过渡金属铜修饰的仲钨酸盐抑制 人卵巢癌细胞增殖的研究

张 静，曲小姝，刘树萍，杨艳艳

(1.海军92538部队医院，大连 辽宁116000； 2.吉林化工学院化学与制药工程学院，吉林 吉林132022； 3.哈尔滨商业大学旅游与烹饪学院，黑龙江 哈尔滨150076)

过渡金属铜修饰的仲钨酸盐抑制 人卵巢癌细胞增殖的研究

张 静1，曲小姝2，刘树萍3，杨艳艳2

(1.海军92538部队医院，大连 辽宁116000； 2.吉林化工学院化学与制药工程学院，吉林 吉林132022； 3.哈尔滨商业大学旅游与烹饪学院，黑龙江 哈尔滨150076)

研究了过渡金属铜修饰的仲钨酸盐化合物 [Na2(H2O)10][Cu4(H2O)12(H2W12O42)]·15H2O (CuW12)的体外抗肿瘤活性.取人卵巢癌细胞SKOV-3加入不同浓度CuW12处理，应用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法分析细胞增殖，计算了半数抑制浓度(IC50)；采用光学显微镜观察SKOV-3细胞的凋亡形态变化；分析了细胞周期和细胞凋亡，计算了各期细胞比例及细胞凋亡率.结果表明：CuW12对SKOV-3细胞增殖抑制的IC50值为45.2 μmol/L，且呈剂量依赖性；与经典的仲钨酸盐Na10(H2W12O42)·26H2O (NaW12)相比，过渡金属铜修饰的仲钨酸盐抗肿瘤活性更强；光学显微镜下观察到CuW12处理组细胞数目明显减少，出现变圆、缩小、老化等形态变化；不同浓度CuW12处理12 h后早期凋亡细胞所占的百分比显著增加且呈剂量依赖性.

仲钨酸盐；人卵巢癌细胞SKOV-3；抗肿瘤；铜

0 引言

多金属氧酸盐 (Polyoxometalates，POMs)又称多酸，是由d0组态的过渡金属离子与氧高度聚合形成的具有空间网络结构的金属-氧簇合物.[1]1971年M.Raynaud等[2]首次报道了杂多阴离子[SiW12O40]4-的抗病毒活性，开创了多酸的药物化学.从20世纪80年代中后期开始，多酸药物研究进入了一个新的发展时期，在抗病毒[3]、抗肿瘤[4]、抗菌[5]等领域都有着重要研究进展.

仲钨酸盐-B是一种经典的同多酸，阴离子结构式为[H2W12O42]10-，是由4个共角相连的两种不同类型的三金属簇{W3O13}和{W3O14}单元构成的一种中心对称结构，这一结构有利于构建各种拓展结构，以其为基本建筑单元，利用过渡金属离子作为连接子，可以构筑各种基于仲钨酸盐-B的新型多酸化合物.[6-8]文献[9]报道仲钨酸盐具有优异的抗艾滋病毒活性，但是目前关于其抗肿瘤作用的研究报道还不多.[10-12]仲钨酸盐-B型多酸在中性到弱碱性水溶液中是非常稳定的，在生理条件下不分解成小碎片，表面电荷高，具备成为优良抗肿瘤药物的潜力.因此，研究仲钨酸盐化合物的抗肿瘤作用具有重要意义.

另一方面，铜的生物活性近年来一直受到关注.很多本身没有药理活性的物质，与铜形成化合物后表现出优异的抗炎活性[13]，研究发现癌症的发生与炎症反应有关联，体内外药理实验表明很多铜配合物具有抗癌作用[14].用过渡金属铜修饰仲钨酸盐-B以提高其生物活性是一种有意义的尝试.

本文使用课题组合成的新型铜修饰的仲钨酸盐[Na2(H2O)10][Cu4(H2O)12(H2W12O42)]·15H2O (CuW12)[8]，选择人卵巢癌SKOV-3细胞并对其体外抗肿瘤活性进行了研究，与经典的仲钨酸钠Na10(H2W12O42)·26H2O(NaW12)的药理活性进行了对比.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

仪器：苏州苏静集团FLB-lB型超净工作室；美国SHELL/JB型CO2恒温细胞培养箱；日本Olympus倒置相差显微镜；日本KA-1000型低速离心机；BIORAD公司680型酶标仪；美国BD公司BD FAC ScantoTM流式细胞仪.

