六株不同地区分离的H7N9流感病毒假病毒制备与生物学特性研究

黄保英 李善琴 齐香荣 任皎 宋敬东 谭文杰 田厚文 阮力

102206 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 卫生部医学病毒和病毒病重点实验室

·论著·

六株不同地区分离的H7N9流感病毒假病毒制备与生物学特性研究

黄保英 李善琴 齐香荣 任皎 宋敬东 谭文杰 田厚文 阮力

102206 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 卫生部医学病毒和病毒病重点实验室

目的选择不同地区分离的H7N9亚型流感病毒代表株，制备各代表株的假病毒，为H7N9疫苗对不同地区毒株的免疫保护效果评价奠定基础。方法通过对29株H7N9流感病毒血凝素(Hemagglutinin，HA)的氨基酸序列分析，获得6株不同地区H7N9亚型流感病毒代表株病毒；采用基于慢病毒载体的假病毒包装系统，以HA与神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)作为包膜质粒，包装获得6株带有荧光素酶报告基因的假病毒；通过电镜负染、Western blot检测、感染MDCK后的荧光素酶读值和血凝试验等了解6株假病毒的生物学特性，通过血清交叉中和试验了解其在中和抗体检测中的应用情况。结果筛选获得6株不同地区分离的H7N9流感病毒代表株并制备了相应的假病毒颗粒，电镜下可观察到典型的流感病毒形态，Western blot可检测到HA、NA和P24的表达；滴度测定结果显示6株假病毒对MDCK细胞的感染力为104～105TCID50/50 μl，血凝活性可达64～512；SH1上海株H7N9 HA疫苗免疫血清针对6株流感假病毒100TCID50剂量的中和效力不同，提示6株假病毒可用于疫苗的交叉免疫效果评价。结论成功获得6株H7N9不同地区代表株流感假病毒，为疫苗的免疫效果评价奠定了基础。

自2013年3月中国首次报道人感染H7N9禽流感以来[1]，我国已出现五波H7N9疫情，尤其是2016年9月至今的这一波流行具有开始较早、感染人数大幅增加以及家禽感染程度高等特点，引起全球公共卫生领域的高度关注[2-3]。H7N9流感病毒血凝素(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)可以诱导机体产生保护性中和抗体[4]，但HA抗原决定簇的氨基酸变异会导致HA抗原特性的改变并影响疫苗的保护效果。为了更好的评价H7N9疫苗的免疫保护效果，需要使用具有不同HA抗原特性的不同地区H7N9流感病毒代表株进行血清交叉中和抗体的评估。

A/Shanghai/1/2013(H7N9)是最早分离获得的H7N9流感病毒之一，通过对HA抗原决定簇的氨基酸突变分析，有可能获得具有不同HA抗原特性的病毒株信息。但是，H7N9流感病毒的分离和经典的中和试验因涉及活病毒的操作而存在一定的生物安全隐患[5]。而假病毒颗粒由于缺乏病毒复制能力而具有良好的安全性，荧光素酶报告基因还能实现高通量快速检测，在高致病性病原微生物的研究中具有独特的优势[6]。因此，通过对HA蛋白序列比对获得抗原决定簇关键位点氨基酸变异的病毒株，并在此基础上制备多株流感假病毒并建立操作安全的体外中和试验技术平台，可用于研发中H7N9疫苗免疫效果评估，将对H7N9流感的防控具有重要意义。

基于上述分析，本研究以A/Shanghai/1/2013(H7N9)为参考株，对来自全球禽流感共享数据库[7](Global Initiative on Sharing Avian Influenza Data，GISAID)的29株H7N9流感病毒HA蛋白序列及其抗原决定簇的关键位点氨基酸的分析，筛选获得6株H7N9流感病毒株，在此基础上制备了6株表达相应毒株的HA和NA蛋白的流感假病毒，并对其生物学活性和在血清交叉中和抗体检测中的应用进行了初步研究，为H7N9流感疫苗的免疫效果评价奠定了基础。

