戊二醛-癸甲溴铵复合剂对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的杀菌作用研究

侯玉凤，周 宇,2，王爱玲，吴萌萌，张为民，周宏超，张彦明，郭抗抗*

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.延安市动物疫病预防控制中心，陕西延安716000)

戊二醛-癸甲溴铵复合剂对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的杀菌作用研究

侯玉凤1，周 宇1,2，王爱玲1，吴萌萌1，张为民1，周宏超1，张彦明1，郭抗抗1*

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.延安市动物疫病预防控制中心，陕西延安716000)

为评价戊二醛-癸甲溴铵复合剂在不同条件下对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的杀菌效果，通过悬液定量杀菌试验探究了戊二醛-癸甲溴铵复合剂在不同环境温度(4 ℃、25 ℃、37 ℃)、不同作用时间(1 min、5 min、10 min)以及存在有机干扰物(3%、25%的牛血清白蛋白)等条件下对猪源大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的杀菌作用。结果显示，在没有有机物干扰时，浓度为167 mg/L的戊二醛-癸甲溴铵复合剂在4 ℃、25 ℃、 37 ℃下均可在5 min内完全杀灭2种受试菌(107CFU)，说明环境温度对该复合剂的杀菌作用影响不明显。当有机物浓度为3%时，该复合剂在10 min内完全杀灭大肠埃希菌的最低浓度为250 mg/L，金黄色葡萄球菌为125 mg/L；有机物浓度为25%时，作用时间不低于10 min，完全杀灭大肠埃希菌的最低浓度为1000 mg/L，金黄色葡萄球菌为1250 mg/L。有机物含量高杀灭相同数量受试菌所需复合剂的量也需要加大、作用时间延长，说明有机干扰物对复合剂的杀菌作用影响较大。本研究结果提示，为达到较好的杀菌效果，养殖场在使用戊二醛-癸甲溴铵复合剂时的有效浓度应不低于1250 mg/L，作用时间10 min以上时杀菌效果更好。

戊二醛-癸甲溴铵；大肠埃希菌；金黄色葡萄球菌；消毒；杀菌率

Correspondingauthor:GUOKang-kang,E-mail:guokk2007@nwsuaf.edu.cn

Abstract: To evaluate the bactericidal effect of glutaraldehyde-deciquam onEscherichiacoliandStaphylococcusaureusin different environmental conditions, the suspension quantitative germicidal test was carried at different temperatures ( 4 ℃, 25 ℃, 37 ℃), disinfecting time (1 min, 5 min, 10 min) and organic interference (3%, 25% bovine serum albumin). The results showed that 167 mg/L of this disinfectant disinfect the target bacteria completely within 5 min at 4 ℃, 25 ℃and 37 ℃without bovine serum albumin, indicating the slight influence of environmental temperature on bactericidal effect. The concentration of this disinfectant disinfectEscherichiacoliandStaphylococcusaureuscompletely within 10 minutes were 250 mg/L and 125 mg/L with 3% bovine serum albumin, respectively. However, the concentration of this disinfectant disinfectEscherichiacoliandStaphylococcusaureuscompletely within 10 minutes were 1000 mg/L and 1250 mg/L with 25% bovine serum albumin, respectively. It showed that higher level concentration and longer disinfecting time were needed for glutaraldehyde-deciquam completely disinfect same amounts of tested bacteria in the environmental condition with higher level organic interference. The results in present study suggests that the concentration no less than 1250 mg/L and the disinfecting time no less than 10 minutes for this disinfectant used in swine farm which can be conducted to obtain better bactericidal effect.

