体外培养大鼠星形胶质细胞水通道蛋白4的表达①

徐立新，董丽萍，师忠芳，闫旭，杨少华，袁芳

体外培养大鼠星形胶质细胞水通道蛋白4的表达①

徐立新1,2，董丽萍1,2，师忠芳1,2，闫旭1,2，杨少华3，袁芳1,2

目的 研究水通道蛋白4(AQP4)在体外培养大鼠星形胶质细胞中的表达规律。方法 取新生1 d Wistar大鼠大脑皮层行星形胶质细胞原代培养，分别于原代培养3 d、5 d、7 d、9 d及传代培养9 d行胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫荧光染色；实时荧光定量聚合酶链反应及AQP4免疫荧光染色检测AQP4 mRNA及蛋白的表达。结果 原代及传代培养不同时间点95%以上细胞GFAP免疫荧光染色阳性，且GFAP表达量逐渐增加。原代培养3 d有AQP4 mRNA表达，3 d和5 d AQP4 mRNA表达水平无显著性差异(P＞0.05)，7 d AQP4 mRNA表达升高(P＜0.05)，9 d持续升高(P＜0.05)；传代培养9 d与原代培养9 d AQP4 mRNA表达无显著性差异(P＞0.05)。AQP4蛋白表达与AQP4 mRNA表达一致。结论 大鼠星形胶质细胞原代培养3 d即有AQP4表达，之后逐渐增加，9 d左右表达渐趋稳定。

水通道蛋白4；星形胶质细胞；细胞培养；大鼠

水通道蛋白(aquaporins,AQPs)是近年来发现的位于细胞膜上与水的通透性相关的转运蛋白，其中AQP4是脑内最重要的AQPs，在脑组织中分布最广，含量最多，主要参与钾离子缓冲、体液自身调节、中枢渗透压调节等[1-2]，特别与癫痫、脑缺血、脑外伤、脑肿瘤等所致的脑水肿密切相关[3-4]。研究发现，AQP4高表达于星形胶质细胞和室管膜细胞，尤其是与毛细血管和软脑膜接触的星形胶质细胞膜处[5]。Yamamoto等[6]利用体外培养神经细胞研究发现，AQP4只在星形胶质细胞表达。本研究观察体外培养条件下大鼠星形胶质细胞AQP4表达的时程规律，为进一步研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验试剂与仪器

最低必需培养基(minimum essential medium,MEM)、 胎 牛 血 清 (fetal bovine serum,FBS)： GIBCO公司。兔抗大鼠胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)多克隆抗体：DAKO公司。AQP4多克隆抗体：ABCAM公司。Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG二抗：MOLECULAR PROBES公司。TRIzol试剂：LIFE TECHNOLOGIES公司。逆转录试剂盒：PROMEGA公司。SYBR GreenⅠ核酸染料试剂盒、实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)仪(LightCycler480)：ROCHE公司。倒置相差显微镜(Axio ObserverA1)：ZEISS公司。

1.2 实验动物

新生1 d Wistar大鼠，由中国医学科学院实验动物研究所提供，合格证号SCSK(京)2005-0013。实验过程按实验动物使用3R原则给予人道关怀，并通过北京市神经外科研究所动物福利伦理审查(No.201401007)。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养

参考McCarthy的方法[7]并加以改良[8]行大鼠星形胶质细胞原代培养。无菌条件下，取新生1 d Wistar大鼠大脑皮层组织，用含10%胎牛血清的MEM分散成单细胞悬液后，接种于底面积75 cm2培养瓶中，5%CO2培养箱内37℃培养。每2～3天观察、半量换液1次。原代培养9 d的星形胶质细胞行传代培养，GFAP免疫荧光染色鉴定培养细胞纯度。

1.3.2 GFAP及AQP4免疫荧光染色

根据我们前期研究的方法进行实验[9]。培养细胞丙酮固定30 min，正常羊血清封闭15 min，加入兔抗大鼠GFAP抗体(1∶50)或兔抗大鼠AQP4抗体(1∶100)，阴性对照用PBS代替一抗，4℃过夜。Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG(1∶100)避光孵育3 h。含DAPI的荧光封片剂封片，倒置荧光显微镜下观察并采集图像。