1 材料与方法

1.1材料293FT细胞与MDCK细胞为本科室保存，X-treme GENE HP用于质粒转染，购自美国Roche公司； TPCK-胰酶用于处理假病毒，购自美国Sigma公司；A/Shanghai/1/2013(H7N9)流感病毒的抗HA、抗NA和抗p24鼠单克隆抗体分别购自北京义翘神州生物技术有限公司和溯本源和生物技术公司；Bright-Glo荧光素酶系统检测试剂购自美国Promega公司；DyLight 800山羊抗小鼠红外二抗IgG购自美国LiCOR公司。火鸡血球购自北京芳元缘养殖场。表达A/Shanghai/1/2013(H7N9)HA蛋白的DNA和痘苗病毒疫苗联合免疫获得的小鼠阴性和阳性血清各5份由本室保存[8-9]，阴性血清的抗体几何平均滴度(Geometic Mean Titer，GMT)小于1∶40；阳性血清的GMT为1∶1.6×105～1∶6.4×105。

1.2序列与质粒29株H7N9流感HA蛋白序列均来自GISAID数据库，使用分子进化分析软件(Molecular Evolutionary Genetics Analysis，MEGA)MEGA 5.0版本，采用邻接法构建进化树，结合HA蛋白抗原位点的分析获得6株代表株。表达6株H7N9流感病毒优化型HA和NA的重组质粒pVRC-HA和pVRC-NA以及携带荧光素酶报告基因的质粒pNL4-3-Luc.R-E-均为本科室保存，分别用于假病毒制备的包膜质粒和骨架质粒[8-9]。

1.3假病毒的包装按照优化条件进行假病毒颗粒的制备[8-9]。将293FT细胞于37 ℃，5% CO2培养16～18 h至细胞融合度为80%左右。先按质量比例3∶1将骨架质粒和包膜质粒混合制备DNA，再按质量-体积比例1∶2将DNA与HP混合，室温避光反应15 min后即为转染复合物，最后加入293FT细胞时需逐滴加入并轻轻混匀。转染后10 h换含2% FBS的DMEM维持培养，收集48 h、72 h及96 h的培养上清液，分别于4 ℃条件下经2 200×g离心5 min和20%蔗糖进行16 000×g超速离心2 h，依次去除细胞碎片和垫层纯化，最后按1∶25用PBS重悬，溶解过夜后分装于-80 ℃冻存。6株假病毒分别命名为SH1op、AH1op、NJ1op、WX2op、GD2op及EN1op。

1.4假病毒的电镜形态学观察通过电子显微镜观察负染的假病毒颗粒形态。

1.5假病毒的Westernblot分析使用SDS-PAGE上样缓冲液处理假病毒，100 ℃煮沸10 min。根据P24定量结果取100 ng P24假病毒进行SDS-PAGE电泳和电转移，硝酸纤维素膜使用5%脱脂奶封闭1 h；分别加入抗p24鼠单抗和抗流感病毒H7N9的HA及NA鼠单抗，37 ℃反应1 h；PBST洗涤3次，加入DyLight 800山羊抗小鼠红外二抗，37 ℃反应1 h；PBST洗涤3次，最后使用Odyssey红外荧光扫描成像系统观察结果。

表1 6株H7N9流感病毒HA蛋白的氨基酸替换

1.6假病毒的滴度测定将MDCK细胞接种96孔板，37 ℃，5% CO2孵箱培养至细胞融合度达到80%左右。假病毒于37 ℃使用TPCK-胰酶2 μg/ml 处理1 h后进行5倍连续稀释，按照50 μl/孔感染MDCK细胞，4个复孔/稀释度。感染后10 h换DMEM维持培养，48 h后使用Bright-Glo荧光素酶系统检测试剂裂解细胞，使用GLOMAX 96 微孔板发光检测仪检测相对荧光单位(Relative luciferase unit, RLU)，假病毒半数组织感染剂量(50% Tissue Culture Infection Dose,TCID50)使用Reed-Muench公式计算。