试剂：3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐 (MTT) 及DMSO购自美国Sigma公司；胎牛血清(Fetalbovineserum)、RPMI-1640 (pH7.0-7.2)、胰蛋白酶(tyrsin)购自Gibco公司；双抗(青霉素钠、硫酸链霉素)购自西安制药公司；Hoechst33258试剂盒、碘化丙啶(Propidium Iodine，PI)购自南京凯基生物工程研究所； CuW12和NaW12为自制单晶(CuW12和NaW12水溶性较好，经紫外光谱研究发现化合物在pH值2～9范围内结构保持稳定，且不随时间变化；两种化合物均经过X射线单晶衍射、红外光谱、元素分析进行了表征[10])，分别将其溶于DMSO中，再用含10%灭活新生小牛血清的RPMI-1640培养液稀释成终浓度为100 mmol/L的母液，4℃保存备用；SKOV-3细胞株，吉林医药学院科学实验室保存.

1.2 MTT法测肿瘤细胞活力

把对数生长期的SKOV-3细胞调成密度为1×105个/mL，在96孔培养板中每孔加入200 μL密度为1×105个/mL的SKOV-3细胞悬液，在37℃、CO2体积分数为5%的条件下培养，24 h后把SKOV-3细胞分为空白对照组和6个实验组(分别加入浓度为0.1，1，10，20，50，100 μmol/L的药物溶液200 μL)，用DMEM培养基稀释液分别培养24 h.培养结束每孔加入新鲜配制的MTT溶液20 μL，温育4 h使MTT还原为甲瓒，当在倒置显微镜下看到孔板内的细胞周围出现丝状紫色结晶体时倒掉上清液，每孔加入DMSO 150 μL振荡溶解细胞，用平板摇床摇匀后，使用酶标仪测定光密度值(OD)(检测波长为570 nm).计算增殖抑制率，增殖抑制率=(1-药物试验组吸光度值/对照组吸光度值)×100%.重复实验 3次，取平均值.

1.3 细胞凋亡的形态学观察

取对数生长期的SKOV-3细胞，培养24 h后，去上清液，将细胞分成空白对照组及6个实验组(分别加入浓度为0.1，1，10，20，50，100 μmol/L的药物溶液200 μL)，用DMEM培养基稀释液培养24 h后，于倒置显微镜下观察不同浓度药物对肿瘤细胞的影响，从生长抑制、细胞形态进行评估.

1.4 Annex in V-FITC/ PI 双染法检测细胞凋亡率

分别取对数生长期SKOV-3细胞5×105个接种于7个25 cm2细胞培养瓶中，待细胞贴壁后，更换培养液，分别加入浓度为0，0.1，1，10，20，50，100 μmol/L的药物溶液10 mL，其中0为阴性对照，12 h后收集空白对照组和实验组细胞，PBS洗涤2次，在4℃温度下用70%乙醇固定30 min，用Annex in V-FITC/PI双标记染色后上机检测细胞凋亡率.

2 结果与讨论

2.1 MTT比色实验

由于活细胞的线粒体具有还原MTT形成紫色化合物的能力，该化合物在 570 nm 波长下有强吸收.细胞死亡或增殖功能下降时，还原MTT 的能力下降，570 nm 波长下吸光度值会降低，不同浓度CuW12处理SKOV-3细胞的实验结果见表1.由表1可知，与空白对照组比较，不同浓度的CuW12处理SKOV-3细胞24 h后，SKOV-3细胞的OD值明显减小，表明CuW12对SKOV-3细胞具有抑制作用，且随着浓度的增加细胞的存活率下降，具有药物剂量依赖性，IC50为45.2 μmol·L-1(见表2).对比经典的仲钨酸盐NaW12和CuW12的药理活性，NaW12体外抑制SKOV-3细胞的IC50为200.6 μmol·L-1[10]，经过过渡金属铜修饰的仲钨酸盐对肿瘤细胞的增殖抑制活性显著增强，这说明Cu2+的引入对仲钨酸盐药理活性的增强发挥了重要作用，但具体作用机制有待进一步研究.

表1 不同浓度CuW12处理SKOV-3细胞24 h后的OD值

注：OD值为光密度值.

