芦丁对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用*

赵一灿，张丽华#，赵 文，魏 博，蒋友旭

1)郑州大学第二附属医院心血管内科 郑州 450014 2)郑州大学药学院临床药学教研室 郑州 450001

芦丁对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用*

赵一灿1)，张丽华1)#，赵 文2)#，魏 博2)，蒋友旭1)

1)郑州大学第二附属医院心血管内科 郑州 450014 2)郑州大学药学院临床药学教研室 郑州 450001

芦丁；氧化应激；缺血再灌注损伤；血红素加氧酶-1；大鼠

目的：探讨芦丁对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及机制。方法将雄性SD大鼠随机分假手术组，缺血再灌注损伤模型组，芦丁高(80 mg/kg)、中(40 mg/kg)、低剂量组(20 mg/kg)，共5组，每组10只。结扎冠状动脉左前降支建立心肌缺血再灌注损伤模型，心肌缺血再灌注后超声心动图评估心功能，测定各组大鼠心肌梗死面积，酶标仪检测血清及组织心肌酶生成量和氧化指标活性的变化，HE染色法观察组织细胞形态，免疫印迹法检测血红素加氧酶-1(HO-1)的表达。结果与模型组比较，芦丁治疗组大鼠左心室射血分数及左心室短轴缩短分数升高，心肌梗死面积减小，血清肌酸激酶同功酶、乳酸脱氢酶、谷草转氨酶水平和丙二醛含量降低，超氧化物歧化酶活性和谷胱甘肽含量升高,心肌内HO-1表达增多(P均<0.05)。结论芦丁可提高HO-1的表达、减少和清除氧自由基，起到保护心肌缺血再灌注损伤的作用。

随着药物溶栓疗法、冠状动脉旁路搭桥术、冠状动脉内支架安置扩张术等冠脉血运重建技术的广泛应用，为急性心肌梗死的治疗提供了更多可靠的方法，但同时面临的心肌缺血再灌注(myocardial ischemia/reperfusion，MI/R)损伤问题仍然存在。MI/R损伤具有多因素复杂的机制，其中自由基、钙超载、中性粒细胞浸润等与MI/R损伤关系密切[1-2]。黄酮类化合物在植物界分布非常广泛，具有多种生物活性，包括抗心肌缺血[3]、抑制血小板集聚、抗炎等作用；芦丁又名芸香苷，是黄酮类化合物代表之一，目前对于芦丁对抗MI/R损伤的作用机制方面研究较少。该研究通过运用动物模型探讨芦丁大鼠MI/R损伤的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1实验动物、主要试剂与仪器雄性SD大鼠，SPF级，体重200～250 g，7～8周龄，购于郑州大学实验动物中心，合格证号SCXK(豫)2010-0002，在(25±2)℃的环境温度下饲养，光照条件(12 h/12 h)，自由饮食饮水。芦丁(纯度>98%)，购于上海阿拉丁化学有限公司。肌酸激酶同工酶(isoenzyme of creatine kinase，CK-MB)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、谷草转氨酶(aspartate transaminase，AST)、超氧化物歧化酶(super oxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒均购于南京生物技术研究所。MS-250型小动物超声仪(FUJIFILM VisualSonics公司)，DW3000-B型小动物呼吸机(北京众实迪创科技发展有限责任公司)，心电图机(中国成都，RM6240多导生理信号采集处理系统)，HH-W600型恒温水浴箱(金坛市医疗仪器厂)，TDZ5-WS型高速冷冻离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司)，凝胶成像分析仪(Protein Simple)，DYCZ-40D型转膜电泳仪(北京六一生物科技有限公司)。

1.2动物分组和处理采用随机数字表法将雄性SD大鼠分为假手术组(Sham组)、缺血再灌注损伤模型组(MI/R组)、芦丁高剂量组(RH组)、中剂量组(RM组)、低剂量组(RL组) 5组，每组10只。其中芦丁高、中、低各剂量组动物于术前30 min分别按80、40或20 mg/kg将芦丁溶于CMC-Na 进行灌胃，MI/R组和假手术组于术前30 min用5 g/L CMC-Na进行灌胃。

