磷酸转移酶系统关键基因敲除对Klebsiellapneumoniae产1,3-丙二醇的影响

陆竞争，任顺利，诸葛斌*，陆信曜，宗红，方慧英，宋健

1(江南大学，糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡，214122) 2(江南大学，工业生物技术教育部重点实验室，工业微生物研究中心，江苏 无锡，214122) 3(江南大学，化学与材料工程学院，江苏 无锡，214122)

磷酸转移酶系统关键基因敲除对Klebsiellapneumoniae产1,3-丙二醇的影响

陆竞争1,2，任顺利1,2，诸葛斌1,2*，陆信曜1,2，宗红1,2，方慧英1,2，宋健3

1(江南大学，糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡，214122) 2(江南大学，工业生物技术教育部重点实验室，工业微生物研究中心，江苏 无锡，214122) 3(江南大学，化学与材料工程学院，江苏 无锡，214122)

克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)在以葡萄糖作辅底物发酵甘油生产1,3-丙二醇(1,3-propanediol, 1,3-PDO)过程中，由于细胞存在碳分解代谢抑制现象，葡萄糖优先于甘油被菌体吸收代谢用于细胞生长及副产物的累积，影响1,3-PDO的合成。基于K.pneumoniae葡萄糖转运及碳代谢调控相关的磷酸转移酶系统(phosphotransferase system, PTS)，利用Red重组技术对PTS系统中与葡萄糖特异性转运相关的基因ptsG(编码葡萄糖特异性转运膜透性酶EⅡBCGlc)、crr(编码胞浆可溶性葡萄糖特异性转运酶EⅡAGlc)分别进行敲除，并考察上述基因缺失对细胞生长、1,3-PDO合成和副产物代谢的影响。结果显示，敲除ptsG、crr基因后，甘油转化率较野生菌分别提高26.2%和42.7%，其中突变株K.pneumoniaeΔcrr的1,3-PDO的产量达到23.1 g/L，提高35.8%。上述结果表明，敲除ptsG、crr基因改造PTS系统能够有效提高底物甘油利用率，强化1,3-PDO合成。

crr；ptsG；磷酸转移酶系统；克雷伯氏菌；1,3-丙二醇

1,3-丙二醇(1,3-propanediol，1,3-PDO)作为一种重要的化工原料，应用于聚合物、医药和化妆品等行业，特别是作为新型聚酯类纤维聚对苯二甲酸丙二醇酯(polytrimethylene terephthalate，PTT)单体越来越受关注[1-2]。在已有的1,3-PDO合成菌株中，克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)因能高效生产1,3-PDO被广泛研究[3]。但在以葡萄糖作辅底物发酵甘油生产1,3-PDO过程中，K.pneumoniae优先代谢葡萄糖用于菌体生长，同时阻遏抑制甘油代谢，不利于1,3-PDO的合成[4]。

磷酸转移酶系统(phosphotransferase system，PTS)作为葡萄糖主要转运系统，由EⅠ(ptsH编码)、HPr(ptsI编码)、EⅡAGlc(crr编码)，以及EⅡBCGlc(ptsG编码)构成[4]。如图1，EI与磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpyruvate，PEP)反应获得磷酸基团，并将其加载到HPr上，继而磷酸基团传递至EⅡAGlc、EⅡBCGlc，接着EⅡBCGlc将周质空间内的葡萄糖转运至胞内并磷酸化，磷酸化葡萄糖进而进入分解代谢途径。其中EⅡAGlc和EⅡBCGlc不仅参与葡萄糖的特异性转运，还具有碳分解代谢抑制调控作用。

图1 K. pneumoniae葡萄糖磷酸转移酶系统Fig.1 Glucose-specific phosphotransferase system of K. pneumoniae

研究表明，敲除ptsG、crr基因有助于弱化葡萄糖的转运、碳分解代谢抑制作用，从而有效实现混合碳源共底物发酵[5-6]。但目前对于K.pneumoniaePTS系统的碳代谢调控与细胞生长、1,3-PDO的合成及相关副产物代谢之间的关系尚未报道。基于此，本文通过敲除K.pneumoniae的ptsG、crr基因，分析PTS系统基因缺失对细胞生长、1,3-PDO合成的影响，对K.pneumoniae以葡萄糖作辅底物发酵甘油生产1,3-PDO的研究具有指导意义。

