产反式—4—羟脯氨酸重组大肠杆菌的构建及优化

刘笑尘++高爽+许伟+戴良英

摘要：反式-4-羟脯氨酸为手性亚氨基酸，是一种被广泛应用于医疗、美容、化工、畜牧领域的生产原料。通过以下工作构建了1株能够高效表达反式-4-脯氨酸羟化酶基因的重组大肠杆菌：（1）使用JCAT软件优化反式-4-脯氨酸羟化酶的编码区基因序列，改变141个碱基（替换了138个同义密码子），使其CAI指数由0.396 5优化至 0.927 7，C/G由73.626 3%优化至59.706 9%，优化mRNA延伸效率；（2）优化非编码区序列，选择色氨酸启动子并进行简化，使RBS区包含SD序列，在RBS区前添加g10-L翻译增强子，使用RNAstructure软件优化起始区序列的二级结构，增强mRNA的起始效率；（3）构建重组大肠杆菌DH5α/pUC-19-pH，优化宿主及质粒载体，最终得到的重组菌DH5α/pUC-19-pH比酶活达到0.010 8 U/mg。

关键词：反式-4-羟脯氨酸；重组大肠杆菌；起始效率；延伸效率；优化

中图分类号： S182文献标志码： A[HK]

文章编号：1002-1302（2017）13-0019-05[HS）][HT9.SS]

[HJ1.4mm]

收稿日期：2016-03-19

基金项目：湖南省现代柑橘产业技术体系专项（编号：2015137）。

作者简介：刘笑尘（1990—），男，湖南武冈人，硕士研究生，主要从事微生物发酵和植物与微生物分子互作研究。E-mail：373709368@qq.com。

通信作者：许伟，博士，主要从事微生物发酵研究，E-mail：49385395@qq.com；戴良英，博士，教授，主要从事植物与微生物分子互作研究，E-mail：daily@hunau.net。[HJ]

[ZK）]

羟基脯氨酸（Hyp）是一种手性亚氨基酸，被广泛应用于医疗保健、美容、化工、畜牧等领域[1]。最初人们通过水解哺乳动物的胶原蛋白[2]来获取反式-4-羟脯氨酸，但此法有许多弊端[3]。

1999年，研究人员筛选得到指孢囊菌RH1，从该菌中提取到能高效表达的反式-4-脯氨酸羟化酶，并获得反式-4-脯氨酸羟化酶基因序列，之后该研究团队又将获得的基因序列和脯氨酸代谢过程中的关键酶基因成功导入大肠杆菌质粒中获得重组工程菌，在以葡萄糖为碳源的发酵体系中，发酵4 d后可得25 g/L的反式-4-羟脯氨酸，大大提高了反式-4-羟脯氨酸的发酵效率[4-6]。日本协和发酵生物技术公司也确立了反式-4-羟脯氨酸的高效微生物发酵生产法[7]。

但该技术在国内仍有待优化。本研究为构建1株能够高效表达反式-4-脯氨酸羟化酶基因的重組大肠杆菌，尝试优化反式-4-脯氨酸羟化酶的编码区基因序列，并通过添加g10-L翻译增强子、SD序列、优化mRNA起始区二级结构、简化色氨酸启动子等方式进行试验，最后对质粒载体和宿主菌的选择进行优化，以获得发酵过程中比酶活最高的重组菌。

1材料与方法

1.1菌株和质粒

本研究所采用的菌株和质粒见表1。

1.2反式-4-脯氨酸羟化酶比酶活的测定

将标准反式-4-羟脯氨酸溶液稀释25倍得浓度为 4 mg/L 的标准溶液，测定其D560 nm，对重组大肠杆菌的发酵液进行预处理后，测定发酵液的D560 nm、D600 nm，绘制反式-4-羟脯氨酸标准曲线，根据公式（1）计算重组菌细胞干质量。

