基于ITS+matK序列探讨部分藤黄属植物的种间亲缘关系

刘政泽+刘博

摘要：对14个藤黄属物种26份样品的ITS和matK进行PCR扩增和测序，应用Kimura 2-parameter遗传距离与最大似然法（ML）和邻接（NJ）系统树分析法进行分析，旨在研究其种间亲缘关系。结果发现，所有藤黄属样品分为四大支且能明显分开，显示出该属植物的亲缘关系。分布于亚洲和美洲的物种能够分开，表明不同的地理环境造成了不同的进化方向。木竹子和菲岛福木在我国有较高的遗传多样性。ITS+matK序列分析可作为藤黄属植物亲缘关系鉴定的手段。

关键词：藤黄属；DNA条形码；ITS；matK；亲缘关系

中图分类号： Q789文献标志码： A[HK]

文章编号：1002-1302（2017）13-0039-04[HS）][HT9.SS]

收稿日期：2016-02-24

基金項目：欧盟第七框架项目（编号：PIRSES-GA-2009-269204）。

作者简介：刘政泽（1991—），男，湖北十堰人，硕士研究生，从事藤黄属植物亲缘关系和分子鉴定研究。Email：liuzhengze1991@163.com。

通信作者：刘博，博士，讲师，从事民族植物学与植物资源学研究。E-mail：boliu@muc.edu.cn。

[ZK）]

藤黄属（Garcinia）植物是藤黄科（Clusiaceae）乔木或灌木，全世界约450种，主要分布在热带亚洲、非洲南部及波利尼西亚西部。我国有21种，其中13种为特有种，产于台湾南部，福建，广东，海南，广西南部，云南南部、西南部至西部，西藏东南部，贵州南部及湖南西南部[1]。

藤黄属植物有很高的食用价值和药用价值。莽吉柿（G. mangotana Linn.）是一种著名的热带水果，被称为“热带水果皇后”[2]。本属植物富含天然苯甲酮成分，具有很好的抗菌、抗病毒、抗细胞毒素、抗HIV和抗真菌活性特性[3]，现代药理学证明，部分藤黄属植物具有潜在的治疗HIV[4]和癌症[5]的能力。Burkill 1966年在《马来半岛经济作物》一书中记载了藤黄属植物可用于产后恢复，治疗痛经、痢疾和发烧。

在我国，藤黄属植物也有很广泛的用途，如傣族、黎族等长期采摘大叶藤黄（G. xanthochymus Hook. f. ex T. Anders.）、岭南山竹子（G. oblongifolia Champ. ex Benth.）和版纳藤黄（G. xipshuanbannaensis Y. H. Li）的果实当作水果和食物调料。中药藤黄是我国的传统药材，中医用其治疗痈疽肿毒、溃疡、湿疮、肿瘤、顽癣、跌打损伤、创伤出血及烫伤等[6]。金丝李（G. paucinervis Chun et How）是我国二级保护植物和珍贵的用材树种[7]。木竹子（G. multiflora Champ. ex Benth.）和岭南山竹子因其种子含油，可用于制作肥皂和机械润滑油。藤黄属植物也是重要的观赏植物，如大叶藤黄和木竹子都有很高的观赏价值，常被用作园林树木[8-9]。菲岛福木（G. subelliptica Merr.）是我国沿海地区营造防风林的理想树种。

由于藤黄属植物具有重要的价值，研究其种间亲缘关系、系统发育，为今后广泛地栽培利用提供基础资料很有必要。DNA条形码是用一段短的标准的序列对物种进行鉴定的新方法，具有快速、准确、可重复的特点，为物种的鉴定和亲缘关系的研究提供了新思路[10]。

在真核生物中，核糖体DNA中的18S、5.8S和28S的基因组序列在大多数生物中趋于保守，在生物种间变化小，而内转录间隔区ITS1和ITS2作为非编码区，承受的选择压力较小，相对变化较大，并且能够提供详尽的系统学分析所需要的可遗传性状，因此被广泛用于植物分类学研究中[11-12]。Yapwattanaphum等学者在先前的研究中已使用ITS序列探求部分东南亚藤黄属物种间的亲缘关系[2，13]。matK基因位于叶绿体trnK基因的内含子中，编码一种参与RNA转录体中Ⅱ型内含子剪切的成熟酶（matuease），是叶绿体基因组的蛋白编码区进化最快的基因之一，其核苷酸变化也可为种间系统进化研究提供一定的信息。本研究基于matK和ITS序列[14-15]，探讨藤黄属的亲缘关系和系统发育问题。

1材料与方法

1.1材料

试验所用材料取自野外和植物园，共16个物种28份样品，其中藤黄属样品14种26份（5种在中国有分布），选取藤黄科它属植物Mammea sessiliflora和Mesua ferrea作为外类群（表1）。

