TRAP1通过TGF/Smad3通路对膀胱癌的迁移和侵袭能力的影响①

王 哲 张 敬 陈怀安 张 潮 张晓云 刘 硕 苗文隆 李凤歧

(河北北方学院附属第一医院泌尿外科,张家口075000)

TRAP1通过TGF/Smad3通路对膀胱癌的迁移和侵袭能力的影响①

王 哲 张 敬②陈怀安 张 潮 张晓云③刘 硕 苗文隆 李凤歧

(河北北方学院附属第一医院泌尿外科,张家口075000)

目的：探讨TRAP1蛋白对膀胱癌细胞迁移和侵袭的影响及机制。方法：采用Western blot从膀胱癌细胞株中挑选出高表达TRAP1的细胞系BIU-87；使用TRAP1沉默慢病毒(LV3-TRAP1)沉默TRAP1，使用GFP荧光及PCR检测LV3-TRAP1沉默效率；Transwell和划痕实验分别检测沉默TRAP1蛋白表达后对膀胱癌细胞侵袭和迁移能力的影响；CM-H2DCFDA荧光染色细胞检测膀胱癌细胞内活性氧水平；Western blot检测相关信号通路TGF/Smad3蛋白的表达情况。结果：LV3-TRAP1慢病毒可以有效地抑制TRAP1蛋白的表达；沉默TRAP1蛋白的表达可以有效抑制膀胱癌细胞的侵袭和迁移能力、降低膀胱癌细胞内活性氧水平；同时TGF/Smad3信号通路中的TGF、Smad2及Smad3蛋白表达也相应降低。结论：沉默TRAP1蛋白可以通过调控TGF/Smad3信号通路来抑制膀胱癌细胞的侵袭和迁移能力。

TRAP1；膀胱癌；TGF；Smad3；ROS

膀胱癌是全世界范围内最常见的泌尿系统肿瘤之一，根据世界卫生组织国际癌症中心研究统计(International agency for reasearch on cancer，IARC)，膀胱癌在男性恶性肿瘤中排第四位，在女性恶性肿瘤中排第八位[1]。膀胱根治性切除是现在最主要的手术治疗方案，但是浸润肌层的膀胱癌治疗效果仍然不乐观。随着肿瘤分子生物学的研究进展，探讨膀胱癌发生发展的分子生物学机制颇为重要，可能为膀胱癌的诊断和治疗提供一定的帮助。

TNF受体相关蛋白 1(TNF receptor-associated protein 1，TRAP1)是HSP90热休克蛋白家族的一个成员，主要存在于真核细胞的线粒体和细胞核中[2]。在大多数真核细胞生物中，超过一半的线粒体和细胞核中含有热休克蛋白序列，尽管TRAP1和ATP水解酶的结构类似，但是它的细胞功能和机制还不清楚[3]。 TGF/Smad信号通路是众多TGF-β诱导的通路的一种，但是很多研究报道Smad3 需要细胞因子激活之后才会在细胞组织中起作用。Uemura等[4]研究发现Smad3和Smad2的过表达可以短暂性激活α2因子，继而诱导发生DNA损伤。另外有研究发现。肝癌中的TGF/Smad3的过表达会导致肝癌转移侵袭能力增强[5]。探讨TGF/Smad3通路在膀胱癌中的作用机制对于膀胱癌的诊断和治疗具有重要意义本研究利用慢病毒技术沉默TRAP1蛋白的表达，观察TRAP1的表达水平，以及膀胱癌细胞迁移和侵袭能力的变化，之后检测沉默TRAP1后TGF/Smad3信号通路中关键蛋白的表达，探讨TRAP1通过TGF/Smad3信号通路对膀胱癌的迁移和侵袭能力的影响。

1 材料与方法

1.1细胞株与主要试剂 人膀胱细胞株BIU-87、T24、EJ和J82购自北京协和细胞研究所。细胞培养条件：含10%胎牛血清的RPMI1640，37℃，5%CO2条件下培养。胎牛血清，RPMI1640培养基均购自美国Gibco公司。TRAP1、TGF、Smad2、Smad3兔单克隆抗体均购自美国Abcam(ab2721、ab31013、ab40855、ab40854)。Transwell小室购自美国Millipore公司，Matrigel购自美国BD公司。TRAP1沉默及对照慢病毒购自上海吉玛制药技术有限公司。