Keywords: glutaraldehyde-deciquam;Escherichiacoli;Staphylococcusaureus; disinfectant; sterilizing rate

随着养猪业的快速发展，规模化、集约化程度越来越高，在带来良好养殖效益的同时，猪的疫病也不断发生，成为困扰养猪业的一个重大问题。当前危害养猪业的重要病原较多，可分为病毒性病原、细菌性病原、寄生虫性病原等，为了减少和杜绝传染性病原在猪群中的传播，做好生物安全措施至关重要。消毒是猪场生物安全体系的重要环节，做好平时的消毒工作，能够减少病原微生物的数量，减少动物的感染和发病[1-3]。目前，市场上的消毒剂种类繁多，作用效果也受到各种因素的影响而不尽相同。

戊二醛-癸甲溴铵复合剂是养殖场常用的一种消毒剂，前期对猪场常见病原菌的杀灭效果也受到多种因素影响。调查表明因大肠埃希菌引起的仔猪腹泻和因金黄色葡萄球菌引起猪的急性、亚急性、慢性乳房炎等疾病在采取消毒措施的规模化猪场仍比较常见[4-5]，部分原因是一些规模化养猪场技术人员对消毒剂的使用方法不当造成的。消毒剂的作用受到药物浓度、环境温度、作用时间、微生物的种类和数量、环境中有机干扰物的多少等诸多因素的影响。武守艳[6]、徐秀荣[7]等对戊二醛-癸甲溴铵复合剂对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的杀菌作用进行了研究，为其合理使用提供了试验依据。考虑到猪场由于长期使用消毒剂及使用药物，会造成一些耐药菌株的产生，降低药物的使用效果，本研究以从发病猪上分离的大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌为受试菌，评价戊二醛-癸甲溴铵复合剂在不同条件下对受试菌的作用效果，为猪场更好地使用该消毒剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 猪源大肠埃希菌(E.coli)、猪源金黄色葡萄球菌(S.aureus)分离株均由西北农林科技大学动医学院兽医公共卫生学实验室分离、鉴定、保存。该两个分离株均为从患病猪上分离得到，但未进行血清分型。

1.1.2 主要试剂 牛血清白蛋白、吐温-80、甘氨酸、普通营养琼脂均购自杭州天和微生物试剂有限公司；戊二醛、癸甲溴铵等试剂均为国产分析纯试剂。PBS(含KCl 0.2 g，NaCl 8.0 g，KH2PO40.1 g，Na2HPO4·12H2O 2.036 g，溶于1 L超纯水，调整pH至7.4， 121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。)。LB液体培养基(酵母提取物1.0 g，胰蛋白胨2.0 g，NaCl 2.0 g，溶于200 mL超纯水调整pH至7.4，121℃高压蒸汽灭菌20 min。4 ℃保存)。LB固体培养基(在LB液体培养基的基础上加3 g琼脂粉，其余操作同LB液体培养基)。

1.1.3 戊二醛-癸甲溴铵复合剂及其中和剂的配制

戊二醛-癸甲溴铵复合剂：取100 g的戊二醛和100 g的癸甲溴铵于1 L超纯水中，配制成浓度为100 g/L的溶液。中和剂：取3 mL的吐温-80、1 g甘氨酸溶于97 mL的PBS中，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。4 ℃备用。

1.2 方法

1.2.1 受试菌株的复苏 将大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌冻干粉接种于5 mL LB液体培养基，每个菌种接种3管，37 ℃培养18 h。用接种环挑取菌液在LB固体培养基上划线接种，37 ℃培养24～48 h。挑单个菌落于50 mL LB液体培养基中增菌，37 ℃震荡培养24 h，置4 ℃备用。

1.2.2 受试菌悬液的制备 按照《消毒技术规范》[8]和《食品安全国家标准 食品微生物学检验菌落总数测定》[9]中的有关规定，采用10倍稀释法，灭菌用PBS溶液将受试菌分别调整为1×107～5×108CFU/mL。

1.2.3 戊二醛-癸甲溴铵中和剂的中和作用试验 按照《消毒技术规范》[8]和韩杰等[10]方法，用3%的吐温-80+1%的甘氨酸的混合液为戊二醛-癸甲溴铵的中和剂，用受试的大肠埃希菌进行中和试验。将符合消毒剂试验要求的菌悬液与消毒剂按1︰9进行混合、作用。

中和剂试验分以下6组。第1组：消毒剂+菌悬液；第2组：(消毒剂+菌悬液)+中和剂；第3组：中和剂+菌悬液，用以验证中和剂是否抑菌；第4组：(消毒剂+中和剂)+菌液；第5组：稀释液+菌悬液，作为阳性对照；第6组：稀释液+中和剂，作为阴性对照。