1 材料与方法

1.1菌株与质粒

本研究用到的菌株和质粒见表1。

表1 本文使用的菌株和质粒

1.2培养基与培养方法

种子培养基(g/L)：酵母粉 5，胰蛋白胨 10，NaCl 10。发酵培养基(g/L)：甘油 40，葡萄糖12，酵母粉 6，KH2PO47.5，MgSO42，(NH4)2SO42，FeSO40.005，VB120.015，微量元素溶液10 mL，KOH调pH至8.0。微量元素溶液(g/L)：ZnCl20.07，MnCl2·4H2O 0.1，H3BO30.06，CoCl2·6H2O 0.2，CuCl20.02，NiCl2·6H2O 0.025，Na2MoO4·2H2O 0.035。种子培养：1%接种量(体积比)，37 ℃、150 r/min，培养8～10 h。发酵培养：250 mL三角瓶50 mL装液量，4%接种量(体积比)，37 ℃、150 r/min，培养48 h。所有培养基在1×105Pa灭菌15 min。

1.3主要试剂和仪器

氯霉素、硫酸卡那霉素、阿拉伯糖，生工生物工程(上海)股份有限公司；DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒，上海捷瑞生物工程有限公司；Taq DNA聚合酶购自大连宝生物有限公司；液相色谱柱：Aminex HPX-87H column(300 mm×7.8 mm；9 μm)，BioRad公司；PCR仪、电转仪，Eppendorf公司；引物由苏州泓迅生物科技有限公司合成；1,3-PDO标准品，Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.4引物设计

采用Primer软件，根据NCBI已报道的K.pneumoniae中ptsG、crr基因序列(Gen Bank Accession No.NC_011283.1)设计引物见表2。

表2 基因敲除使用的引物

注：下划线部分为敲除基因的同源臂序列。

1.5缺失菌株的构建

基因敲除过程按照文献报道进行[7]。将含氯霉素抗性的pKD46_Cm质粒转入K.pneumoniae，转接至液体LB培养基(含氯霉素)，加入阿拉伯糖诱导后制备K.pneumonia敲除电转感受态。以pKD13作模板进行PCR反应获得crr、ptsG基因敲除盒，回收并电转至K.pneumoniae感受态，涂布于含有卡那霉素的LB平板筛选，PCR鉴定获得阳性克隆。导入pCP20质粒诱导表达FLP重组酶消除上述引入的抗性标记基因。

1.6测定方法

生物量用600 nm处光吸收值测定。以发酵培养基为空白对照，然后将发酵液于8 000 r/min离心5 min，并收集菌体，生理盐水洗涤3次后，将收集的菌体置于105 ℃烘箱中干燥至恒重后称重，根据实验计算得出细胞干重公式：1 OD600= 0.36 g/L。样品中葡萄糖含量用SBA-40C双通道生物传感分析仪进行测定，具体测定方法参考仪器使用说明书。1,3-PDO及其他代谢产物产量用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)测定，检测条件为：Amines HPX-87H (Bio-Rad) (300 mm × 7.8 mm，9 μm)液相色谱柱，使用示差折光及紫外检测器，流动相：5 mmol/L KH2PO4，流速0.6 mL/min，柱温60 ℃，进样量10 μL。

2 结果与分析

2.1PTS系统关键基因敲除

利用Red重组技术敲除K.pneumoniaePTS系统关键基因ptsG、crr。如图2，野生菌ptsG、crr基因验证条带大小分别为1 523和1 054 bp。而缺失菌中对应验证条带大小分别为762和645 bp，条带大小与预期结果相符，说明基因敲除成功，得到突变株K.pneumoniaΔptsG、K.pneumoniaΔcrr。

M-DL2503 Marker；1-野生菌；2-ptsG敲除菌；3-野生菌；4-crr敲除菌图2 ptsG基因(A)和crr基因(B)敲除的PCR验证Fig.2 PCR verifications of ptsG (A) and crr(B) gene knockout mutants

