不同醛脱氢酶对重组克雷伯氏菌生产3-羟基丙酸的影响

贾东旭，陈铁男，周佳锋，牛坤，秦海彬，金利群

1(浙江工业大学，浙江省生物有机合成技术研究重点实验室，浙江 杭州，310014) 2(浙江工业大学，生物转化与生物净化教育部工程研究中心，浙江 杭州， 310014)

不同醛脱氢酶对重组克雷伯氏菌生产3-羟基丙酸的影响

贾东旭1,2*，陈铁男1,2，周佳锋1,2，牛坤1,2，秦海彬1,2，金利群1,2

1(浙江工业大学，浙江省生物有机合成技术研究重点实验室，浙江 杭州，310014) 2(浙江工业大学，生物转化与生物净化教育部工程研究中心，浙江 杭州， 310014)

PCR扩增CupriavidusnecatorGabD4和AzospirillumbrasilenseKGSADH醛脱氢酶基因，分别与经改造获得卡那霉素抗性的pUC19质粒(pUC19Kan)连接，再转化至KlebsiellapneumoniaeDSM2026，获得重组菌KpKan/KGSADH和KpKan/GabD4。经摇瓶发酵，KpKan/KGSADH和KpKan/GabD4的最高3-羟基丙酸(3-HP)产量分别为3.66与2.56 g/L，与未导入醛脱氢酶的K.pneumoniae对照菌相比，分别提高了352%与216%。对其他产物的研究表明，2株重组菌的1,3-丙二醇(1,3-PDO)的产量低于对照菌，而2,3-丁二醇(2,3-BD)和乙酸产量高于对照菌。该研究首次将C.necatorGabD4醛脱氢酶基因导入K.pneumoniae，并对比了KpKan/KGSADH与KpKan/GabD4的3-HP产量，实验中确定的性能优良的发酵菌株为继续提高3-HP产量提供了帮助。

克雷伯氏菌；甘油；醛脱氢酶；3-羟基丙酸

3-羟基丙酸(3-hydroxypropionic acid，3-HP)是一种重要的平台化合物，可用于合成1,3-丙二醇(1,3-PDO)、丙烯酸、丙二酸和丙烯酰胺等化合物[1]，已被美国能源部列为当今世界上最具开发潜力的12种化工产品之一[2]。目前，生产3-HP的方法主要是化学合成法，随着生物柴油产业的兴起，每生产10 t生物柴油就会得到1 t副产物甘油[3]，合理利用甘油通过微生物发酵生产3-HP可以有效缓解甘油过剩的压力。

除了甘油[4]，生物法合成3-HP所用底物还有葡萄糖[5]，但其转化过程繁琐。相比之下，甘油转化过程只需通过甘油脱水酶(DhaB)与醛脱氢酶(AldH)2步反应即可生成产物3-HP(图1)。可见，甘油是发酵法生产3-HP的首选底物。常用的3-HP发酵系统包括E.coli和K.pneumoniae。在3-HP的合成途径中，DhaB须有辅酶维生素B12参与才能表现出活力并将甘油转化为3-羟基丙醛(3-HPA)。E.coli系统自身无法合成维生素B12，需要在发酵的过程中人为添加，这样会使3-HP的生产成本大幅提高。与之相比，K.pneumoniae存在着完整的维生素B12合成体系，并能够高效利用甘油，甘油同化率高[6]，是3-HP的理想生产菌。但K.pneumoniae自身体系的醛脱氢酶活性低，需要导入异源醛脱氢酶至K.pneumoniae提高酶活，才能实现3-HP的合成。

图1 K. pneumoniae利用甘油的部分代谢路径Fig.1 The partial glycerolmetabolic pathway in K. pneumoniae