1.2方法

1.2.1慢病毒转染BIU-87细胞 实验前一天分别接种5×103个BIU-87细胞于96孔板，使细胞融合度在20%～30%。根据吉玛慢病毒操作手册，以0、10、100为梯度，测出TRAP1慢病毒的适宜MOI(Multiply of Infection)。

1.2.2实验分组 转染TRAP1沉默慢病毒(LV3-TRAP1)的为沉默组，转染阴性对照(LV3-NC)慢病毒的为对照组。LV3-TRAP1组加入稀释100倍的病毒原液10 μl，LV3-NC组加入稀释100倍的阴性对照病毒。24 h后观察GFP荧光表达情况，根据荧光细胞数目确定转染效率。

1.2.3PCR检测转染慢病毒TRAP1的沉默效率 首先合成PCR引物(上游5′-GGGTCCCTGAGACCCTAACTTGT-3′，下游5′-GCTGTCAACATACGC-TACGTA-3′)，将反应混合液加热至94～98℃保持20～30 s，反应温度降至50～65℃时，引物与互补的序列形成氢键。退火温度72℃，维持20～40 s，继续降低至68℃，PCR反应进行30～35个循环，68～74℃延伸 5～10 min，使DNA全部反应完毕。通过PCR结果对慢病毒沉默效率进行验证。实验重复3次。

1.2.4Western blot检测TRAP1、TGF-β和Smad3蛋白的表达 细胞转染72 h后，提取实验组和对照组细胞蛋白，BCA法测定蛋白浓度，加入loading buffer后煮沸蛋白。配制10%SDS-PAGE凝胶，每孔加入30 μg蛋白样品。使用湿转法电转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，1∶1 000 TBST稀释一抗(抗-TRAP1，TGF-β和Smad3)，4℃过夜；加入1∶5 000 稀释的羊抗兔二抗，室温孵育2 h；ECL发光，统计不同蛋白的相对表达量。实验重复3次。

1.2.5Transwell侵袭实验检测TRAP1的表达对膀胱癌细胞侵袭能力的影响 所有试剂及器材均于冰上预冷，将Transwell小室置于24孔板内，将Transwell小室内膜均匀涂抹Matrigel胶 50 μl(0.2 μg/μl)，37℃孵育15 min，使胶凝固；消化、离心、计数细胞后，按照2.5×104ml-1用无血清培养基稀释细胞，制成细胞悬液；按照每孔200 μl，将细胞悬液加入Transwell上室，同时在Transwell下室加入10%FBS+培养基500 μl，放入37℃孵箱培养；甲醛固定，结晶紫染色15 min，然后用棉签轻轻擦拭内膜上的细胞。显微镜下计数，计数4个高倍视野(×40)下穿过滤膜的细胞数。实验重复3次。

1.2.6划痕实验检测TRAP1的表达对膀胱癌细胞迁移能力的影响 划痕实验：将BIU-87细胞接种于6孔板，待细胞融合度生长在90%时，用200 μl消毒枪头从上而下划线，并在显微镜下观察，测量划痕的初始距离(0 time)；在24、48、72 h后，分别测量划痕的距离，并拍照，计算细胞的迁移率。实验重复3次。

1.2.7细胞活性氧(ROS)检测 测量细胞内活性氧的含量，细胞在氯甲基二乙酸中孵化1 h，37℃，浓度为10 μm/ml，孵化1 h后，通过免疫荧光测定VICTOR3，测定线粒体活性氧的水平。细胞活性氧用MitoSOX试剂测定。实验重复3次。

2 结果

2.1TRAP1在不同膀胱癌细胞株中的表达 Western blot实验结果显示：相比T24、EJ、J82细胞株，TRAP1蛋白在BIU-87细胞株中表达最高(图1)，所以后续实验选取BIU-87膀胱癌细胞作为实验细胞株。