[JZ（]DWC=0.54×D600 nm。[JZ）][JY]（1）

DCW单位为g/L。

发酵液12 000 r/min离心2 min，弃上清，回收菌体，将 500 μL 的酶反应缓冲液（MES 240 mmol/L，pH值6.5，脯氨酸20 mmol/L，2-酮戊二酸40 mmol/L，硫酸亚铁4 mmol/L，维生素C 8 mmol/L）加入到菌体中，将细胞重新悬浮，于 35 ℃ 摇床220 r/min培养15 min，转移到100 ℃水浴中加热2 min，采用氯胺T法测定反式-4-羟脯氨酸的浓度。

1个酶活性单位为1 min将1 nmol脯氨酸完全转化为反式-4-羟脯氨酸的酶量，单位为U；比酶活是1 mg干菌体的酶活性，单位为U/mg，推出计算公式（2）。

[JZ（]比酶活=0.094×D560 nm/D600 nm。[JZ）][JY]（2）

式中：D560 nm为反应体系在560 nm波长处的吸光度。

1.3反式-4-脯氨酸羟化酶基因优化

来源于指囊孢菌RH1[5]的反式-脯氨酸-4-羟化酶基因序列共819 bp，编码272个氨基酸，RH1与优化模板E.coli K12对比，最适密码子所占比例差异较大，根据密码子优化策略，使用JCAT软件优化密码子，排除出现终止子、限制性内切酶酶切位点和RBS序列的可能，将RH1序列中稀有密码子替换为最适密码子。根据N-端规则[8]，将亮氨酸（Leu）突变为缬氨酸（Val），避免序列对应编码的第2个氨基酸残基为Leu，增长蛋白质半衰期。

1.4非编码区优化

1.4.1g10-L翻译增强序列

来源于T7噬菌体的g10-L翻译增强序列由9个碱基组成（UUAACUUUA），其对外源基因的表达量有显著的增强作用，可达40～340倍[9]，已知pET28a的一段RBS区如图1所示，其内部已包含了g10-L翻译增强序列。

[CM（26]1.4.2SD序列SD序列通常由4～5个核苷酸组成，在原[CM）]

[FK（W3][TPLXC11.tif][FK）]

核生物核糖体与mRNA结合的时候，SD序列能帮助mRNA从起始处开始翻译[10-11]，有研究表明，在测试中将SD序列与E.coli K12的基因组用SPSS软件做CAI值和离散增量相关分析，以AAGGA为核心的SD序列为强SD序列[12]。图2中下划线为SD序列，阴影区域为SD序列的强核心，在SD序列前端的9个核苷酸则是T7 g10-L翻译增强序列。有报道称，将T7 g10-L序列置于表达质粒的SD序列上游能有力地提高下游基因编码蛋白的表达水平[13]。endprint

[FK（W3][TPLXC22.tif][FK）]

1.4.3mRNA翻译起始区二级结构优化

mRNA翻译起始区（translation initiation region，TIR）由起始密码子AUG前后数十个碱基组成，TIR中任何1个碱基的改变都有可能对其二级结构产生巨大影响，从而改变mRNA翻译过程中的起始效率[14-15]。TIR中序列若能形成稳定且较长的二级结构就会阻碍核糖体与mRNA的结合效率，对翻译的起始效率造成不利影响[16]，而自由能（ΔG）的高低则作为mRNA翻译起始效率的评估指标对TIR的优化进行指导[17]。

1.4.4启动子优化

为得到高产量的反式-4-羟基脯氨酸，须要获得既有较高比酶活的反式-4-脯氨酸羟化酶，还要有能通过简便有效的方法控制发酵的启动子，而色氨酸启动子能够很好地满足以上所述的调控需要[18]，本研究所用到的色氨酸启动子由刘合栋的启动子序列[19]精简优化而来。

1.4.5反式-4-脯氨酸羟化酶基因表达盒构建

综合 “1.3”节、“1.4”节中所述，在反式-4-脯氨酸羟化酶编码基因序列的3′端添加来自PET载体的TrpLABCDE转录终止序列TAATCCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAACTTTCTTT，以保护序列的稳定性。完整的表达盒交由上海生工生物工程有限公司合成，为了方便后续试验，本研究在表达盒的5′端加入限制性内切酶SalⅠ识别序列GTCGAC，在3′端加入限制性內切酶NdeⅠ的酶切位点CATATG。