2.2突变株生长性能分析

以6 g/L葡萄糖为底物，与野生菌相比，crr突变株生物量减半、1,3-PDO产量下降；而ptsG突变株则基本无法生长(数据未列出)。为进一步提高产物积累量，对糖浓度进行优化，发现添加12 g/L葡萄糖最利于K.pneumoniaΔcrr和K.pneumoniaΔptsG合成1,3-PDO。此时，K.pneumoniaΔcrr和K.pneumoniaΔptsG的生物量分别为野生菌的62.7%和23.6%(图3)。可见高糖浓度能够改善细胞生长并部分回补基因缺失对生物量的影响。上述结果表明,crr和ptsG基因敲除弱化了PTS系统功能，限制了葡萄糖向胞内的转运，使得细胞生物量显著降低。已有研究发现，虽然敲除ptsG基因可以提高胞内cAMP水平，促进cAMP-CRP依赖的碳分解代谢过程的相关基因的表达，但ptsG编码的EⅡBCGlc对GalP和ManXYZ等其他糖转运系统的合成具有正调控作用[8]。因此，敲除ptsG将严重影响糖转运，导致菌体生长显著下降。而crr基因编码的EⅡAGlc的高表达则会抑制甘油转运、代谢相关基因表达[9]。因此，crr基因敲除可以缓解甘油代谢的抑制作用，同时还可提高胞内cAMP水平、激活cAMP-CRP依赖型碳分解代谢过程相关基因的表达[10]，从而使得K.pneumoniaΔcrr具有较高的生物量。另一方面，较高的糖浓度可能激活了GalP和MglBAC等其他葡萄糖转运系统，使得基因缺失对生物量的影响在12 g/L糖质量浓度下出现一定的回补[11]。

图3 K. pneumoniae及突变株发酵甘油产1,3-PDO的生物量Fig.3 The biomass of K. pneumoniae and mutants (K. pneumoniae ΔptsG, K. pneumoniae Δcrr) in glycerol fermentation for 1,3-propanediol production

2.3突变株代谢分析

如图4A，发酵前4 h野生菌葡萄糖基本耗完，菌体快速生长。而ptsG、crr突变株由于葡萄糖转运受损，糖耗速率明显下降。其中，crr突变株的葡萄糖16 h基本耗完；而ptsG突变株由于葡萄糖转运能力严重受损，至发酵结束仅消耗一半葡萄糖，使得菌体生物量较其他菌株减少。上述结果表明，敲除ptsG、crr基因弱化了葡萄糖转运，限制了细胞对葡萄糖的消耗。

基因敲除弱化了菌株生长，使得突变株的甘油消耗速率在发酵前期均低于野生菌(图4-B)。其中，K.pneumoniaΔptsG耗甘油量减少34.2%；而crr缺失菌在前期甘油代谢能力稍弱，但耗甘油总量与野生菌相似，表明crr敲除有利于甘油代谢。此外，由于PTS系统关键基因敲除弱化了糖转运和代谢，细胞可能通过强化甘油歧化途径进行代偿，从而使得两株缺失菌的单位菌体耗甘油量分别提高76%和31.6%，进一步表明ptsG、crr敲除使得细胞甘油代谢能力提高。此外，由于生长严重受限，突变株K.pneumoniaΔptsG1,3-PDO产量降低32.7%。相比之下，突变株K.pneumoniaΔcrr1,3-PDO产量达到23.1 g/L，提高35.8%，表明crr敲除有利于产物积累。此外，2株缺失菌的单位菌体产量均提高约80%。另一方面，ptsG和crr突变株的甘油转化率分别提高26.2%和42.7%，表明ptsG、crr敲除使得胞内甘油碳流向1,3-PDO合成途径偏转。