2.2转染慢病毒TRAP1的沉默效率 LV3-TRAP转染BIU-87细胞24 h后，GFP荧光显微镜下观察显示(图2A)：与LV3-NC组相比，绿色荧光在LV3-TRAP1转染细胞中数量明显增多[(84.17±11.19)% vs (15.92±5.25)%,P<0.05]。结果表明LV3-TRAP1慢病毒可以有效地整合在膀胱癌BIU-87细胞中。

PCR实验结果显示(图2B)：与LV3-NC组相比，LV3-TRAP1组中TRAP1 mRNA表达水平明显减少[(0.85±0.14) vs (0.19±0.08),P<0.05]，说明LV3-TRAP1转染BIU-87细胞之后可以有效地降低TRAP1mRNA的表达。

2.3沉默TRAP1后膀胱癌细胞BIU-87的迁移能力变化 细胞迁移的能力可以在无血清培养基中培养后通过检测细胞迁移的距离比例来测定。划痕实验结果显示(图3)：在荧光显微镜下观察，两组细胞任意三个部位的划痕宽度，迁移率=[D(t=24，48，72 h)-D(t=0h)]/D(t=0h)。与LV3-NC对照组相比，LV3-TRAP1组迁移比率明显降低，在24、48、72 h结果分别是(0.19±0.01)% vs (0.38±0.04)%,P<0.05；(0.39±0.05)% vs (0.78±0.07)%,P<0.05；(0.42±0.05)% vs (0.91±0.08)%,P<0.05。差异有统计学意义。该结果表明，敲除TRAP1的表达后可以有效抑制BIU-87细胞的迁移能力。

图1 TRAP1在不同膀胱癌细胞株中的表达Fig.1 Expression of TRAP1 in different bladder cancer cell linesNote: *.P<0.05.

图2 TRAP1在膀胱癌细胞株中的转染效率Fig.2 Transfection efficiency of TRAP1 in bladder cancer cell linesNote: A.Transfection efficiency after LV3-TRAP1 transfected BIU-87 by GFP fluorescence detection;B.Expression of TRAP1 was detected by PCR.Error bars represent standard error,*.P<0.05.

2.4沉默TRAP1后膀胱癌细胞BIU-87的侵袭能力变化 细胞侵袭穿透基质胶的能力大小可以反映细胞的侵袭能力。Transwell实验结果显示(图4)：LV3-NC组穿透过基质胶的细胞数量明显多于LV3-TRAP1组[(411.2±16.2)vs (83.2±3.5),P<0.05]，差异有统计学意义。该结果表明，沉默TRAP1可以抑制膀胱癌BIU-87细胞的侵袭能力。

图3 划痕实验检测敲除TRAP1对于膀胱癌BIU-87细胞迁移能力的影响Fig.3 Effect on migration ability of BIU-87 cells were detected by wound healing assays after silencing TRAP1Note: *.P<0.05.Error bars represent standard error.

图4 Transwell侵袭实验检测沉默TRAP1对于膀胱癌BIU-87细胞侵袭能力的影响Fig.4 Effect on invasion ability of BIU-87 cells were detected by Transwell matrigel invasion assays after silencing TRAP1Note: *.P<0.05.Error bars represent standard error.

图5 沉默TRAP1的表达可以抑制膀胱癌BIU-87细胞内活性氧的水平Fig.5 Level of ROS after silencing TRAP1 were detected by CM-H2DCFDANote: *.P<0.05.Error bars represent standard error.

图6 沉默TRAP1的表达可以抑制TGF/Smad3信号通路蛋白的表达Fig.6 Protein level of TRAP1 after silencing TRAP1 were detected by Western blotNote: *.P<0.05.Error bars represent standard error.