1.7假病毒的血凝滴度测定将96孔V孔板加入生理盐水50 μl/孔，样品倍比稀释方案如下：第1列加入50 μl假病毒，混匀后从第1列吸出50 μl样品至第2列，以此类推至最后一列；最后加入等体积的1%火鸡血球，室温反应30 min，观察记录血凝结果。

1.8假病毒的中和试验将MDCK细胞接种96孔板，于37 ℃，5% CO2孵箱培养至细胞融合度达到80%左右。假病毒颗粒经TPCK-胰酶处理，小鼠血清56 ℃灭活30 min后倍比稀释；分别将100TCID50剂量假病毒与各稀释度血清等体积混合，37 ℃反应1 h，将血清-病毒复合物100 μl/孔感染MDCK细胞，感染后10 h换DMEM维持培养，48 h后裂解细胞检测RLU。抗体中和百率(%)=(假病毒对照RLU-检测血清RLU)/(假病毒对照RLU-细胞对照RLU)×100%。IC90判定为90%假病毒颗粒荧光读值被抑制的最高血清稀释度的倒数。

1.9绘图及统计学分析使用GraphPad Prism 6.0软件绘图，统计学比较采用方差分析，有统计学意义的判定标准为P<0.05。

2 结果

2.16株H7N9流感病毒代表株的筛选为了获得不同抗原特性的H7N9流感病毒代表株，本研究对GISAID数据库中2013年度的29株H7N9流感病毒HA的氨基酸序列比对，获得抗原决定簇氨基酸位点存在差异的6株代表株，分别为A/Shanghai/1/2013(H7N9)、A/Anhui/1/2013(H7N9)、A/Nanjing/1/2013(H7N9)、A/Wuxi/2/2013(H7N9)、A/Guangdong/1/2013(H7N9)和A/Environment/Wuxi/1/2013(H7N9)(表1)，分别简称为SH1、AH1、NJ1、WX2、GD1及EN1。6株病毒对应的HA基因GenBank序列号分别EPI439486、EPI439507、EPI453604、EPI467313、EPI446746和EPI467345，对应的NA基因GenBank序列号分别：EPI138737、EPI138739、EPI142305、EPI145652、EPI145654和EPI148417，各株病毒HA和NA氨基酸的相似性分别大于98%和99%，AH1、WX2和GD1的NA氨基酸序列完全一致。

2.26株H7N9流感假病毒的电镜形态和蛋白表达情况按照优化条件制备6株H7N9流感假病毒，分别简称为SH1op、AH1op、NJ1op、WX2op、GD1op及EN1op，电镜下可观察到具有致密电子核心和包膜的颗粒，颗粒形状包括杆状、圆形或不规则形等，直径为80～120 nm(图1A)；使用流感病毒H7N9抗HA、抗NA与抗p24单抗进行Western blot鉴定，可同时检测到相对分子质量75×103、75×103和24×103三条带，分别与HA蛋白、糖基化的NA蛋白、P24蛋白相对分子质量一致(图1B)。上述结果表明，6株H7N9流感假病毒均具有典型的流感病毒形态，假病毒颗粒中均有HA和NA蛋白的嵌入。

图2 6株H7N9流感假病毒的感染滴度(A)和血凝滴度(B)Fig.2 Infectivity (A) and HAU titer (B) of six H7N9 pseudoviruses

图1 6株H7N9流感假病毒的电镜形态(A)和Western blot鉴定(B)Fig.1 Electron microscopic morphology (A) and Western blot analysis (B) of six H7N9 pseudoviruses

2.36株H7N9流感假病毒均具有较高的感染活性和血凝活性通过假病毒颗粒中的荧光素酶读值计算其感染活性，TCID50检测结果显示6株假病毒在MDCK细胞中的感染滴度均在104TCID50/50 μl～105TCID50之间，SH1op、AH1op和GD1op的感染滴度相当(4×104TCID50/50 μl)，WX2op和EN1op的感染滴度(105TCID50/50 μl)显著高于NJ1op(104TCID50/50 μl)(图2A)。血凝活性测定结果与TCID50结果趋势一致，6株假病毒的血凝滴度在64～512之间，其中，WX2op和EN1op的血凝滴度明显优于NJ1op(图2B)。上述结果表明，6株H7N9流感假病毒均具有较高的感染活性和血凝活性。