近年来，出现了很多宿主菌表达DhaB和搭配不同AldH利用甘油发酵生产3-HP的报道。KO等[7]将AldH导入E.coli，发酵的3-HP产量达31 g/L。RATHNASINGH等[8]使用E.coli表达KGSADH得到38.7 g/L的3-HP。ASHOK等[9]利用宿主K.pneumoniae表达PuuC，并敲除1,3-PDO途径关键酶，使产量达28.1 g/L。CHU等指出来自Cupriavidusnecator中的succinate-semialdehyde dehydrogenase GabD4是目前活力最高的AldH[10]，本实验室测得GabD4的Km、Vmax分别为6.86 mmol/L和20.6 μmol/(min·mg protein)[11]，运用该酶的改造、导入与基因敲除技术，在E.coli中生产3-HP的产量高达71.9 g/L[10]。另外，田平芳等[12]在K.pneumoniae表达PuuC的基础上，敲除了调控乳酸和乙酸代谢途径的关键酶，使3-HP产量到达了目前最高的83.8 μg/L。

本研究选择文献报道活性最高的醛脱氢酶CupriavidusnecatorGabD4，首次将其克隆至pUC19质粒并电转化K.pneumoniaeDSM2026，并与导入高效醛脱氢酶AzospirillumbrasilenseKGSADH[7]的K.pneumoniae进行发酵对比，考察3-HP和其他产物的变化情况，所确定发酵性能优良的菌株为进一步提高3-HP产量提供可能性。

1 材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1 菌体与质粒

连接在pET28b上的醛脱氢酶C.necatorGabD4和A.brasilenseKGSADH基因、质粒pKD13、带有酶切位点XhoⅠ和SpeⅠ的质粒pUC19Mut、宿主菌E.coliJM109均由本实验室保存。肺炎克雷伯杆菌K.pneumoniaeDSM2026由韩国Park团队馈赠。

1.1.2 试剂

氨苄霉素(Ampicillin，Amp)和卡那霉素(Kanamycin，Kan)购于生工生物工程(上海)股份有限公司；BamhⅠ、PstⅠ、XhoⅠ，SpeⅠ等限制性内切酶购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司；T4DNA连接酶与TaqDNA聚合酶购自Thermo生物公司；Ligation high Ver.2 DNA连接酶购自东洋纺(上海)生物科技有限公司；DNA marker和Loading Buffer等购于南京诺唯赞生物科技有限公司；引物合成和测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)购于北京经科宏达生物有限公司上海分公司；二硫苏糖醇(Dithiothreito，DTT)、1,3-PDO、3-HP等购于北京百灵威科技有限公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 所用引物

本研究进行PCR扩增时所用引物如表1所示。

表1 PCR中所用到的引物

注：引物序列中的下划线为限制性酶切位点，已在序列后的括号中标明。

1.1.4 培养基配方

种子(LB)培养基(g/L)：蛋白胨 10、酵母粉 5、NaCl 10，固体培养基需添加20 g/t琼脂粉。

发酵培养基(g/L)：参照实验室[13]的培养基配方并做修改。具体为：甘油 30、酵母膏4、(NH4)2SO43.2、NaCl 1、MgSO4·7H2O 0.25、Na2HPO4·12H2O 22.7、KH2PO43、FeSO4·7H2O 0.001、CaCl20.004、微量元素溶液2 mL/L。

微量元素溶液(g/L)：ZnCl20.07、CuCl2·2H2O 0.02、MnCl2·4H2O 0.1、NiCl2·6H2O 0.025、H3BO30.06、Na2MO4·2H2O 0.035、CoCl2·2H2O 0.2。

1.2实验方法

1.2.1 分子生物学操作

提取质粒参照AxyPrep质粒小量提取试剂盒(康宁生命科学吴江有限公司)说明书；其他参见《实用生物化学与分子生物学实验技术》[14]。

1.2.2 重组质粒的构建

(1)构建质粒pUC19Kan

以pKD13为模板，使用引物1和2(表1)扩增Kan抗性基因，所用酶为Taq DNA聚合酶。反应条件：95 ℃ 5 min，(95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min)30循环，72 ℃ 10 min。回收DNA片段与pGEM-T载体连接得到pGEM-T/Kan，并与pUC19Mut同时进行XhoⅠ、SpeⅠ双酶切，连接得到重组质粒pUC19Kan。