1.2.4 悬液定量杀菌试验

1.2.4.1 无有机干扰物时戊二醛-癸甲溴铵复合剂的杀菌作用 在不同的消毒剂浓度、环境温度、作用时间条件下，对戊二醛-癸甲溴铵复合剂对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的杀菌效果进行研究。

用PBS溶液将戊二醛-癸甲溴铵复合剂(100 g/L)分别配制成500、250、167、125 mg/L的溶液。分别吸取配制好的复合剂溶液4.5 mL于灭菌试管中，再取受试菌液0.5 mL于另一无菌的试管中，置于37 ℃、25 ℃和4 ℃条件下平衡20 min；然后将平衡好温度的0.5 mL菌液加入到4.5 mL复合剂中，充分混匀；在平衡好的温度条件下分别作用1 min、5 min后，取0.5 mL反应液于一新的无菌试管中，加入4.5 mL中和剂溶液，混匀后作用10 min，取100 μL接种于LB固体培养基上，涂布均匀后置37 ℃培养24 h，进行菌落计数(每个反应管做2个板)，计算不同条件下的杀菌率。以灭菌PBS溶液取代消毒液，其他条件不变作为阳性对照；以灭菌PBS溶液取代消毒剂和菌液，其他条件不变作为阴性对照。每个条件下的实验重复三次。

1.2.4.2 存在有机干扰物时戊二醛-癸甲溴铵对受试菌的杀灭作用 在制备好的受试菌菌悬液中加入牛血清白蛋白，使终浓度分别为3%和25%。选择戊二醛-癸甲溴铵复合剂在无蛋白干扰下的最低有效杀菌剂量，在25 ℃下进行悬液定量杀菌试验，作用时间分别为1 min、5 min和10 min；如果消毒剂的最低有效杀菌剂量不能进行有效的杀灭时，在此基础上提高复合剂的浓度，再进行悬液定量杀菌试验。通过菌落计数，评价杀菌效果。

2 结 果

2.1 戊二醛-癸甲溴铵复合剂的中和剂作用结果

分别用灭菌PBS溶液将受试菌浓度调整到107CFU/mL，满足试验的需要。根据《消毒技术规范》中和剂鉴定合格判断标准。从表1可以看出，在戊二醛-癸甲溴铵浓度为500 mg/L时，第1、2组无菌落生长；第 3、4、5组之间的菌落误差率≤15%；第6组无菌落生长。实验结果说明，3%吐温-80+1%的甘氨酸可以作为戊二醛-癸甲溴铵复合剂的中和剂。中和剂、中和剂与消毒剂的反应产物对大肠埃希菌生长均无影响，满足试验要求。

表1 戊二醛-癸甲溴铵复合剂中和剂的作用结果Tab 1 The result of neutralizer for glutaraldehyde-deciquam

表中结果为三次试验的平均值；25 ℃，作用5 min

The average of the results for three times trial；at 25 ℃ for 5 min

2.2 无有机干扰物时戊二醛-癸甲溴铵复合剂的杀菌作用 表2结果显示，在没有有机物干扰时，戊二醛-癸甲溴铵复合剂浓度≥167 mg/L时，在4 ℃、25 ℃、37 ℃下分别作用5 min，对两种受试菌的杀菌率均可达到100%。在试验温度下可见温度对戊二醛-癸甲溴铵的杀菌作用影响不大。

表2 无有机干扰物时戊二醛-癸甲溴铵复合剂对受试菌的杀灭结果Tab 2 Bactericidal effect of glutaraldehyde-deciquam on tested bacteria at different temperature without organic interference

2.3 存在有机干扰物时戊二醛-癸甲溴铵复合剂对受试菌的杀菌作用 本试验在25 ℃条件下进行。当有机物浓度为3%时，戊二醛-癸甲溴铵复合剂在不少于10 min的作用时间下，100%杀灭两种受试菌的最低有效浓度为250 mg/L。当有机物浓度为25%时，戊二醛-癸甲溴铵复合剂在不少于10 min的作用时间下，100%杀灭大肠埃希菌的最低有效浓度为1000 mg/L，100%杀灭金黄色葡萄球菌的最低有效浓度为1250 mg/L。结果见表3，提示有机干扰物对消毒剂杀菌作用有较大的影响，在猪场环境卫生状况不好时会对消毒剂的杀菌作用有较大的影响。

