高效液相色谱法同时测定发酵液中胡椒醛、胡椒酸以及黄樟油素

赵明涛，郑璞*，邢晨光，刘思琴，赵希景，陈鹏程

1(江南大学 生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡，214122) 2(厦门欧米克生物科技有限公司，生物工程试验室，福建 厦门，361000)

高效液相色谱法同时测定发酵液中胡椒醛、胡椒酸以及黄樟油素

赵明涛1，郑璞1*，邢晨光2，刘思琴1，赵希景2，陈鹏程1

1(江南大学 生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡，214122) 2(厦门欧米克生物科技有限公司，生物工程试验室，福建 厦门，361000)

建立了高效液相色谱法同时测定发酵液中胡椒醛、胡椒酸以及黄樟油素的分析方法。采用梯度洗脱程序，流动相为A：乙腈，流动相B：0.1%甲酸水溶液，Amethyst C18-H反相色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱温30 ℃，检测波长270 nm，胡椒醛、胡椒酸以及底物黄樟油素能够良好分离，且平均加标回收率在98.0%～101.0%，精密度偏差在0.5%～2.0%范围内。 用此方法测得液化沙雷氏菌CCTCC No：M2016170发酵液中含有182 mg/L 胡椒醛和9.8 mg/L胡椒酸。

高效液相色谱；胡椒醛；胡椒酸；液化沙雷氏菌；发酵液

胡椒醛(Piperonal)，又称洋茉莉醛(Heliotropine)，化学名称为3，4-亚甲二氧基苯甲醛。19世纪中叶，FITTING和MIELCH在研究胡椒碱的水解以及氧化过程中发现了胡椒醛[1]。胡椒醛在香英豆、刺槐花等植物中少量存在，被广泛应用于食用香精、皂用、化妆品、医药以及电镀等工业，是世界上最主要的香料之一[2]。目前，胡椒醛的工业生产主要由化学合成，但是化学合成过程中存在环境污染、产率低、操作难度大等缺陷。近年来，生物技术合成胡椒醛的研究逐渐兴起[3]。一些微生物能够通过微生物发酵或添加前体转化产生芳香醛、芳香酸等物质。因此，准确测定发酵过程中底物的消耗，产物胡椒醛及其胡椒酸的生成，对于研究利用微生物生产胡椒醛具有重要意义。

目前定量测定发酵液中的芳香醛类主要采用高效液相色谱法( high performance liquid chromatography，HPLC)[4-6]，气相色谱法( gas phase chromatography，GC)[7-8]。RYU[9-10]等利用高效液相色谱法，采用梯度洗脱程序,对微生物发酵液中的丁香酚、异丁香酚、香兰素以及阿魏酸等苯丙素类化合物进行了定量测定。但在胡椒醛的微生物法制备中，一般采用GC方法测定发酵液中的产物含量。如SANTOS[7-8]等以氢气为载气检测真菌、酵母和细菌发酵液中的胡椒醛。其中Aspergillus、Cladosporium,Peacilomyces和Pseudomonas三株菌株的发酵液最高含64 mg/L 胡椒醛。本课题组前期筛选到1株能够发酵产胡椒醛的液化沙雷氏菌CCTCC No：M2016170，本文通过建立梯度洗脱高效液相色谱法，实现了同时检测发酵液中的胡椒醛、胡椒酸以及黄樟油素，为进一步选育高产菌株和优化发酵工艺奠定了基础。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂

HITACHI Chromaster 高效液相色谱仪，HITACHI Chromaster 5430 DVD检测器，HITACHI Chromaster 5110 泵结构，HITACHI Chromaster 5319 柱温箱，HITACHI Chromaster 5210 自动进样器；美国赛分科技有限公司Amethyst C18-H反向柱(4.6 mm×250 mm，5μm)。