2.46株不同H7N9流感假病毒可用于血清交叉免疫效果评价为了解6株假病毒在血清交叉中和抗体检测中的应用情况，使用针对SH1 HA的小鼠血清分别与6株假病毒进行了中和试验。结果显示，SH1阳性血清对6株假病毒的中和活性随稀释度的增加而降低，中和效价由高到低依次为SH1op、NJ1op、AH1op、GD1op、EN1op及WX2op(图3A)。其中，针对株特异性的SH1op的中和效价最高，与WX2op、GD1op和EN1op的中和效价具有显著差异；针对WX2op的中和效价最低，还与针对GD1和EN1的中和效价具有显著差异(图3B)。这些结果表明，6株H7N9流感假病毒的HA抗原性在统计学上存在差异，可以模拟流行株病毒用于血清交叉中和抗体的检测。

3 讨论

图3 针对6株H7N9流感假病毒的血清中和曲线(A)和IC90 (B)Fig.3 Serum neutralization curve (A) and IC90 titer (B) against six H7N9 pseudoviruses

WHO于2013年9月首次推荐了A/Anhui/1/2013(H7N9)和A/Shanghai/2/2013(H7N9)为H7N9候选疫苗株[10]，本研究早期选择的29株H7N9流感病毒均为2013年度的流行株，其在GISAID数据库中具有完整的HA和NA序列，可进一步获得相应的氨基酸序列进行假病毒的制备。值得注意的是，随着疫情的持续存在，流感病毒不断发生抗原性改变[11-12]，WHO于2017年3月2日更新A/Hunan/2650/2016-like virus或A/Guangdong/17SF003/2016-like或A/Hong Kong/125/2017 (A/Hunan/2650/2016-like)作为新的疫苗株病毒[13]，为了更好的评估疫苗的保护效果，后期还应根据病毒分子检测结果及时补充更新H7N9流行株病毒的信息，构建具有新的抗原特性的流感假病毒，不断扩充流感假病毒材料库，更全面评估H7N9疫苗效果。

HA的抗原决定簇主要位于其球部区域的1～327位氨基酸，关键位点的突变有可能导致HA抗原特性改变[14]。本研究分析的29株H7N9流感病毒的HA氨基酸序列中，SH1与其它各株在进化树上距离最远，AH1、NJ1、WX2、GD1和EN1等病毒株呈现出一定的区域性特点。抗原决定簇氨基酸位点的变异分析显示，除SH1病毒株以外，其它各种病毒均出现了Q226 L、G186V和S138A的突变，与病毒和人类受体的结合能力增强有关；与早期推荐的AH1疫苗株病毒相比，NJ1、WX2、GD1和EN1还分别在65位、140位、143、208、285位氨基酸出现不同变异，有可能会影响HA的抗原特性，基于上述分析，本研究选择了SH1、AH1、NJ1、WX2、GD1及EN1病毒作为代表株。

获得具有高灵敏度和高感染滴度的H7N9流感假病毒是中和试验技术平台建立的重要环节。本研究按照前期优化的假病毒包装参数，选用带有荧光素酶报告基因的假病毒包装系统以实现检测的高灵敏度，在此基础上以密码子优化HA和NA作为包膜质粒，制备了6株H7N9流感假病毒并研究了其生物学活性。在电镜下可以观察到典型的流感病毒形态，Western blot可检测到HA、NA和P24的表达，病毒滴度测定结果也显示6株流感假病毒均具有较高的感染活性和良好的血凝活性。上述结果进一步验证了流感假病毒制备条件的可重复性，该参数可进一步推广应用于H7N9其它流行株的假病毒的制备中。值得一提的是，TCID50和HAU结果提示，在同样的制备条件下，WX2op和EN1op假病毒的包装效率较NJ1op高，可能与HA和NA的重配特性有关[15]，但尚需进一步深入验证。

