHODS:Active ingredients related to Guizhi decoction were obtained by literature retrievals,and PharmMapper Server was used for reverse molecular docking for active ingredients.The potential receptors of Guizhi decoction were found on the basis of docking scores,then AutoDock Vina was conducted for positive molecular docking test to observe the affinity between the ligand and the receptor molecule.75 rats were randomly divided into normal group,model group,Guizhi decoction high-dose,medium-dose,low-dose groups(12,8,4 g/kg),15 in each group.Except for normal group,rats in other groups were induced for models with disharmony between Ying and Wei.After modeling,rats were intragastrically administrated once a day,for 5 d.After administration,11β-HSD1 expression levels in adipose tissue and muscle tissue of rats were detected.RESULTS:Reverse molecular docking for active ingredients of Guizhi decoction found that 11β-HSD1 was the frequent receptor,and positive docking test confirmed that uralsaponin b,glycyrrhetnic acid and carbenoxolone and so on had higher affinity with 11β-HSD1.Results of animal test showed,compared with normal group,11β-HSD1 expression levels in adipose tissue and muscle tissue in model group were increased(P<0.05);and compared with model group,11β-HSD1 expression levels in adipose tissue and muscle tissue in Guizhi decoction high-dose group were decreased(P<0.05).CONCLUSIONS:Guizhi decoction regulating Ying and Wei has certain correlation with 11β-HSD1,while the reverse molecular docking technology can provide a feasible technical way to study“correspondence between formulation and syndrome”relationship.

KEYWORDSGuizhi decoction;Reverse molecular docking;11 β-HSD1;Relationship between formulation and syndrome

中医临床实践证实,经方的方与证之间具有比较确定的对应关系,对“方证相应”关系的研究可以从两方面进行:一方面是从“证”切入,以证为研究对象,从证的实质、客观化、标准化以及动物模型等方向进行;另一方面是从“方”的角度切入,以“方”(药物)测“证”的研究思路进行。

分子对接是依据配体与受体作用的“锁-钥原理”,模拟小分子配体与受体生物大分子相互识别的过程,主要包括静电作用、氢键作用、疏水作用、范德华作用等。经计算,可以预测两者间的结合模式和亲和力。通过分子对接为已知的疾病靶点筛选有效的化合物为正向分子对接技术,常在疾病机制和靶点明确的情况下应用,如通过分子对接研究淫羊藿中所含的雌激素样作用成分[1]、葛根中所含有的改善胰岛素抵抗的物质成分[2]等。反过来,通过分子对接技术为已知的有效成分筛选作用靶点为反向分子对接技术,即以小分子化合物(天然产物等化合物)为探针,在已知结构的靶点数据库内搜寻可能与之结合的生物大分子,通过空间和能量匹配相互识别形成分子复合物,进而预测药物潜在的作用靶点[3]。反向分子对接技术在中医药领域中常用来预测中药有效成分的潜在靶点,如对丹参醇A、丹参酮ⅡB、异鼠李素等潜在作用靶点的研究[4-6]。

应用反向分子对接技术研究经方的方证关系的文献尚少。鉴于经方的“证”研究困难度较大,笔者认为可以依据经方的方证之间相对确定的对应关系,从“方”(药物)的研究角度出发,运用反向分子对接技术筛选经方所含活性成分的作用靶点,然后通过动物实验来考察这些靶点与“证”的相关性,以之反推“证”的内部发生机制,这不失为一条较好的研究途径。在本研究中,笔者应用反向分子对接技术筛选桂枝汤活性成分的作用靶点,又考虑到在临床应用中桂枝汤为治疗营卫不和的专方,所以通过复制营卫不和大鼠模型来考察筛选出的靶点与桂枝汤的相关性,为进一步研究桂枝汤调和营卫的药效机制提供依据。

1 材料

1.1 仪器

Multiskan MK3型酶标仪(美国Thermo Labsystems公司);MIKRO 22R型低温冷冻离心机(德国Hettich公司);VE-180型电泳仪、VE-186型转膜仪(上海天能公司);610C型凝胶成像仪(北京赛智创业科技有限公司)。