(2)构建表达质粒pUC19Kan/KGSADH和pUC19Kan/GabD4

分别以pET28b/KGSADH和pET28b/GabD4为模板，使用引物3和4扩增KGSADH基因，使用引物5和6扩增GabD4基因。反应条件：95 ℃ 5min，(95 ℃ 15 s，60 ℃ 15s，72 ℃ 2 min)30循环，72 ℃ 10 min。回收DNA片段分别与pGEM-T载体连接，获得重组质粒再分别与pUC19Kan同时进行PstⅠ、BamhⅠ双酶切并连接，得到重组质粒pUC19Kan/KGSADH和pUC19Kan/GabD4。

1.2.3 制备K.pneumoniaeDSM2026感受态与电转化

将甘油管保藏的K.pneumoniaeDSM2026划线于LB平板，37 ℃培养过夜；挑取单菌落至装有4 mL LB液体培养基的试管中，37 ℃、150 r/min培养12h；按1%(v/v)接种量转接于40 mL LB发酵培养基，培养至OD6000.4～0.6，冰浴培养物30 min，于4 ℃、7 000 r/min离心收集菌体。用30 mL灭菌超纯水洗涤菌体，用100 μL无菌水重悬，并转移至冰浴的1.5 mL的EP管中待用。

将上述感受态细胞分装至预冷的电转杯(间距0.2 cm)，同时加入1 μL预冷的质粒，按条件(10 kV/cm、5 ms)电转化；随后加入600 μL预冷的LB液体培养基，于37 ℃培养2 h，涂布至含50 μg/mL Kan的LB固体培养基，于37 ℃培养12 h。

1.2.4K.pneumoniae重组菌摇瓶发酵

以1%(v/v)接菌量将重组菌接种于含50 μg/mL Kan的50 mL LB液体培养基中，37 ℃、150r/min、培养12 h；再以2%(v/v)接种量转接至含50 μg/mL Kan的100 mL发酵培养基，37 ℃、150 r/min、连续发酵64 h，定时取样检测相关产物。

1.2.5 醛脱氢酶活力检测

参照前期研究[11]，体系包括：2 mmol/L乙醛、2 mmol/L NAD+、1 mmol/L DTT和适量的酶液，用100 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH 8.0)将体系补至1 mL。使用SpectraMax M5酶标仪在340 nm处，37 ℃条件下测定吸光值变化。酶活定义：1 min生成1 μmol NADH [ε340=6.22×103(mol/L)-1·cm-1]所需的酶量定义为1个活力单位(U)。

1.2.6 产物与分析

采用Waters1515高效液相色谱(美国)测定3-HP、乙酸、1,3-PDO和2,3-BD等发酵代谢物。色谱柱Amines HPX-87H(Bio-Rad，美国)，柱温65 ℃，流动相5 mmol/L H2SO4，流速为0.6 mL/min。使用示差折光及紫外检测器，绘制样品的标准曲线并定量检测样品。

2 结果与分析

2.1质粒pUC19Kan的构建与验证

本研究的出发质粒pUC19Mut见图2，将醛脱氢酶基因导入多克隆位点(multiple clone site，MCS)，再将质粒转化至宿主菌K.pneumoniaeDSM2026便能实现外源基因的表达。但是，宿主菌K.pneumoniaeDSM2026和pUC19Mut自身均携带Amp抗性，导致无法用该抗性筛选阳性转化子。因此，为了让重组转化子获得新的抗性，本研究将pUC19Mut的Amp抗性替换为Kan抗性，改造的新质粒pUC19Kan如图2所示。

图2 重组质粒pUC19Kan/KGSADH和pUC19Kan/GabD4的简要构建过程Fig.2 Brief construction process of plasmid pUC19Kan/KGSADH and pUC19Kan/GabD4

以质粒pKD13为模板，PCR扩增Kan目的基因，结果见图3(泳道1)，扩增条带的大小与Kan理论值(约1 162 bp)基本相符。将扩增片段与pGEM-T载体连接后测序，将测序正确的Kan片断与pUC19Mut同时进行XhoⅠ和SpeⅠ双酶切并连接，获得质粒pUC19Kan。为验证质粒是否构建成功，将质粒pUC19Kan再用XhoⅠ和SpeⅠ进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳结果见图3(泳道2)。经XhoⅠ和SpeⅠ双酶切，pUC19Kan出现2条特异条带，其大小分别位于1 500～2 000 bp和1 000～1 500 bp，不含抗性基因的pUC19Mut和Kan基因正好位于该大小区间，说明重组质粒pUC19Kan构建成功。