1.3大鼠MI/R损伤模型建立参照文献[4-5]方法稍加改进，将大鼠称重，戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠后，仰卧固定于手术台上。行气管切开，接动物呼吸机以潮气量 2.5 mL/100 g，80次/min持续通气进行辅助呼吸，大鼠四肢皮下接心电图机电极，描记心电图。胸部脱毛，在心脏搏动最明显处斜向切开皮肤约 1.5 cm，并剪去胸肋上肌肉，暴露肋软骨，于第4～5肋间用弯钩止血钳钝性插入肋间，用扩胸器将肋骨撑开，暴露手术视野，以棉球向下推开左肺，剪开心包，用棉签推开左心耳，充分暴露心脏。在左心耳下2.5～3 mm 处，用 6-0 带线缝合针线穿过一小束心肌，硅胶管置于结扎线与血管之间，拉紧结扎线，使硅胶管压迫冠状动脉左前降支而致闭塞，亦便于切断结扎线再通。结扎后左室壁局部变苍白，局部室壁运动减弱，连续监测心电图可见ST-T弓背抬高，提示结扎成功，缺血30 min后，松解结扎线，再灌注后缺血部位心肌颜色恢复，ST段回落，证实结扎血管再灌注成功，关胸后再灌注24 h。Sham组仅在左冠状动脉前降支位置取同样大小的针穿线而不结扎，其余方法均同MI/R组。在整个手术过程中，大鼠的体温用加热毯维持在37 ℃。

1.4观测指标及方法

1.4.1 心电图监测 冠脉结扎前开始连续检测至结扎后30 min，记录心电图。观察Ⅱ导联T波、ST 段的变化。

1.4.2 超声心动图评估心脏功能 大鼠心肌缺血30 min再灌注24 h后，对大鼠进行超声检查。探头置于其左胸，在取得满意的胸骨旁左心室短轴二维图像后, 在乳头肌水平将 M 型取样线垂直于室间隔和左心室后壁获得 M 型超声心动图，超声系统自动计算左心室射血分数(EF)及左心室短轴缩短分数(FS)；每组原始数据取连续3个心动周期的平均值。

1.4.3 心肌梗死面积和梗死程度的测定 参照文献[6-7]方法，再灌注24 h后取下心脏，-20 ℃冰冻10 min，在结扎线下平行于冠状沟将左心室横切5片，在TTC溶液37 ℃染色6 min后取出心脏，放入体积分数10%甲醛中固定。正常心肌组织呈砖红色，梗死心肌组织不染色，以梗死区面积与左室总面积的比值来表示心肌梗死面积大小, 利用Image-ProPlus 6.0图像分析系统分析。

1.4.4 血清心肌酶谱和氧化应激相关指标的测定

心肌再灌注24 h后，所有的大鼠用戊巴比妥钠麻醉，颈动脉取血，3 000 r/min离心10 min，取血清，-80 ℃保存，按照试剂盒说明书，应用酶标仪测定血清CK-MB、LDH、AST活性。应用试剂盒测定内源性抗过氧化酶的含量。

1.4.5 心肌组织形态学观察 取左室心尖部组织体积分数10%福尔马林固定，常规石蜡包埋切片，二甲苯脱蜡，经各级乙醇漂洗，HE染色、脱水、透明、封片，光学显微镜下观察(200倍)。

1.4.6 血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)蛋白表达的免疫印迹法测定 参照文献[8]进行免疫印迹分析。RIRA裂解心肌组织，提取总蛋白，应用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定，各组取等量蛋白质(50 μg/孔)，完成SDS-PAGE后，进行电转膜，再先后结合一抗和二抗，最后凝胶成像仪曝光。其中一抗HO-1和β-actin分别按11 000和12 500稀释。

1.5统计学处理采用SPSS 17.0进行分析，应用单因素方差分析和LDS-t检验比较各组大鼠心肌梗死面积、血清心肌酶活性(CK-MB、LDH、AST)、氧化应激相关指标(SOD、MDA和GSH)以及左心室EF、FS的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1各组大鼠心肌梗死面积的比较见图1。Sham组大鼠心肌无梗死灶出现。大鼠缺血30 min再灌注24 h后，MI/R模型组大鼠的心肌梗死面积[(52.40±3.32)%]明显增大。与MI/R模型组比较，芦丁高、中、低给药组可明显缩小MI/R大鼠的心肌梗死面积[(20.35±1.16)%、(29.44±4.68)%、(38.33±2.78)%]，差异有统计学意义(F=138.176，P<0.001)。