1.2 药材与试剂

桂枝汤组方中的药材均购自广西中医药大学第一附属医院;兔源11β-羟类固醇脱氢酶1型(11β-HSD1)抗体试剂盒(英国Abcam公司,批号:GR121826-9);磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)、HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体(北京中山金桥生物技术有限公司,批号:16AF-0408、127760、124227);Super ECL Plus升级版超敏发光液(北京普利莱基因技术公司);Western及IP细胞裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)。

1.3 动物

SPF级SD大鼠75只,♂,8周龄,体质量240~250 g,购于北京华阜康生物科技股份有限公司(动物合格证号:11401300036171)。

2 方法

2.1 药物制备

取桂枝、白芍、甘草、生姜(切片)、大枣(剖开)按原方比例(9∶9∶6∶9∶9)混合,加入5倍蒸馏水浸泡60 min,快速加热至沸腾,然后保持微沸状态15 min,趁热抽滤,收集滤液;剩余药渣加入3倍蒸馏水,浸泡30 min,快速加热至沸,微沸10 min,趁热抽滤。合并2次滤液,水浴浓缩至含生药量为1 g/mL的药液,4℃储存,备用。

2.2 桂枝汤相关活性成分的文献检索

桂枝汤活性成分相关文献检索截止到2016年。以“桂枝汤”和(或)“有效成分”“活性成分”“活性物质”“药效物质”等术语组合为检索主题词,在中国知网上进行中文文献检索,共检索得108篇文献,其中有效文献50篇;以“Guizhi Decoction”“Guizhi Tang”等为检索词,在PubMed上进行外文文献检索,共检索得107篇文献,剔除与中国知网重复的18篇有效文献,得到有效文献8篇。在此检索基础上参考《中药大词典》等资料,综合筛选桂枝汤的活性成分。

2.3 活性成分的反向分子对接与正向分子对接验证试验

PharmMapper Server是反向分子对接的免费网络服务器,该服务器采用了药效团匹配法,通过对Targetbank、Drugbank、Binding DB和PDTD四大数据库进行快速检索而获得药物靶点信息,内含7 302个药效团模型,涵盖了110种临床适应证[7]。从PubChem上下载桂枝汤相关活性成分的标准延时格式文件(.sdf),然后将.sdf格式文件上传到PharmMapper Server上进行反向分子对接。对PharmMapper Server筛选出的潜在靶点根据对接分数进行排序。从蛋白质结构数据库(PBD)中下载潜在靶点的蛋白结构,去除自带配体,加氢及修正处理,然后应用PyRx 0.8软件的AutoDock Vina模块,参数采用默认值,以已知的潜在靶点抑制剂为参照进行验证性的正向分子对接试验。分子对接的配体蛋白质复合体的三维结构采用Pymol软件进行分析。

2.4 动物模型验证实验

2.4.1 分组、造模与给药 将大鼠适应性喂养1周后,随机分为5组,分别为正常组、模型组和桂枝汤高、中、低剂量组,每组15只。除正常组外,其余各组大鼠均采用改进的寒热交替刺激法复制营卫不和大鼠模型[8-9]:先将各组大鼠分次放入特制铁丝笼中,每笼5只,将笼子放入-(20±1)℃冰柜中20 min,中间每隔10 min观察1次。取出大鼠后,放常规饲养室[(25±1)℃]饲养。4 h后进行温热刺激,即将各组大鼠分次放入铁丝笼中,每笼5只,将笼子放入(40±1)℃恒温箱中15 min,中间每隔5 min观察1次。取出大鼠后继续常规饲养。如此每天寒、热交替刺激1次,连续6 d。以大鼠出现蜷缩、扎堆、发抖、背毛凌乱、汗出明显等症状为造模成功标志。造模后,桂枝汤高、中、低剂量组大鼠ig桂枝汤煎剂(中药剂量按成人与大鼠折算系数为6.25,大鼠高、中、低剂量按成人剂量的3、2、1倍来计算,相当于桂枝汤生药量12、8、4 g/kg),正常组和模型组大鼠ig等体积蒸馏水,每天给药1次,连续5 d。