乙腈为色谱纯，乙酸乙酯和甲酸均为分析纯，实验用水为超纯水。

标准品：胡椒醛和黄樟油素，由厦门嘉盟生物科技有限公司；胡椒酸，北京百灵威科技有限公司。

1.2菌种

液化沙雷氏菌(SerratialiquefaciensCCTCC No：M2016170)保藏于中国典型培养物保藏中心，从黑龙江原始森林土壤中筛选获得。

1.3菌株培养以及发酵条件

种子培养基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，葡萄糖10 g，蒸馏水1 L，pH自然。

发酵培养基：NH4NO31 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO40.5 g，K2HPO41.5 g，NaCl 0.5 g，酵母膏0.5 g，葡萄糖5 g，蒸馏水1 L，pH 7.0。

发酵条件：将斜面保藏的液化沙雷氏菌接种于装有30 mL种子培养基的250 mL锥形瓶中，在30 ℃下培养15～20 h。然后种子液接种于发酵培养基中，30 ℃下培养20 h，然后向发酵液中加入底物至终质量浓度1 g/L，继续发酵48 h。

1.4样品的处理

取5 mL发酵液，用2倍体积的乙酸乙酯进行萃取，萃取液利用0.45 μm的有机滤膜过滤，过滤液进样检测。

1.5实验方法

1.5.1 标准溶液的配制

准确称取一定量的胡椒醛、胡椒酸以及黄樟油素，用乙酸乙酯配制成质量浓度均为1 g/L的混合标样。

1.5.2 HPLC检测条件

色谱柱：Amethyst C18-H反向柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；UV检测器；流动相A：乙腈，流动相B：0.1%甲酸水溶液；柱温30～40 ℃；流速1.0 mL/min；检测波长270 nm；进样量10 μL；梯度洗脱程序见表1。

2 结果与讨论

2.1胡椒醛、胡椒酸和黄樟油素分离条件的选择

2.1.1 检测波长的选择

采用RYU[9-10]等报道的270 nm。

2.1.2 流动相的选择

根据RYU[9-10]等的报道，对于苯丙素类化合物可以采用乙腈与水作为流动相测定，流动相中添加适量甲酸可以调节pH以抑制其相应酸的解离，改善色谱峰型、提高分离度[11-12]。本文先分别选用2种不同比例的流动相[V(乙腈)∶V(水)∶V(甲酸)=55∶45∶0.1和V(乙腈)∶V(水)∶V(甲酸)=70∶30∶0.1]，比较采用等度洗脱方法分离胡椒醛、胡椒酸以及黄樟油素的情况(图1)。样品用乙酸乙酯溶解。从图1A中可以看出，胡椒醛与胡椒酸不能分离，黄樟油素与乙酸乙酯的出峰存在叠加(18 min 处)，并且黄樟油素出现不良峰型。改变流动相配比，如图1B所示，胡椒醛、胡椒酸以及黄樟油素的出峰时间均提前，但仍不能达到分离的效果。

1-胡椒醛和胡椒酸；2-黄樟油素图1 混合标样等度洗脱色谱图Fig.1 Chromatograms of mixed standard sample using isocratic elution

改用梯度洗脱程序(表1)，其中流动相为A为乙腈，流动相B为0.1%甲酸水溶液。随着乙腈体积分数的增加，待测物质根据极性强弱顺序出峰，能很好地实现基线分离，分离度好(R>1.5)，并且峰型良好(图 2)。

表1 梯队洗脱程序

1-胡椒酸;2-胡椒醛;3-黄樟油素图2 混合标样梯度洗脱色谱图Fig.2 Chromatograms of mixed standard sample using gradient elution

2.1.3 柱温

分别选取柱温30、35和40 ℃。实验结果表明(图 3)，柱温对待测物质的分离影响较小，虽然随着柱温的上升，待测物质保留时间在提前，但幅度较小，并没有出现峰叠加、峰型过宽等问题。

■-胡椒酸；●-胡椒醛；▲-黄樟油素图3 柱温对胡椒醛、胡椒酸以及黄樟油素保留时间的影响Fig.3 Effect of column temperature on the retention time of piperonal,piperonylic acid and safrole

2.2外标工作曲线和线性范围的确定

将混合标准液在上述得到的色谱条件下进行定量分析，以峰面积外标法定量，得出胡椒醛、胡椒酸以及黄樟油素的标准曲线方程及相关系数(见表2)。其中，3种物质在10～500 mg/L的质量浓度范围内，线性关系良好。