图1 各组大鼠心肌梗死面积比较

2.2各组大鼠血清心肌酶活性的比较见表1。与Sham组比较，MI/R模型组大鼠血清 CK-MB、AST及 LDH活性均明显上升(P<0.001)。与 MI/R 模型组比较，芦丁各给药组不同程度地降低 MI/R大鼠血清 CK-MB、AST 及LDH活性。

表1 各组大鼠血清CK-MB、LDH、AST的测定结果(n=6) U/L

#：与Sham组比较，P<0.01；△：与MI/R组比较，P<0.01。

2.3各组大鼠左心室功能的比较见图2、表2。与Sham组比较，MI/R模型组大鼠左心室室壁运动明显减弱， EF及FS明显降低，差异有统计学意义(P<0.001)。与MI/R模型组比较，芦丁给药组左心室室壁运动相对增强，EF及FS显著改善。

A：Sham组；B：MI/R组；C：RH组；D：RM组；E：RL组。 图2 各组大鼠心脏超声心动图M超改变

#：与Sham组相比较，P<0.01；△：与MI/R组比较，P<0.05。

2.4各组大鼠血清SOD活性、MDA、GSH含量的比较见表3。与Sham组比较，MI/R组大鼠血清SOD活性降低，血清MDA含量增加，GSH含量下降(P<0.01)。与MI/R模型组比较，芦丁给药组能降低血清MDA含量，增加血清GSH含量(P<0.05)。

2.5各组大鼠心肌组织的病理改变在显微镜下观察各组心肌组织病理切片， Sham组大鼠心肌细胞形态学无改变，结构清晰，肌纤维排列整齐，细胞核长椭圆形，呈清蓝色，心肌间质无炎细胞浸润(图3A)。MI/R组心肌间质血管扩张充血，纤维肿胀，心肌细胞空泡变性，大量炎细胞浸润，呈纤维化改变，肌纤维排列明显紊乱，局部横纹不清或消失，肌纤维间隙增宽，可见大量心肌细胞溶解、坏死(图3B)。与MI/R模型组比较， RH组的心肌细胞坏死明显减少，心肌纤维可见轻度水肿，细胞核排列局部出现紊乱，心肌间质水肿，散在肌纤维肌浆聚(图3C)；RM组组心肌间质灶状出血，局部中性粒细胞浸润，纤维肌浆凝聚深染(图3D)；RL组心肌间质充血水肿，少量出血，偶见心肌细胞空泡变性(图3E)。

表3 各组血清SOD活性、MDA、GSH含量的比较(n=6)

#：与Sham组比较，P<0.01；△：与MI/R组比较，P<0.05。

2.6各组大鼠心肌组织中HO-1的表达见图4。与Sham组比较，MI/R组HO-1表达量明显升高。与MI/R模型组比较，芦丁给药组(RH组、RM组)呈剂量依赖性诱导HO-1的表达。

A：Sham组；B：MI/R组；C：RH组；D：RM组；E：RL组。 图3 各组大鼠心脏组织病理切片(HE,×200)