2.4.2 脂肪组织和肌肉组织中11β-HSD1蛋白表达测定 采用Western blot法测定脂肪组织和肌肉组织中11β-HSD1蛋白表达。提取脂肪组织和肌肉组织中的总蛋白,采用二喹啉甲酸(BCA)法测蛋白浓度,取蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳,然后转聚偏氟乙烯(PVDF)膜上;TBST洗膜后,加入封闭液,室温封闭1 h;去掉封闭液,用TBST洗3次,每次8 min;加入用3%胎牛血清(BSA)溶液稀释的一抗溶液,4℃孵育过夜;去掉一抗溶液,用TBST洗3次,每次8 min;加入用3%BSA溶液稀释的辣根酶标记的二抗稀释液,室温孵育1 h;去掉二抗溶液,用TBST洗3次,每次8 min;化学发光、检测。采用Image J软件分析条带灰度值,以目的条带灰度值与内参GAPDH条带灰度值的比值表示目的蛋白的表达水平。

2.5 统计学方法

采用SPSS 23.0软件进行统计分析。采用单因素方差分析,同时进行Levene方差齐性检验,当方差齐时采用LSD检验或SNK检验进行两两比较;方差不齐时采用近似F检验Welch或Brown-Forsythe法进行分析,采用Dunnett’s T3检验或Dunnett’s C检验进行两两比较。P<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 桂枝汤有效成分反向分子对接的作用靶点筛选与正向分子对接试验验证结果

采用反向分子对接技术对文献检索后得到的与桂枝汤相关的104个活性成分进行潜在的作用靶点筛选,结果提示11β-HSD1是桂枝汤重要的潜在作用靶点。

通过反向分子对接程序发现桂枝汤中74个活性成分(配体)与11β-HSD1(受体)具有亲和性;依据对接分数排序选择排前6位的活性成分(以已知的11β-HSD1抑制剂生胃酮为参照)与11β-HSD1进行正向分子对接试验,结果配体与受体分子间的亲和力在-12.2~-9.8 kcal/mol之间(1 kcal=4.186 8 kJ)。亲和力测定结果见表1,配体与受体对接后复合体的三维结构见图1。

图1中活性成分与11β-HSD1氨基酸残基间的作用键主要为氢健。通过桂枝汤活性成分与11β-HSD1的相互作用分析发现,乌拉尔甘草皂苷b与11β-HSD1作用的氨基酸残基主要为 ILE46、GLY47、ASN119、SER170、LYS187、LEU215、THR220和 THR222;甘草次酸与 11 β-HSD1作用的氨基酸残基主要为MET179;没食子酰芍药苷与11β-HSD1作用的氨基酸残基主要为LYS44、ILE46、ASN119、SER170 和 LYS187;白桦脂酸与 11 β-HSD1作用的氨基酸残基主要为THR220;麦珠子酸与11β-HSD1作用的氨基酸残基主要为THR220;苯甲酰芍药苷与11β-HSD1作用的氨基酸残基主要为THR124、SER170、ALA172、TYR183、THR220和THR222。

表1 桂枝汤活性成分与11β-HSD1的亲和力测定结果Tab 1 Determination results of the affinity of active ingredients in Guizhi decoction and 11β-HSD1

图1 活性成分与11β-HSD1的配体对接后的复合体三维结构图Fig 1 Complex three-dimensional structure after the active ingredients docked with 11β-HSD1

3.2 大鼠脂肪组织和肌肉组织中11β-HSD1蛋白表达的测定结果

与正常组比较,模型组大鼠脂肪组织和肌肉组织中11β-HSD1蛋白水平均显著升高(P<0.05)。与模型组比较,桂枝汤各剂量组大鼠脂肪组织中11β-HSD1蛋白水平均不同程度地降低,其中桂枝汤高剂量组差异有统计学意义(P<0.05);桂枝汤高、中剂量组大鼠肌肉组织中11β-HSD1蛋白水平均不同程度地降低,其中桂枝汤高剂量组差异有统计学意义(P<0.05)。蛋白表达电泳图见图2,测定结果见表2。

4 讨论

图2 各组大鼠脂肪组织、肌肉组织中11β-HSD1蛋白表达电泳图Fig 2 Electrophoresis charts of 11β-HSD1 protein expression in adipose issue and muscle tissue of rats in each group