表2 回归方程、线性范围和检测限 (n=5)

注：y：峰面积(mAu*s)；X：质量浓度(g/L)。

2.3溶液稳定性实验

取按1.5.1方法制备的混合样品，稀释至终质量浓度为200 mg/L，分别在室温放置0，3，6，12，24 h后进行考察。供试品室温放置24 h后，胡椒醛、胡椒酸以及黄樟油素的平均RSD分别为0.65%，0.98%，0.77%。表明溶液在制备24 h基本稳定。

2.4重现性实验

取按1.5.1 方法制备的混合样品，平行制备5份供试品溶液，样品溶度为200 mg/L。按照上述色谱条件测定，计算含量。结果表明，胡椒醛、胡椒酸以及黄樟油素的平均含量为199.95，200.51， 200.12mg /L，平均RSD分别为 0.56%，0.68%，0.62%。表明方法重现性良好。

2.5发酵液中胡椒醛、胡椒酸以及异黄樟素的分离检测

按照1.3的方法进行整个发酵过程的操作，取发酵48 h的发酵液5 mL，按1.4的方法进行样品处理，测定胡椒醛、胡椒酸以及异黄樟素的含量，分析谱图见图4。 在S.liquefaciensM2016170发酵液样品中，检测到9.8 mg/L胡椒酸，182 mg/L 胡椒醛以及黄樟油素200 mg/L。

1-胡椒酸;2-胡椒醛;3-黄樟油素图4 发酵液分析谱图Fig.4 HPLC chromatograms of fermentation broth

2.6回收率与精密度实验

在已知含量的发酵样品中添加一定量的胡椒醛、胡椒酸以及黄樟油素标准品，在上述色谱条件下进行测定，并计算此3种物质的加标回收率，结果见表3。

表3 胡椒醛、胡椒酸以及黄樟油素回收率与精密度测定结果 (n=3)

3 结论

本文建立了高效液相色谱法同时检测S.liquefaciensM2016170菌株发酵过程发酵液中的胡椒酸、胡椒醛以及黄樟油素的分析方法，通过分析流动相成分及其配比、柱温以及离子抑制剂实验得出，采用乙腈与0.1%甲酸水溶液作为流动相，按照表1所述的梯度洗脱程序，控制柱温30 ℃的色谱条件，对发酵液中的胡椒酸、胡椒醛以及黄樟油素3种物质进行了有效的分离以及定量检测。该方法具有分离效果好、定性及定量准确、分析时间较短等优点，可以用于生物技术制备胡椒醛。

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Determinationofpiperonal,piperonylicacidandsafroleinfermentationbrothbyhighperformanceliquidchromatography

ZHAO Ming-tao1,ZHENG Pu1*,XING Chen-guang2,LIU Si-qin1,ZHAO Xi-jing2,CHEN Peng-cheng1

1(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China) 2(Laboratory of Biological Engineering,Xiamen Oamic Biotechnology Co.,Ltd.,Xiamen 361000,China)

A high performance liquid chromatography method was developed for the determination of piperonal,piperonylic acid and safrole in fermentation broth.The separation was performed on Amethyst C18-H C18column (250 mm × 4.6 mm，5μm) using gradient elution,the mobile phase A was acetonitrile and B was 0.1% formic acid solution.The column temperature was chosen for 30 ℃ and the detection wave length was 270 nm.It was found that piperonal,piperonylic acid and substrate safrole could be well separated in the conditions,which showed that average recoveries were within the range of 98.0%-101.0%,and the relative standard deviations ranging from 0.5% to 2.0% in samples.This method was also applied for the determination of fermentation broth ofSerratialiquefaciensM2016170,which contained 182 mg/L piperonal and 9.8 mg/L piperonylic acid.

high performance liquid chromatography;piperonal;piperonylic acid;Serratialiquefaciens;fermentation broth

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.12206

硕士研究生(郑璞教授为通讯作者，E-mail: zhengpu@jiangnan.edu.cn)。

2016-06-12，改回日期：2016-08-31