1.5重组菌DH5α/pUC19-pH的构建

合成后的反式-4-脯氨酸羟化酶表达盒基因经SalⅠ和NdeⅠ双酶切后，链接到pUC19-T质粒上，重组质粒的构建图谱如图3所示。

将构建好的重组质粒pUC-19-pH转化入感受态大肠杆菌DH5α中，得重组大肠杆菌DH5α/pUC-19-pH，将DH5α/pUC-19-pH于带有氨苄青霉素抗性的LB培养基平板上涂板培养，挑取单菌落扩大培养，提取重组质粒pUC-19-pH，重组质粒经SalⅠ和NdeⅠ双酶切后，测序验证2段序列的正确性。

1.6宿主菌优化

将验证后的pUC19-pH质粒转化至JM109、C43、BL21、XL-1感受态细胞中， 得重组大肠杆菌JM109/pUC19-pH、C43/pUC19-pH、BL21/pUC19-pH、XL-1/pUC19-pH。

将5株重组大肠杆菌涂布于带有氨苄青霉素抗性的LB培养基平板上， 37 ℃培养12 h， 挑取阳性重组子。将4株阳

[FK（W13][TPLXC33.tif][FK）]

性重组子在盛有液体LB培养基的摇瓶（盛有30 mL培养基的 100 mL 三角瓶）中，37 ℃、220 r/min发酵12 h后，对发酵液进行蛋白电泳检测，同时测定干菌比酶活，对比数据结果。

1.7质粒载体优化

将优化后合成并通过验证的表达盒连接到pCDFDuet-1、pACYCDuet-1、pETDuet-1、pRSFDuet-1、pCOLAduet-1载体上，并转化到大肠杆菌DH5α中，得重组菌DH5α/pCDFDuet-1-pH、DH5α/pACYCDuet-1-pH、DH5α/pETDuet-1-pH、DH5α/pRSFDuet-1-pH、DH5α/pCOLAduet-1-pH。

将重组菌涂布于对应的LB抗性培养基平板上，挑取阳性转化子，酶切测序验证无误后，于盛有液体LB培养基的摇瓶（盛有30 mL培养基的100 mL三角瓶）中，37 ℃、220 r/min发酵12 h，对发酵液进行蛋白电泳检测，测定干菌比酶活（试验设置3次重复），对比数据结果。

2结果与分析

[HTK]2.1反式-4-脯氨酸羟化酶基因[HT]

查阅数据库（http：//www.ebi.ac.uk/ena/data/view/BAA20094）获得指孢囊菌RH1的反式-4-脯氨酸羟化酶基因序列，根据“1.3”节方法优化后得到的序列与原序列对比结果如图4所示。通过JCAT软件优化后的序列与模型E. coli（strain K12）对比可知，优化前的CAI指数为0.396 5，优化后为0.927 7已经非常接近理论最佳值1，而优化前的C/G为73.626 3%，优化后为59.706 9%，同样非常接近JCAT软件计算的E coli.（strain K12）的理论最佳值50.734 0%，共计改变了141个碱基，替换了138个同义密码子。

2.2翻译起始区的设计及优化

由图5可见，上方为设计初的翻译起始区序列，斜体加粗部分的AG为DNA转录起始点，下划线部分为g10-L翻译增强子序列，其后为RBS序列，其中深色阴影加粗部分为包含了以AAGGA为核心的强SD序列，浅色阴影部分为反式-4-脯氨酸羟化酶编码基因的前21个密码子。下方为经过RNAstructure软件优化自由能后所得的序列，其中根据N端规则将第2个氨基酸由Leu突变为了Val，本次优化一共改变了4个核苷酸，替换了3个同义密码子，最终将起始区的自由能ΔG由-12.8升高到了-7.6。

2.3启动子优化和表达盒

由起始区序列和编码区序列经构建出完整的表达盒如图6所示。

2.4重组菌构建和宿主菌优化

根据“1.5”节的方法构建重组菌DH5α/pUC-19-pH，提[CM（25][KG*8]取重组质粒并进行双酶切（图7），得到2.8[KG*3]kb和977[KG*3]bp[KG*3][CM）][FL）]