M-蛋白分子量标准；1-PCR扩增Kan基因；2-pUC19Kan双酶切图3 PCR扩增Kan抗性基因和重组质粒的双酶切Fig.3 PCR amplification of Kan gene and double enzymatic digestion of pUC19Kan

2.2重组质粒pUC19Kan/KGSADH和pUC19Kan/GabD4的构建与验证

以pET28b/GabD4质粒为模板，PCR扩增目的基因GabD4，结果见图4(泳道1)，扩增条带大小与GabD4的理论值(约1428 bp)基本相符。

M-蛋白分子量标准；1-PCR扩增GabD4；2-PCR扩增KGSADH；3-pUC19Kan/GabD4双酶切；4-pUC19Kan/KGSADH双酶切图4 PCR扩增醛脱氢酶基因和重组质粒的双酶切Fig.4 PCR amplification of two aldehyde dehydrogenase genes and double enzymatic digestion of two recombinant plasmids

将片段与pGEM-T载体连接并测序，将测序正确的GabD4片断与pUC19Kan同时进行PstⅠ和BamhⅠ双酶切并连接。为验证构建情况，将质粒pUC19Kan/GabD4以PstⅠ、BamhⅠ进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳结果见图4(泳道3)。如图4所示，酶切获得的酶基因片段为1 000～1 500 bp，载体片段约为3 000 bp，与GabD4和pUC19Kan实际大小基本相符，说明重组质粒pUC19Kan/GabD4构建成功。另一个醛脱氢酶KGSADH的基因长度为1 446 bp，按照同样克隆过程，经基因测序和琼脂糖凝胶电泳分析(图4、泳道2和4)，结果表明重组质粒pUC19Kan/KGSADH构建成功。

2.3电转化K.pneumoniae与筛选转化子

通过1.2.3的电转化方法，将重组质粒pUC19Kan/GabD4、pUC19Kan/KGSADH和pUC19Kan分别转化至K.pneumoniaeDSM2026。将各转化子接种于50 μg/mL Kan的LB固体培养基，37 ℃过夜培养。虽然K.pneumoniaeDSM2026无Kan抗性，但导入的重组质粒pUC19Kan/GabD4、pUC19Kan/KGSADH和pUC19Kan能够赋予重组菌抵抗Kan的能力，阳性转化子可生长于含Kan的LB固体培养基，随机挑选各阳性菌株并分别命名为KpKan/KGSADH、KpKan/GabD4和KpKan。

2.4K.pneumoniae重组菌发酵与醛脱氢酶活性测定

分别将重组菌KpKan/KGSADH、KpKan/GabD4和KpKan接种至发酵培养基，于37 ℃发酵12 h，收集菌体破壁后进行醛脱氢酶活力检测。对照菌KpKan的醛脱氢酶活力为1.05 U/mL，说明对照菌自身存在一定数量的醛脱氢酶；重组菌KpKan/KGSADH与KpKan/GabD4的醛脱氢酶活力分别为2.24和1.56 U/mL，与KpKan相比分别提高113%与48.6%。该结果说明导入KGSADH和GabD4后，K.pneumoniae表达的醛脱氢酶活力得以提高，其中KpKan/KGSADH的酶活提高更为明显。PARK团队于2012年的研究表明,野生型K.pneumoniae中的醛脱氢酶酶活较难测得，而导入外源基因PuuC与EaldH，2重组菌的酶活分别提高至4与1.8 U/mg，证明了外源基因的导入会使醛脱氢酶的酶活得到提高[7]。本研究结果与PARK团队的研究结果一致。

