小鼠睾丸、肌肉和心脏Ldhc基因表达的比较研究

石云 洪键

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.13.011[HT9.]

摘要：Ldhc基因仅在哺乳动物成熟的睾丸和精子中表达，并在哺乳动物的睾丸中普遍存在剪接体现象，但是Ldhc基因在肌肉和心脏组织中的表达情况以及与睾丸中该基因的表达丰度比较尚不清楚。因此，以小鼠为研究对象，首先检测小鼠肌肉和心脏组织中Ldhc基因的表达类型，然后采用荧光定量和Western Blot比较分析3个组织中Ldhc基因和蛋白的表达丰度。结果表明，在小鼠肌肉和心脏组织中未检测到cDNA全长，却发现2种Ldhc剪接体，参照小鼠Ldhc基因结构分析了选择性剪接体的结构；剪接体1包含完整酶的NAD+结合结构域和酶的活性中心，有可能表达蛋白；剪接体2缺失第4、7外显子。对小鼠肌肉、心脏和睾丸组织乳酸脱氢酶（LDH）同工酶的电泳分析未检测到潜在的Ldhc剪接体的表达。荧光定量检测发现，Ldhc基因在睾丸组织中的表达量要显著高于肌肉和心脏组织，而Western Blot仅在睾丸组织中检测到LDHC4蛋白的表达。以上结果表明，小鼠Ldhc基因的选择性剪接机制也存在于肌肉和心脏组织中，推测可能是调控该基因在肌肉和心脏组织中沉寂的方式之一。

关键词：小鼠；乳酸脱氢酶-C；肌肉；心脏

中图分类号： Q786文献标志码： A[HK]

文章编号：1002-1302（2017）13-0043-03[HS）][HT9.SS]

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收稿日期：2016-12-20

基金项目：江苏高校品牌专业建设工程（编号：PPZY2015A097）；盐城市医药卫生科技项目（编号：YK2013048）。

作者简介：石云（1982—），女，吉林集安人，硕士，讲师，主要从事天然药用活性物质研究。Tel：（0515）88233192；E-mail：shiyun210@163.com。[HJ]

[ZK）]

乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，简称LDH）是一类四聚体寡聚酶，广泛存在于脊椎动物、植物和细菌中[1]。在哺乳动物中，LDH存在3种类型的同工酶亚基：LDH-A（肌肉型）、LDH-B（心脏型）和LDH-C（睾丸型），分别由A、B、C基因编码[1]。而由Ldhc基因编码的乳酸脱氢酶-C4首先是在多种哺乳动物、鸟类成熟睾丸组织和精子中被发现[2-3]。研究表明，LDH-C4由4个C亚基以四聚体形式组成，编码LDH-C4的C亚基基因也不同于编码A、B亚基的基因，而且不与A、B亚基结合[4]。有关LDH-C4的基础研究已有较多报道，涉及酶的活力与分离纯化、酶学性质、免疫原性、细胞内的定位、酶活性随生长发育的变化等方面。

人、小鼠等哺乳动物Ldhc基因已经被克隆，Ldhc基因由侧翼5′端和3′端调控序列、外显子以及内含子区域共同组成，编码区全长序列包括8个外显子，编码332个氨基酸[5]。然而，Koslowski等报道，在人的肿瘤细胞中共检测到6种Ldhc剪接变异体，而这些变异体在正常细胞中是不存在的[6]。Coonrod等通过蛋白组学的分析方法，在鼠卵细胞和着床前的早期胚胎中也意外地检测到了LDH-C4的表达，但是其功能尚不清楚[7]。笔者在以前的研究中从牦牛、狗和大鼠睾丸组织中均发现了4或5种Ldhc剪接体，并且在牦牛肌肉和心脏组织中还意外地检测到Ldhc的2种剪接体[8-9]。Huang等在小鼠睾丸组织中检测到了cDNA全长和Ldhc的多种剪接体[10]。因此，这些研究结果不仅改变了长期以来有关LDH-C4仅分布于睾丸和精子中的观点，而且能够为其进一步的功能分析以及表达调控等方面研究提供新线索。这些研究结果同时提示，[WTBX][STBX]LDH-C4[WTBZ][STBZ]基因的选择性剪接现象不但在不同物种中普遍存在，而且也极有可能在同一物种不同的组织中广泛存在。虽然在小鼠睾丸组织中也检测到了Ldhc基因的剪接体，但Ldhc基因在乳酸脱氢酶分布非常丰富的肌肉和心脏组织中是否也存在剪接体，并且其表达方式和丰度与睾丸中有什么不同都尚不清楚。本研究探讨了小鼠肌肉和心脏组织中Ldhc基因的表达方式以及与睾丸组织中该基因的表达丰度比较。

1材料与方法

1.1材料

试验所用成年雄性C57BL/6小鼠（n=6），购自扬州大学比较实验动物中心。小鼠采用腹腔注射麻醉致死，采集腓肠肌、心脏和睾丸组织，样品均保存于-70 ℃。

1.2方法

1.2.1小鼠肌肉组织总RNA的提取

将小鼠腓肠肌和心脏组织于液氮中研磨成粉，称取40 g组织样，用TRIzol试剂（Invitrogen公司）按操作说明从组织中提取总RNA。提取的总RNA按照RNA PCR Kit （AMV） Ver. 3.0（TaKaRa公司）试剂盒的操作反转录。

1.2.2小鼠Ldhc cDNA的克隆

根据小鼠的Ldhc基因序列（GenBank登錄号为NM_013580）设计PCR引物，PCR正向、反向引物依次为：5′-CGGAGTCAGCAGTAAGGCTCAAC-3′、5′-AGCAGATTTCCGTTTGAGGTCAG-3′；引物由上海Invitrogen公司合成。

PCR反应程序：94 ℃ 1 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30个循环；72 ℃ 延伸10 min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR扩增产物经胶纯化试剂盒直接纯化后，采用TaKaRa公司的pMD 19-T载体进行克隆，宿主菌为大肠杆菌DH5α。挑取60个阳性克隆经PCR鉴定后，插入片段大小不同的克隆产物送上海Invitrogen公司进行双链测序，序引物为pUC系列载体的通用引物M13F和M13R。用VectorNTI软件对克隆子的核酸序列进行比对分析。endprint