[FK（W5][TPLXC55.tif][FK）]endprint

[FK（W12][TPLXC66.tif][FK）]

[FL（2K2]

[FK（W13][TPLXC77.tif][FK）]

2段条带，经上海生工生物工程有限公司测序证实完全正确。

运用“1.6”节的方法构建重组菌DH5α/pUC19-pH、JM109/pUC19-pH、C43/pUC19-pH、BL21/pUC19-pH、XL-1/pUC19-pH，并于LB液体培养基中摇瓶发酵培养 12 h，蛋白电泳及比酶活结果如图8和表2所示。

如图8所示，31.0 ku附近为反式-4-脯氨酸羟化酶条带，可知在同等发酵条件下，以BL21、DH5α为宿主菌所分泌的反式-4-脯氨酸羟化酶蛋白含量较高。由表2分析可知，DH5α/pUC19-pH菌发酵液中比酶活最高，达到 0.009 7 U/mg。

2.5质粒载体优化

根据“1.7”节的方法构建得到重组菌DH5α/pCDFDuet-1-pH、DH5α/pACYCDuet-1-pH、DH5α/pETDuet-1-pH、DH5α/pRSFDuet-1-pH、DH5α/pCOLAduet-1-pH，并分别抽提得到重组质粒pCDFDuet-1-pH、pACYCDuet-1-pH、pETDuet-1-pH、pRSFDuet-1-pH、pCOLAduet-1-pH，经双酶切后分别得到3.7 kb和977 bp、4.0 kb和977 bp、5.4 kb和977 bp、3.8 kb和977 bp、3.7 kb和977 bp一大一小2條条带，电泳结果如图9所示。经上海生工生物工程有限公司测序验证均完全正确，将重组菌于盛有LB液体培养基的摇瓶中发酵培养12 h后，蛋白电泳及比酶活结果见图10和表3。

由图10可知，DH5α/pRSFDuet-1和DH5α/pUC19-pH在31.0 ku附近的蛋白电泳条带最为清晰明显，初步判断pRSFDuet-1和pUC19-pH 2个为最佳质粒载体。

[FK（W12][TPLXC110.tif；S+2mm][FK）]

从表3中结果来看，3次重复试验的平均值显示DH5α/pUC19-pH的比酶活为0.010 8 U/mg，是6个重组大肠杆菌比酶活中的最高值，结合蛋白电泳结果，笔者认为pUC19-pH即为效果最好的重组质粒。

3讨论与结论

本研究通过密码子优化、添加g10-L翻译增强序列、在RBS 区内设计SD序列、优化翻译起始区的二级结构来优化反式-4-脯氨酸羟化酶的起始效率及延伸效率，成功构建得到重组质粒pUC19-pH，并通过对宿主菌及质粒载体优化最终确定最佳重组大肠杆菌DH5α/pUC19-pH，0.010 8 U/mg的初始比酶活完全具备进行工业发酵的潜力。

在后续的试验中，可通过以下2点来进一步优化产反式-4-脯氨酸重组大肠杆菌，以达到工业化生产的目的：（1）在分子层面，首先可以考虑将透明颤菌血红蛋白基因（VHb）引入重组大肠杆菌中，以提高重组菌对发酵过程中的溶氧效率，从而解决随着发酵时间延长导致溶氧不足的情况。其次，还可以考虑对现有的质粒pUC19-pH进行改进，在质粒中加入可表达的NusA基因序列与反式-4-脯氨酸羟化酶基因共表达，以提高反式-4-脯氨酸羟化酶的可溶性，酶的可溶性提高后，有助于酶与反应体系的催化结合，从而提高重组大肠杆菌生产反式-4-羟基脯氨酸的效率。（2）设计单因素发酵条件优化试验及正交条件优化试验，优化影响重组大肠杆菌DH5α/pUC19-pH发酵的碳氮比、温度、金属离子、无机盐等重要因素，并运用发酵罐中的间歇补料分批发酵、匀速流加发酵等方法探索合理的发酵方式，以达到工业化生产的工艺要求。

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