2.5摇瓶发酵过程中甘油的消耗

甘油作为碳源，是组成培养基的主要成分，为细胞的生长提供必需的能量[15]。K.pneumoniae作为一种革兰氏阴性菌，具备较为完整的甘油代谢系统，不仅可在有氧和无氧的环境下快速利用甘油，还能高效生产酸和醇，如3-HP、1,3-PDO、2,3-BD和乙酸等[16]。KpKan/KGSADH、KpKan/GabD4和KpKan发酵过程中的甘油消耗见图5。培养基中甘油的初始质量浓度均为30 g/L，当发酵至16 h，KpKan的甘油消耗速率最快，仅剩0.75 g/L；KpKan/KGSADH和KpKan/GabD4的甘油剩余量分别为4.45和10.44 g/L，明显高于KpKan。当发酵至24 h，KpKan/KGSADH和KpKan/GabD4的甘油量降至低于4 g/L的水平。以上结果表明发酵24 h，3者的甘油已基本消耗殆尽。李清等[17]发现间歇性补加甘油，使其浓度保持在20～30 g/L，发酵26 h的3-HP产量为47.2 g/L，甘油转化率0.35 mol/mol。对于本研究，今后可以通过恒定底物甘油浓度来进一步提高3-HP产量。

图5 摇瓶发酵过程中甘油的消耗Fig.5 The glycerol consumption of three strains during shake-flask fermentation process

2.6摇瓶发酵过程中3-HP和1,3-PDO的变化

3-HP产量的高低决定重组菌株的应用前景，KpKan/KGSADH、KpKan/GabD4和KpKan的摇瓶发酵过程的3-HP产量见图6(a)。发酵至64 h，对照菌株KpKan的3-HP产量缓慢增加至0.81 g/L。KpKan/KGSADH和KpKan/GabD4的3-HP产量呈现明显提高之势，终产量为3.66与2.56 g/L，比KpKan分别提高352%与216%。在2.4中已证实，KpKan/KGSADH的醛脱氢酶活比KpKan/GabD4酶活高43.6%，较高的酶活力可能使KpKan/KGSADH催化中间物的能力变强[18]，从而提高3-HP产量。张晓梅[19]等详细优化了甘油浓度对E.coliJM109生产3-HP的影响，当甘油浓度为40 g/L，3-HP产量最高为3.37 g/L。KO[7]等将EaldH、PuuC和KGSADH分别导入DhaT缺陷型、YqhD缺陷型和野生型K.pneumoniae宿主菌，通过摇瓶发酵，发现K.pneumoniaeΔdhaT/KGSADH的产量最高为5.8 g/L。KpKan/KGSADH在没有进行发酵条件优化和基因敲除的情况下，已经取得可观的3-HP产量，说明该菌已经展示出重要的工业应用前景。

如图1所示，在甘油的还原途径中，甘油通过DhaB的催化作用生成3-HPA，再在一系列1,3-PDO氧化还原酶的作用下转化为1,3-PDO[20]。做为甘油还原途径的代谢产物，1,3-PDO与3-HP有着共同的前体物质3-HPA，2者在碳流的利用上存在竞争，因此，1,3-PDO是K.pneumoniae发酵的重要考察指标。KUMAR等将含有KGSADH的K.pneumoniaeJ2B静息细胞转移至含有甘油与酵母膏的培养基中，在通气量较低的情况下联产1,3-PDO与3-HP，最终产物分别为15.2 g/L与11.3 g/L[21]。本研究摇瓶发酵产1,3-PDO的结果如图6(b)所示。发酵0～18 h，KpKan/KGSADH、KpKan/GabD4和KpKan的1,3-PDO产量迅速升高，并在发酵18 h达到2.35、2.89和3.31 g/L的最高值。值得注意的是，KpKan/KGSADH和KpKan/GabD4在发酵各阶段的1,3-PDO产量均低于KpKan，原因可能是外源醛脱氢酶与1,3-PDO氧化还原酶存在竞争，将3-HPA更多流向合成3-HP方向，导致1,3-PDO的产量降低。

图6 摇瓶发酵过程中3-HP产量Fig.6 The production of 3-HP and 1,3-PDO of three strains during shake-flask fermentation process