根据我们前期研究的方法[10]，应用Image J图像分析软件对GFAP及AQP4免疫荧光结果进行图像分析。一个时间点取3张玻片，高倍镜下(200×)随机选取3个视野，将图片黑白反向处理，计算9个视野中平均光密度值(average optical density,AOD)。

1.3.3 逆转录qRT-PCR

方法进行实验[11]。分别于原代培养3 d、5 d、7 d、9 d及传代培养9 d使用TRIzol试剂提取培养细胞总RNA，应用逆转录试剂盒合成cDNA，用SYBY Green方法行PCR。根据GenBank大鼠AQP4(NM012825.4)序列、β-actin(NM031144.3)序列进行引物设计：

AQP4上游5'-TGA ATC CAG CTC GAT CCT TTG-3'，下游5'-TAT CCA GTG GTT TTC CCA GTT TC-3'；

β-actin上游 5'-CGT TGA CAT CCG TAA AGA CC-3'，下游5'-CTA GGA GCC AGA GCA GTA ATC-3'。

由深圳华大基因科技服务有限公司合成。

PCR反应体系包括AQP4或β-actin上游引物和下游引物各 1 μl，SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，模板cDNA 1 μl，DEPC水7 μl。PCR反应条件：95 ℃预热10 min，95℃变性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环。

用LightCycler480 Software 1.5软件进行分析，用AQP4/β-actin表示AQP4 mRNA表达水平。每个时间点取3个样品，重复3次。

1.4 统计学分析

采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析。各组数据以(xˉ±s)表示，进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，两两比较采用SNK-q检验。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 培养细胞鉴定

培养不同时间细胞均呈大致均一的单层扁平细胞，具有短而粗大的细胞突起，并且随培养时间延长，细胞密度逐渐增加(图1)。培养细胞95%以上为GFAP染色阳性(图2)。随培养时间延长，GFAP表达增加。见表1。

2.2 AQP4 mRNA

原代培养3 d可检测到AQP4 mRNA表达；3 d、5 d AQP4 mRNA表达无显著性改变(P＞0.05)；7 d AQP4 mRNA表达升高(P＜0.05)，9 d持续升高(P＜0.05)；传代培养9 d与原代培养9 d AQP4 mRNA表达无显著性差异(P＞0.05)。见表1。AQP4免疫荧光定量结果与AQP4 mRNA表达变化一致。见图3、表1。

图1 培养大鼠细胞形态(倒置相差显微镜PlasDIC模式,bar=200 μm)

图2 培养大鼠细胞GFAP表达(免疫荧光染色,bar=200 μm)

图3 培养大鼠细胞AQP4表达(免疫荧光染色,bar=200 μm)

表1 培养大鼠细胞各时间点GFAP、AQP4 mRNA和AQP4表达

3 讨论

脑水肿是各种脑疾病常见并发症，其发生与多种因素有关[12]，实质是脑内水平衡紊乱。研究显示，脑水肿主要是星形胶质细胞肿胀[13]。

星形胶质细胞是中枢神经系统内数量最多的一类细胞，在神经元的损伤修复、信号传递、突触形成等方面具有重要作用[14-15]。近年来对星形胶质细胞在各种脑疾病中作用的研究越来越多，尤其是脑损伤后星形胶质细胞在脑水肿中所发挥的作用受到研究者关注。

AQP4是脑内最重要的AQPs，主要表达于星形胶质细胞质膜，在各种脑疾病所致脑水肿中起重要作用[16]，其表达受诸多因素调节[17-18]。大量实验表明，AQP4的功能是双向的，既可能是脑水肿发生的促进因素，也可能是脑水肿消散的促进因素[19]。如何通过干预脑内AQP4表达治疗脑水肿，已成为开发脑水肿治疗新方法的关键[20]。

在体实验研究不能排除损伤过程中各种复杂因素的影响，也不能区分细胞的原发损伤和继发损伤，使观察单因素对细胞的影响受到限制。利用星形胶质细胞体外培养进行AQP4表达研究越来越受到重视。但由于目前为止尚没有关于星形胶质细胞体外培养下AQP4表达规律的报道，使用培养多久的星形胶质细胞进行相关研究成为困扰研究者的难题。