中和试验是确定病毒感染及评价疫苗保护效果的重要指标，中和抗体效价的高低可以反应疫苗针对特定病毒株免疫保护效果的强弱[16]。WHO最近公布的HA抗原特性分析结果表明，H7N9已分化成珠江三角洲和长江三角洲两个谱系，并且最近分离出的长三角分支病毒抗原性与目前疫苗株的雪貂感染血清交叉反应性降低，提示H7N9流感病毒抗原性发生变异，可能会逃逸现有疫苗株的免疫保护。本研究中SH1 HA的疫苗免疫小鼠血清针对不同地区H7N9流行株的中和效价存在统计学差异，再次验证了使用不同地区分离的H7N9亚型流感病毒代表株用于疫苗效果评价的重要性。

综上所述，本研究成功筛选和制备了6株H7N9不同地区代表株流感假病毒，可同时表达相应毒株的HA和NA蛋白，具有典型流感病毒形态、高感染力和良好的血凝活性，可用于H7N9交叉中和抗体检测，为H7N9流感疫苗的免疫效果评价奠定了基础。

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PreparationandcharacteristicanalysisofsixinfluenzaA(H7N9)pseudovirusderivedfromdifferentdistrictsofChina

HuangBaoying,LiShanqin,QiXiangrong,RenJiao,SongJingdong,TanWenjie,TianHouwen,RuanLi

KeyLaboratoryforMedicalVirology,MinistryofHealth.NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China

s:TianHouwen，Email：houwent@126.com；RuanLi，Email：ruanlicdc@163.com

ObjectiveTo prepare strains of influenza A (H7N9) pseudovirus derived from different districts of China for vaccine efficacy evaluation.MethodsPhylogenetic tree was built based on hemagglutinin (HA) amino acid sequence analyses from 29 influenza A (H7N9) virus strains and 6 influenza A (H7N9) virus strains with HA determinants variation were selected. 293FT cells were co-transfected with plasmid pNL4-3-Luc.R-E-, pVRC-HA and pVRC-NA with codon-optimized hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) derived from the six influenza A (H7N9) virus strains, respectively. Transmission electron microscopy assay and Western blot analysis were performed to demonstrate morphology and specificity of these particles, luciferase activity assay and hemagglutinin titers detection were used to determine their infectivity and hemagglutinin activity. And finally, pseudovirus-based neutralization assays were evaluated with HA immunized mice serum.ResultsSix influenza A (H7N9) peseudovirus particles derived from different districts of China were selected and prepared. All of the particles bearing HA and NA were characterized with classic influenza virus morphology, with TCID50titer ranged from 104TCID50/50 μl to 105TCID50/50 μl and with hemagglutinin activity ranged from 64 to 512. Neutralization efficacies on influenza A/Shanghai/1/2013(H7N9) HA vaccine serum against 100TCID50dose of these pseudovirus particles indicated their potential application in the vaccine cross-protective evaluation in future.ConclusionsSix influenza A (H7N9) pseudovirus derived from different districts of China with potential antigenic variation on HA were constructed successfully, established foundation for their further application in vaccine cross-reactive efficacy evaluation.

Influenza A (H7N9) virus; Pseudovirus; Hemagglutinin; Antigenic variation; Neutralization

H7N9流感病毒； 假病毒；血凝素；抗原特性；中和试验

2017-04-12)

(本文编辑：吕新军)

田厚文，Email：houwent@126.com； 阮力，Email：ruanlicdc@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.04.001

国家传染病科技重大专项(2014ZX10004002)；国家863计划(2006AA02A203)；国家自然科学基金(31200127)；国家重点研发计划(2016YFD0500300、2016YFC1200200)

Fundprograms: Megaproject for Infectious Disease Research of China (2014ZX10004002)；National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (2006AA02A203)；National Natural Science Foundation (31200127)；National Key Plan for Scientific Research and Development of China (2016YFD0500300, 2016YFC1200200)