图4 各组大鼠心脏组织HO-1的表达

3 讨论

目前认为MI/R损伤的发病机制是多方面的，氧自由基增加和钙超载是引起再灌注损伤的主要原因之一。心肌缺血时，由于心肌内源性氧自由基清除能力下降使氧自由基大量堆积，再灌注后分子氧重新进入心肌组织中，氧自由基水平急剧上升，导致细胞膜脂质过氧化，改变了膜脂的微环境和膜的通透性，心肌细胞膜逐渐渗透甚至破裂，进而导致血清心肌酶谱(CK-MB、LDH、AST)的升高[9-10]。SOD 是重要的内源性氧自由基清除剂，能降低脂质过氧化形成，从而保护细胞免受氧自由基的损伤，对机体的氧化与抗氧化平衡起着重要作用；MDA 是脂质过氧化反应的最终代谢产物，能够反映机体细胞膜受自由基攻击的严重程度[11]；GSH是一种含γ-酰胺键和巯基的小分子肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成，广泛分布于机体各器官内，它可通过巯基与体内自由基相结合而清除自由基，是体内重要的抗氧化物质。MI/R后由于氧自由基大量形成，细胞膜的结构和功能受到破坏，MDA含量升高；SOD与GSH活力/浓度下降，抗氧化能力减弱会加剧心肌细胞损害。HO是血红素降解的起始酶和限速酶，可保持体内血红素的平衡，HO-1是其诱导型。有研究[12-14]发现，MI/R后急剧增多的活性氧可诱导心肌细胞HO-1基因的表达，HO-1的表达又可上调细胞内过氧化氢酶和GSH水平而保护细胞免受氧化应激性损伤。

该研究证实，与Sham组相比，MI/R大鼠心功能降低，如EF和FS下降；MI/R大鼠血清中CK-MB、LDH、AST水平升高，血清中MDA含量的增加、SOD和GSH水平下降，表明再灌注后大量自由基产生引发脂质过氧化程度加重，产生大量MDA，同时使SOD及GSH消耗增多，减弱体内抗氧化防御系统；与MI/R组对比，芦丁给药组中血清MDA含量降低， GSH含量上调， LDH、CK-MB、AST活性降低，HO-1表达量明显升高，且HO-1的表达与芦丁剂量有关，表明芦丁能够呈剂量依赖性地减轻氧化应激反应，维持心肌细胞膜稳定性，对MI/R损伤起保护作用。

综上所述，芦丁能够提高HO-1的表达，上调血清中SOD和GSH，从而减轻MI/R引起的氧化应激损伤，发挥心脏保护作用。这为探索芦丁在抗缺血再灌注损伤的保护机制提供了实验依据。

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(2016-12-07收稿 责任编辑赵秋民)

Cardioprotective effect of rutin on myocardial ischemia-reperfusion injury in rats

ZHAOYican1),ZHANGLihua1),ZHAOWen2),WEIBo2),JIANGYouxu1)

1)DepartmentofCardiology,theSecondAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014 2)DepartmentofClinicalPharmacy,SchoolofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

rutin；oxidative stress；ischemia-reperfusion injury； heme oxygenase-1;rat

Aim: To investigate the cardioprotective effect of rutin on myocardial ischemia-reperfusion injury in rats.Methods: Male SD rats were randomly allocated into Sham operation group, myocardial ischemia-reperfusion group(MI/R group),rutin high dose group(RH group,80 mg/kg), rutin middle dose group(RM group,40 mg/kg), and rutin low dose group(RL group,20 mg/kg)(n=10). Left anterior descending coronary artery was ligated to establish the myocardial ischemia-reperfusion injury model. Echocardiography evaluation of cardiac function after myocardial ischemia-reperfusion injury was performed. The area of myocardial infarction was determined. The myocardial enzymes(CK-MB, LDH, and AST) production and oxidation indexes(SOD, GSH and MDA) activity in serum and tissue were determined with enzyme-labeled instrument. The cell morphology was observed by HE staining. The expression of heme oxygenase-1 enzyme(HO-1) was detected by Western blot. Results: Compared with the MI/R group, EF and FS in the rutin groups were significantly increased, the area of myocardial infaction and myocardial enzymes were significantly decreased, the production MDA was significantly decreased, the activity of SOD and the production of GSH significantly increased, and the expression of HO-1 in the rutin groups was markedly increased(P<0.05). Conclusion: Rutin could increase HO-1 expression, therefore promote the endogenous antioxidant system against the myocardial ischemia-reperfusion injury in rats.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.05.011

R541.4

#通信作者：张丽华，女，1964年3月生，硕士，主任医师，教授，研究方向：冠心病的基础与临床，E-mail：zlhxp@126.com；赵文，女，1968年2月生，博士，教授，研究方向：心血管生理、病理生理及药理学，E-mail：zhaowen100@139.com

*国家自然科学基金 81270270,81470524,81603114；教育部博士点博导专项基金 20134101110013；中国博士后科学基金 2016M592316