表2 各组大鼠脂肪组织、肌肉组织中11β-HSD1蛋白表达测定结果(x±s,n=15)Tab 2 Determination results of the 11β-HSD1 protein expressions in adipose tissue and muscle tissue of rats in each group(x±s,n=15)

11β-HSD1属短链脱氢/还原酶蛋白超家族,广泛存在于人体各组织中(包括脂肪组织及肝组织)。其在绝大部分的组织和完整细胞中主要以氧化还原酶的形式存在,因其可在糖皮质激素受体前催化无活性的可的松转化为有活性的氢化可的松,因此在组织水平上放大了局部糖皮质激素的作用[10-11]。研究认为,11β-HSD1参与了代谢综合征(如肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病、高血压等)的病理生理环节[12]。通过抑制11β-HSD1活性可有效改善上述病症,对11β-HSD1活性变化和调控机制的深入研究可能为代谢综合征相关的中枢神经系统疾病,如脑血管病、认知功能异常等的治疗带来新的突破。

桂枝汤的药效机制与11β-HSD1之间的相关性尚未见文献报道。笔者通过反向分子对接技术发现11β-HSD1是桂枝汤的潜在靶点,通过动物实验也发现营卫不和模型大鼠脂肪组织和肌肉组织中11β-HSD1蛋白的表达与正常大鼠比较显著增强,而高、中剂量桂枝汤给药后可以下调营卫不和模型大鼠脂肪组织和肌肉组织中11β-HSD1的表达,因而笔者认为营卫不和的内部发生机制与11β-HSD1表达具有关联性。

临床滥用糖皮质激素引起的症状符合营卫不和的临床表现,用桂枝汤治疗效果较好[13-14]。过量的糖皮质激素参与了营卫不和的形成,脂肪组织、肌肉组织内的糖皮质激素升高可以通过受体机制上调11β-HSD1的表达,而11β-HSD1的过度表达又加强了局部糖皮质激素受体的激活。11β-HSD1的天然抑制剂有甘草酸、甘草次酸及其衍生物生胃酮[15-17]、胆汁酸[18]、黄酮/羟基黄酮[19]、大黄素[20]等。其中甘草酸及其衍生物生胃酮是11β-HSD1的非选择性抑制剂。甘草酸可削弱糖皮质激素对于胰岛素的拮抗作用,导致肝对胰岛素的敏感性增加;生胃酮可以降低肝内氢化可的松的浓度,增加胰岛素的敏感性。而甘草次酸等11β-HSD1抑制剂为桂枝汤所含有效成分,从活性成分方面也佐证了11β-HSD1与营卫不和的相关性。

以上研究也提示,虽然桂枝汤组方简单,但其活性成分却十分复杂。有研究发现,仅桂枝汤挥发油中检测出的化学成分就达70多个[21]。复杂的活性成分给筛选桂枝汤的有效作用靶点造成了很大困难,而反向分子对接技术可以为我们提供新的高效筛选手段,为经方“方证相应”关系的研究提供了一条可行的技术途径,对中药复方的药效机制研究也具有较大的借鉴意义。

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Study on the Potential Targets of Guizhi Decoction Regulating Ying and Wei Based on Reverse Molecular Docking Technology

SHI Xueli1,GUO Chaofeng2,XIA Meng3
(1.Dept.Science and Technology,Guangxi University of Chinese Medicine,Nanning 530020,China;2.National Drug Clinical Trials Office,the First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine,Nanning 530023,China;3.College of Basic Medicine,Guangxi University of Chinese Medicine,Nanning 530020,China)

R285

A

1001-0408(2017)25-3479-05

2017-04-28

2017-06-15)

(编辑:林 静)

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.25.07

国家自然科学基金资助项目(No.81360514);广西壮族自治区卫生厅中医药普通课题(No.GZPT13-15);广西壮族自治区教育厅高校科研项目(No.YB2014180)

*副教授,硕士生导师。研究方向:中医药防治情志病。电话:0771-4733953。E-mail:shi.lily@163.com

#通信作者:副教授,硕士生导师。研究方向:中医经方理论与应用。电话:0771-5848765。E-mail:guochaofeng96@163.com

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