2,3-丁二醇(2,3-Butanediol，BDO)作为主要的副产物之一，在1,3-PDO发酵生产过程中用于维持胞内氧化还原势平衡，防止培养基酸化[12]。发酵前期，葡萄糖代谢旺盛，产生大量的丙酮酸、还原力，促进BDO的累积。crr、ptsG基因敲除之后，葡萄糖转运能力下降，致使菌体糖耗受限，影响葡萄糖代谢，BDO积累较野生菌下降。其中，crr敲除菌BDO产量减少25.7%，ptsG敲除菌BDO基本检测不到(图4-C)，表明crr、ptsG基因敲除可以有效减少BDO累积，致使更多碳流转向1,3-PDO的合成[13]。在发酵后期，由于BudC催化BDO发生可逆反应，BDO浓度下降，碳源重新进入糖酵解途径，并产生还原力[14]，进一步驱动发酵后期1,3-PDO的积累。

如图4-D，由于ptsG、crr基因敲除影响PTS系统的碳源转运能力，部分碳源由非PTS系统转运至胞内，通过ATP磷酸化激活进入代谢途径，加大了细胞对能量的需求[15-16]，中间代谢物可能经乙酸合成途径生成乙酸产生ATP以补偿细胞能量需求，导致单位菌体乙酸产量有所提高。但由于生物量下降，乙酸终产量分别减少39.7%、18.2%，表明敲除ptsG、crr基因弱化乙酸积累。

图4 K. pneumoniae及突变株发酵甘油产1,3-PDO发酵过程中(A)剩余葡萄糖、(B)1,3-丙二醇、剩余甘油、(C)2,3-丁二醇、(D)乙酸Fig.4 (A) Residual glucose,(B) 1,3-PDO, residual glycerol, (C) 2,3-BDO, (D) Acetatein fermentation of K. pneumoniaeand mutants that produced 1,3-propanediol from glycerol

3 结论

本研究对K.pneumoniaePTS系统中与葡萄糖特异性转运相关的ptsG、crr基因分别进行敲除，并考察了细胞生长、1,3-PDO的合成及副产物代谢的变化。结果表明，基因敲除能够改善底物代谢能力，提高甘油转化率。其中，crr基因敲除对生物量影响相对较弱，1,3-PDO产量提高35.8%，甘油转化率提高42.7%，同时减少了BDO、乙酸等副产物积累。综上可知，敲除PTS系统中与葡萄糖特异性转运相关基因可以有效改善底物代谢能力，减少副产物积累，促进1,3-PDO的合成，为后续进一步改造提高甘油发酵合成1,3-PDO提供思路和借鉴。

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Theeffectsofknockingoutkeygenesinphosphotransferasesystemon1,3-propanediolproductionofKlebsiellapneumoniae

LU Jing-zheng1,2, REN Shun-li1,2,ZHUGEBin1,2*,LU Xin-yao1,2,ZONG Hong1,2,FANG Hui-ying1,2,SONG Jian3

1(The Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, China) 2(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, School of Biotechnology,Research Centre of Industrial Microbiology, Wuxi 214122, China) 3(School of Chemistry and Material, Jiangnan University,Wuxi 214122, China)

During production of 1,3-propanediol from glycerol byKlebsiellapneumoniaewith glucose as co-substrate, glucose has the priority of being used for accumulated biomass and byproducts due to the carbon catabolism repression (CCR), which results in an obstacle on 1,3-propanediol production. Based on the phosphotransferase system (PTS) involved in glucose specific transferance and corresponding carbon metabolic regulation,ptsGgene encoding EⅡBCGlcandcrrgene encoding EⅡAGlcwere respectively knocked out by Red disruption system in this study. The effects ofptsG,crr-deficient PTS on cell growth, 1,3-propanediol production, and byproducts accumulation were examined. It was observed that after knocking outptsGandcrrgenes, the yields of glycerol increased by 26.2%, 42.7% compared with the parent strains, respectively. A yield of 23.1 g/L 1,3-propanediol byK.pneumoniaeΔcrrwas achieved with increase of 35.8%. The results above demonstrated that modification of PTS by disruption ofptsGandcrrgenes could improve the yield of glycerol and enhance the 1,3-propanediol production.

crr;ptsG; phosphotransferase system (PTS);Klebsiellapneumoniae; 1,3-propanediol

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013991

硕士研究生(诸葛斌教授为通讯作者,E-mail:bzhuge@163.com)。

2017-02-06，改回日期：2017-03-14