鉴于原代培养3 d星形胶质细胞才开始贴壁生长，故本实验从细胞培养3 d开始观察，通过GFAP免疫荧光染色鉴定培养细胞纯度。GFAP是构成中间纤维的主要成分，在成熟星形胶质细胞中表达，被公认为星形胶质细胞的特征性标志物[21]。GFAP也可作为观察星形胶质细胞增生的指标[22-23]。本研究中，我们观察到原代及传代培养不同时间点，95%以上培养细胞GFAP免疫荧光染色阳性，且表达量随培养时间延长逐渐增加，但原代培养9 d和传代培养9 d无显著性差异，提示这时星形胶质细胞增殖处于相对稳定状态。

倒置相差显微镜观察，原代培养3 d、5 d时，培养瓶中星形胶质细胞数量少，7 d时细胞数量增多，原代培养9 d与传代培养9 d后，培养瓶中星形胶质细胞汇合程度均达90%以上。

AQP4免疫荧光和qRT-PCR显示，原代培养3 d星形胶质细胞就有微弱AQP4表达，随着培养时间延长，AQP4表达显著增高；传代培养9 d与原代培养9 d AQP4表达无显著性差异，表明星形胶质细胞中AQP4表达水平处于相对稳定状态。

Wen等[24]利用Westen blotting对大鼠出生后脑内AQP4表达进行研究，发现AQP4表达由生后7 d时的2%增加到生后14 d的25%。Li等[25]研究发现，小鼠脑内AQP4在生后1周表达量是成年小鼠脑内总表达量的21.3%，生后2周可以达到成年脑的67.4%。与我们观察到的现象相似。研究AQP4在星形胶质细胞的表达，选择适宜的培养时间非常重要。

总之，本研究发现，大鼠星形胶质细胞原代培养3 d就有AQP4表达，之后逐渐增加，9 d达稳定状态，适宜进行AQP4在星形胶质细胞生理及病理条件下的相关研究。

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Expression ofAquaporin 4 inAstrocytes of Rats in Vitro

XU Li-xin1,2,DONG Li-ping1,2,SHI Zhong-fang1,2,YAN Xu1,2,YANG Shao-hua3,YUAN Fang1,2
1.Department of Pathophysiology,Beijing Neurosurgical Institute,Beijing 100050,China;2.Beijing Tiantan Hospital,Capital Medical University,Beijing 100050,China;3.Department of Pharmacology and Neuroscience,University of North Texas Health Science Center,Fort Worth,Texas 76107,USA

DONG Li-ping.E-mail:d08270827@163.com

Objective To explore the expression of aquaporin 4(AQP4)in primary and secondary cultured rat astrocytes.Methods Rat cortical astrocytes from a newborn(one day)Wistar rat were cultured.Astrocytes were identified with immunofluorescence staining of glial fibrilillary acidic protein(GFAP).The expression of AQP4 was determined with real-time quantitative polymerase chain reaction and immunofluorescence staining three,five,seven and nine days of primary culture,and nine days of secondary culture.Results The purity of GFAP-positive cells was more than 95%.The expression of AQP4 mRNA was found three days of primary culture,remained unchanged five days of primary culture(P＞0.05),and increased seven and nine days of primary culture(P＜0.05).The expression of AQP4 mRNA was not different between nine days of primary culture and nine days of secondary culture(P＞0.05).AQP4 immunofluorescence staining showed the same trend of AQP4 mRNA.Conclusion AQP4 may express since three days of primary culture in rat astrocytes in vitro,and increase slowly until nine days of primary culture.

aquaporin 4;astrocyte;cell culture;rats

R338.2

A

1006-9771(2017)09-1051-05

2017-05-17

2017-06-22)

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.09.012

[本文著录格式] 徐立新，董丽萍，师忠芳，等.体外培养大鼠星形胶质细胞水通道蛋白4的表达[J].中国康复理论与实践,2017,23(9):1051-1055.

CITED AS:Xu LX,Dong LP,Shi ZF,et al.Expression of aquaporin 4 in astrocytes of rats in vitro[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(9):1051-1055.

1.国家自然科学基金项目(No.81271286)；2.北京市自然科学基金项目(No.7152027)。

1.北京市神经外科研究所病理生理室，北京市100050；2.首都医科大学附属北京天坛医院，北京市100050；3.北德克萨斯大学医学中心神经与药理系，美国德克萨斯州沃思堡76107。作者简介：徐立新(1966-)，女，汉族，北京市人，主管技师，主要研究方向：神经系统相关疾病基础研究。通讯作者：董丽萍，女，研究员。E-mail:d08270827@163.com。