表2 NaW12和 CuW12体外抑制SKOV-3细胞的抑制率和IC50

2.2 不同浓度CuW12对肿瘤细胞形态学的影响

不同浓度CuW12对SKOV-3细胞形态学的影响见图1，空白对照组卵巢癌细胞SKOV-3紧贴瓶底、细胞密集，细胞间连接紧密，细胞形态饱满、边界清晰、圆形细胞少；与空白对照组比较，10 μmol·L-1CuW12组细胞形态变化不明显；50 μmol/L CuW12组细胞较为稀疏，附壁疏松，脱壁细胞由椭圆形变圆；100 μmol/L CuW12组细胞皱缩变小，细胞边缘毛糙不规则，胞质致密，细胞核变形，细胞质中颗粒较多.经CuW12处理的细胞呈现凋亡的特征性改变，且随着药物浓度的增加，视野内凋亡的细胞也增加，呈现一定的剂量效应关系.

a：对照组；b—d：分别为10，50，100 μmol/L CuW12处理的SKOV-3

2.3 不同浓度的CuW12对肿瘤细胞早期凋亡率的影响

正常生长的SKOV-3细胞早期凋亡率为4.61%.经不同浓度的CuW12处理12 h后，SKOV-3细胞早期凋亡率显著增加，经0.1，1，10，20，50，100 μmol/L CuW12处理后的凋亡率分别为4%，4.63%，8.1%，20.96%，34.86%和48.4%(见图2).早期凋亡细胞所占的百分比由4.61%增加到48.4%.表明CuW12诱导SKOV-3细胞的死亡性质为凋亡，且其作用具有明显剂量依赖性.

a：正常生长的SKOV-3；b—g分别为0.1，1，10，20，50，100 μmol/L CuW12处理的SKOV-3

3 结论

本文探讨了过渡金属铜修饰的仲钨酸盐化合物CuW12对人卵巢癌SKOV-3细胞生长及凋亡的影响.MTT细胞活性检测表明：CuW12对SKOV-3细胞有较明显的抑制作用，IC50为45.2 μmol·L-1，与经典的仲钨酸盐NaW12相比，Cu2+修饰的仲钨酸盐对肿瘤细胞的增殖抑制活性明显增强，说明过渡金属铜的引入对改变仲钨酸盐的药理活性有重要作用；光学显微镜下CuW12处理组的细胞呈现凋亡的特征性改变，且呈现一定的剂量效应关系；不同浓度CuW12处理12 h后早期凋亡细胞所占的百分比显著增加且呈剂量依赖性，说明CuW12具有诱导SKOV-3细胞凋亡的作用.凋亡是出现在多细胞生物体内的程序性死亡.近年来，诱导肿瘤细胞凋亡已成为抗肿瘤药物的主要作用机制，许多化学药物的治疗机制都是通过诱导细胞凋亡发挥作用的.因此，研究仲钨酸盐-B型化合物的抗肿瘤作用具有潜在的应用价值，可为发展多酸药物的临床应用提供有价值的基础数据.

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(责任编辑：石绍庆)

Inhibitoryeffectofaparadodecatungstate-BcompounddecoratedbytransitionmetalcopperonthegrowthofhumanovariancarcinomaSKOV-3cells

ZHANG jing1，QU Xiao-shu2，LIU Shu-ping3，YANG Yan-yan2

(1.Navy 92538 Force Hospital，Dalian 116000，China； 2.Chemical and Pharmaceutical Engineering Institute，Jilin Institute of Chemical Technology，Jilin 132022，China； 3.College of Tourism and Cusine，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China)

This paper has studied the in vitro anti-tumor activity of a novel paradodecatungstate-B compound decorated by transition metal copper：[Na2(H2O)10][Cu4(H2O)12(H2W12O42)]·15H2O (abbreviated form：CuW12).Human ovarian carcinoma SKOV-3 cell was treated with different concentration of CuW12，then its IC50was measured by MTT assay.The morphological change in SKOV-3 cell was observed by optical microscopes.Flow cytometry was applied to analyze cell cycle and apoptosis by computing the ratio of SKOV-3 cells in different phase and its apoptotic ratio.The results show that CuW12can inhibit SKOV-3 cell proliferation with IC50of 45.2 μmol/L，showing dose-dependent.Compared with CuW12and classic paradodecatungstate compound Na10(H2W12O42)·26H2O (abbreviated form：NaW12)，CuW12exhibits higher inhibitory effect owing to the introduction of copper atom.Under the optical microscopes，we observed the number of SKOV-3 cells treated with CuW12decreased significantly，cell rounding，shrinking and aging.Treated with different concentrations of CuW12after 12 h，the proportions of SKOV-3 cells on the early apoptosis increased markedly，showing dose-dependent.

paradodecatungstate-B；human ovarian carcinoma SKOV-3 cells；anti-tumor；copper

1000-1832(2017)03-0092-05

10.16163/j.cnki.22-1123/n.2017.03.020

2016-10-25

国家自然科学基金资助项目(21301041)；吉林省教育厅科学技术研究项目(2015431).

张静(1975—)，女，硕士，主治医师，主要从事临床医学研究；通讯作者：曲小姝(1974—)，女，博士，教授，主要从事多酸化学研究.

O 611 [学科代码] 150·15

A