表3 存在有机干扰物时戊二醛-癸甲溴铵对受试菌的杀灭作用结果Tab 3 Bactericidal effect of glutaraldehy-deciquam on tested bacteria in different temperature with organic interference

3 讨 论

戊二醛是一种速效、广谱的化学杀菌剂，对多种微生物表现出杀灭活性，对繁殖型的细菌、病毒、分枝杆菌、致病性霉菌和细菌芽孢等均有杀灭作用，且对人毒性较低。癸甲溴铵不仅能与阳离子、非离子、两性离子表面活性剂配伍，与乙醇、异丙醇等溶剂复配成复合制剂，耐温、耐光，而且能杀灭细菌繁殖体、真菌、病毒，属高效消毒剂[11]。癸甲溴铵消毒剂对细菌、真菌、亲脂性病毒有效，但对芽孢作用有限，而戊二醛消毒剂对芽孢杀灭作用显著，二者的结合不仅可以弥补单一消毒剂使用的缺陷，还可以增强杀菌效果和消毒剂稳定性。季铵盐与细菌细胞壁膜上的多磷脂反应，也能使细菌细胞壁上的肽变性，随后戊二醛破坏细菌表面的蛋白受体。戊二醛-癸甲溴铵复合消毒剂在生产中主要应用于猪舍环境、消毒池消毒。本研究发现戊二醛-癸甲溴铵复合消毒剂在相同的浓度和相同的作用时间对金黄色葡萄球菌的杀菌率高于大肠埃希菌，但具体杀菌机制有待深入研究。

影响消毒剂杀菌效果的主要因素是消毒剂的浓度、作用时间、温度、微生物的种类和数量以及畜舍有机物的干扰。研究发现，温度每升高10 ℃消毒剂的杀灭率提高2～3倍，当猪舍内温度≤16 ℃时，消毒剂对病原微生的杀灭率将会降低；同时，畜舍的粪便的清理程度将会影响消毒剂的杀菌效果[12-13]。戊二醛-癸甲溴铵复合消毒剂比单体溶液杀菌作用更显著[7]。合理、有效地使用消毒剂，控制消毒剂污染，对动物疫病防控、环境保护、养殖业健康发展都有着现实重要意义。本研究以猪场常见的病原菌大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌为受试菌，研究了戊二醛-癸甲溴铵复合剂在不同的浓度、温度及不同含量有机物干扰下对受试菌的杀灭作用。结果发现，环境温度对该消毒剂的杀菌作用影响不大，消毒剂浓度、作用时间及有机物的干扰等因素对其杀菌作用有较大的影响。所以，在猪场使用消毒剂时，为保证有更好的杀灭效果，建议养殖场定期打扫畜舍环境卫生，尽量减少有机物对消毒剂杀菌作用的干扰。在使用戊二醛-癸甲溴铵复合剂消毒时，有效浓度不低于1250 mg/L，作用时间在10 min以上；猪舍粪便、饲料等有机物含量较高时可适当加大消毒剂浓度和延长作用时间。本研究为戊二醛-癸甲溴铵复合剂在猪场的使用提供了参考。

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(编辑：李文平)

BactericidalEffectofGlutaraldehyde-DeciquamonEscherichiacoliandStaphylococcusaureus

HOU Yu-feng1, ZHOU Yu1,2, WANG Ai-ling1, WU Meng-meng1, ZHANG Wei-min1, ZHOU Hong-chao1, ZHANG Yan-ming1, GUO Kang-kang1*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi, 712100,China; 2.Yan’anCenterforAnimalDiseaseControlandPrevention,Yan’anShaanxi, 716000,China)

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.9.03

2017-02-15

A

1002-1280 (2017) 09-0012-06

S859.79

陕西省重点农业科技示范推广项目(ZDKJ-2014-33)

侯玉凤，硕士研究生，从事猪重要疫病防控技术研究；周 宇，硕士研究生，兽医师，从事动物疫病防控技术研究，为共同第一作者。

郭抗抗。E-mail: guokk2007@nwsuaf.edu.cn