2.7摇瓶发酵过程中2,3-BD和乙酸的变化

重组菌代谢生成副产物会竞争性消耗碳流。在K.pneumoniae的氧化途径中，甘油进入TCA循环并转化为丙酮酸，丙酮酸可以在不同的酶催化下转变为2,3-BD和乙酸等副产物[18]。对于本研究，发酵过程中副产物2,3-BD的变化如图7(a)所示。当发酵32 h，KpKan/KGSADH的2,3-BD产量升高至4.26 g/L，随后一直维持该水平。KpKan/GabD4和KpKan分别在发酵16和8 h，达到2.51和4.12g/L最高产量，之后产量逐渐下降，最终只有1.51和1.18 g/L。发酵过程中乙酸产量如图7(b)所示。KpKan在发酵过程中一直不产乙酸；KpKan/GabD4发酵32 h，乙酸达到最高值2.32 g/L，随后下降；相比之下，KpKan/KGSADH的乙酸产量一直上升，48 h稳定在2.37 g/L左右。上述结果说明发酵中，KpKan/GabD4与KpKan/KGSADH的2,3-BD和乙酸产量均高于KpKan。原因可能是在K.pneumoniae的代谢途径中，KpKan/GabD4与KpKan/KGSADH高醛脱氢酶活力导致3-HP大量生成，同时将NAD+转化为NADH，菌体为了维持体系内的NADH/NAD+平衡，消耗部分NADH用于合成2,3-BD、乙酸等副产物。

图6 发酵过程中2,3-BD与乙酸的产量Fig.6 The production of 2,3-BD and acetic acid during shake-flask fermentation process

3 结论

本研究通过分子生物学手段，将C.necatorGabD4和A.brasilenseKGSADH醛脱氢酶分别导入K.pneumoniaeDSM2026，经摇瓶发酵，测得醛脱氢酶活力分别为2.24和1.56U/mL。发酵过程中，KpKan/KGSADH和KpKan/GabD4的3-HP最高产量分别为3.66与2.56 g/L，说明KpKan/KGSADH产3-HP的能力优于KpKan/GabD4。动态分析KpKan、KpKan/KGSADH和KpKan/GabD4副产物变化，发现2重组菌1,3-PDO产量低于KpKan，2,3-BD和乙酸的产量高于KpKan。本研究首次将C.necatorGabD4表达于K.pneumoniae，用于生产3-HP，获得的结果有助于筛选性能最佳的发酵菌株，通过发酵工程和代谢工程等后续操作，进一步提高3-HP产量。

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Effectofdifferentaldehydedehydrogenasesonproductionof3-hydroxypropionicacidbyrecombinantKlebsiellapneumoniaestrains

JIA Dong-xu1,2*, CHEN Tie-nan1,2, ZHOU Jia-feng1,2,NIU Kun1,2,QIN Hai-bin1,2, JIN Li-qun1,2

1 (Key Laboratory of Bioorganic Synthesis of Zhejiang Province, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China) 2 (Engineering Research Center of Bioconversion and Biopurification of the Ministry of Education, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

In this experiment,CupriavidusnecatorGabD4 andAzospirillumbrasilenseKGSADH aldehyde dehydrogenase genes were cloned by polymerase chain reaction (PCR), and the resulting PCR products were ligated to plasmid pUC19Kan whose ampicillin resistance had been modified to kanamycin resistance. Then, the recombinant plasmids were transformed intoKlebsiellapneumoniaeDSM2026, and designated KpKan/KGSADHand KpKan/GabD4. Through shake-flask fermentation, their maximum 3-hydroxy propionic acid (3-HP) yield reached 3.66 and 2.56 g/L respectively, which was 352% and 216% higher than that of the control strain. In addition, analysis of other products showed that 1,3-propylene glycol (1,3-PDO) contents in both recombinant strains were lower whereas 2,3-butylene glycol(2,3-BD) and acetic acid contents were higher than those of the control strain. This is the first report regarding the introduction ofC.necatorGabD4 aldehyde dehydrogenase intoK.pneumoniaeand comparing the 3-HP yield between KpKan/KGSADHand KpKan/GabD4, the obtained results are great interest for further improvement of 3-HP production.

Klebsiellapneumoniae; glycerol; aldehyde dehydrogenase; 3-hydroxypropionic acid

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014580

博士,副教授(本文通讯作者,E-mail:jiadongxu@zjut.edu.cn)。

国家自然科学基金(21306173)；浙江省自然科学基金青年基金(LQ15C010001)

2017-04-19，改回日期：2017-05-05