1.2方法

1.2.1总DNA的提取

使用改良后的CTAB法提取经硅胶干燥的叶片总DNA[16]。

1.2.2DNA序列的扩增和测序

（1）ITS序列的扩增。参考White等的方法[17]使用引物ITS-4（5′-TCCTCCGCT TATTGATATGC-3′）和ITS-5（5′-GGAAGTAAAAGT CGTAACAAGG-3′）扩增ITS1-5.8S-ITS2完整序列。PCR反[CM（25]应体系为[KG*5]25[KG*3]μL，包括DNA模板1.0 μL（10[KG*3]ng）、2×DNA纯化和测序工作由北京铂尚生物技术有限公司完成。

1.2.3DNA数据的整理

使用MEGA 6.0对导入的序列进行对位排列（alignment），进一步手动校对和调整；ITS及matK序列的头和尾参照Genbank上已有的相关系列确定；各片段的GC含量通过DNAstar Lasergene计算；序列的变异位点、信息位点和保守位点个数由MEGA 6.0确定。endprint

1.3亲缘关系和系统发育分析

用MEGA 6.0计算ITS+matK序列的种间Kimura 2-parameter（K2P）遗传距离，数据采用最大似然法（maximum likelihood，ML）和邻接法（neighbor-joining，NJ）分析。其中邻接法分析采取K2P距离法，进行1 000次自展重复检测支持率；最大似然法通过Modeltest确定最适模型（Kimura 2-parameter + Gamma distributed），自展数据值为1 000次，以提高树中分枝的置信度[19]。

2结果与分析

2.1序列测定结果

测序得到ITS、matK序列56条，将其在NCBI上进行BLAST相似性检索，均有较好的匹配程度，确认所测序列为目标序列，检索比对结果表明测序结果准确可靠。

2.2序列分析

在序列长度方面，ITS（615～623 bp）略短于matK（699～715 bp）。在序列GC含量上，matK和ITS明显不同，matK只有30.68%，而ITS高达51.63%。ITS有251个变异位点，matK相对较少，变异位点数为114个（表2）。

2.3K2P遗传距离

ITS+matK序列的种间K2P遗传距离为0.004 6～0.191 8，平均遗传距离为0.076 3（表3）。其中，岭南山竹子和云树间的遗传距离最小，为0.004 6；菲岛福木和莽吉柿间的遗传距离最大，为0.191 8。

2.4亲缘关系和系统发育分析

基于ITS+matK序列以M. sessiliflora和M. ferrea作为外类群，通过最大似然法（ML）和邻接法（NJ）构建系统发育树（图1、图2）。2种不同方法所构建的发育树结构基本一致，且能将本研究涉及的14种藤黄属样品区分开。所有样品[FL）]共聚类为四大支且主要集中于两大支，木竹子和G. rostrata分别[CM（25]自成一支。2种建树结果支持云树和岭南山竹子归为一支[JP][CM）]

[FK（W21][TPLZZ222.tif][FK）]

（自展支持率分别为99%和100%）；莽吉柿和G. penangiana、G. hombroniana、G. scortechinii等东南亚种亲缘关系较近。系统发育树支持G. madruno和G. intermedia为一小支（自展支持率均为100%），这与其均产自热带美洲相吻合。菲岛福木、G. nervosa和G. madruna此3种亚洲物种与G. madruno和G. intermedia美洲物种聚为一支。

3讨论与结论

28份样品均成功扩增出ITS和matK片段，扩增成功率100%。基于ITS+matK序列信息建树，能将所有样品区分开，说明ITS+matK序列可以为藤黄属物种的系统进化和亲缘关系研究提供足够的变异信息。和前人研究一致，matK序列相對于ITS序列较为保守，进化速度较慢。

在系统发育树中，分布于亚洲和美洲的藤黄属物种基本能够分开，说明不同的地理环境使其产生了不同的进化方向。而木竹子和G. rostrata自成一支，则需要进一步的研究或使用其他DNA条形码探究其与其他物种之间的关系。菲岛福木、G. nervosa和G. madruna此3种亚洲物种与美洲物种形成姐妹群，它们在藤黄属系统进化中的地位仍需更多的研究来确定。采自不同省份的木竹子和菲岛福木在其种内表现出遗传差异，说明它们具有较高的遗传多样性，并且进一步证明ITS+matK序列在藤黄属内有很好的鉴别能力。G. penangiana在嫁接中被当作莽吉柿的砧木使用，在系统发育树中它们也是近缘种。

单独抽取系统发育树中分布于中国的物种，将其与基于形态学的经典分类法所得到的系统发育树相比较，展现了高度的相似性（图3）。例如云树和岭南山竹子在形态学上很难区分，只能根据它们的果实性状和子房数进行分辨，本研究通过DNA条形码技术同样支持这一结果，其遗传距离最小只有0.004 6。这一结果在一定程度上反映了经典分类系统的可靠性。

[FK（W8][TPLZZ333.tif；S+2mm][FK）]

本研究利用ITS+matK序列通过DNA条形码技术初步探究了部分藤黄属植物的亲缘关系，期望为该属植物今后的开发利用提供必要的信息和数据。但是由于条件有限，所涉及物种较少，希望今后可以增加新材料，完善藤黄属植物的亲缘关系和系统发育研究。

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