2.5沉默TRAP1后细胞活性氧水平检测 细胞内活性氧的水平可以影响细胞的增殖、运动以及代谢水平。为了避免慢病毒绿色荧光的影响，采取siRNA转染BIU-87后通过CM-H2DCFDA试剂检测沉默TRAP1的膀胱癌BIU-87细胞内的活性氧水平，转染TRAP1 siRNA后CM-H2DCFDA显示的细胞内活性氧水平降低[(19.8±2.28)% vs (77.5±3.93)%，P<0.05]，荧光强度变弱证实沉默TRAP1可以通过降低细胞内的活性氧水平。表明沉默TRAP1可以抑制细胞的过度增殖和代谢(图5)。

2.6沉默TRAP1后TGF/Smad3信号通路的蛋白水平变化 Western blot实验结果显示，沉默TRAP1之后TGF/Smad3信号通路中的TGF、Smad2、Smad3蛋白表达相应降低[(18.5±1.62)% vs (82.2±2.93)%，(22.9±1.34)% vs (79.4±3.37)%，(23.8±2.66)% vs (86.2±3.87)%，P<0.05]，差异有统计学意义。说明沉默TRAP1后膀胱癌BIU-87细胞的迁移和侵袭能力的改变可能是通过TGF/Smad3信号通路调控的(图6)。

3 讨论

TRAP1是由Felts等[6]在2000年首次发现的，但是详细的分子生物学功能和机制至今都未研究清楚。TRAP1在膀胱癌，宫颈癌和肾透明细胞癌中都有表达[7]。研究报道表明，TRAP1在很多类型的肿瘤组织中存在，在正常组织中几乎没有表达，已经有部分学者研究证明TRAP1是一种致瘤性的因子[8]。但是也有学者表明TRAP1在正常组织和肿瘤组织中都有表达，而且TRAP1的表达和肿瘤的分级分期相关[9]。在某种意义上讲，TRAP1可以阻断ROS的活性，进而调节线粒体的代谢功能，影响在肿瘤细胞中线粒体的代谢[10]。TRAP1的上述功能和作用在肿瘤的发生发展中发挥重要的作用。我们认为这可能与膀胱癌的增殖、迁移及侵袭能力相关，本实验结果表明,TRAP1蛋白表达降低，膀胱癌细胞的增殖抑制率会显著提高。表明TRAP1可能与膀胱癌的进展相关，可以在一定程度上抑制膀胱癌的扩散和转移。

TGF/Smad3信号通路在人类很多恶性肿瘤中被激活，包括乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、胰腺癌和子宫内膜癌等，参与肿瘤细胞侵袭迁移等生物学行为[11-14]。所以我们实验旨在探讨TRAP1基因调控膀胱癌BIU-87是否和TGF/Smad3信号通路相关。试验通过敲除TRAP1蛋白过后检测TGF/Smad3中关键蛋白的表达水平降低，表明TRAP1的表达会引起TGF/Smad3通路的蛋白表达，我们推测TRAP1可能通过调控TGF/Smad3信号通路来影响膀胱癌细胞的生物学行为。而且通过检测细胞活性氧的水平变化发现，TRAP1的表达可以在一定程度上降低膀胱癌细胞的活性氧水平，从而抑制肿瘤细胞代谢，影响膀胱癌细胞的增殖和侵袭。

在过去的10年里，越来越多的研究证明TRAP1蛋白可以通过多种通路途径参与到肿瘤的发展进程中，其多功能性很受众多学者关注[15-17]。发现TRAP1在人视网膜母细胞和非小细胞肺癌中发挥重要作用，在乳腺癌、结肠癌和卵巢癌中也有异常的表达[18，19]。总之，TRAP1在肿瘤细胞中扮演的功能是关键又复杂的，在不同肿瘤中的作用和结果可能也存在偏差。在本研究中，我们发现在膀胱癌细胞BIU-87中，沉默TRAP1后可以抑制膀胱癌细胞的侵袭和迁移，且TGF/Smad3信号通路的关键因子随着TRAP1的表达下降相应减少，提示TRAP1可能通过TGF/Smad3调控膀胱癌细胞的侵袭和迁移。本研究结果不但丰富了TRAP1在恶性肿瘤中的作用机制，而且还为以TRAP1为分子靶标的膀胱癌治疗新方法提供了新的理论依据。

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[收稿2017-02-14 修回2017-04-19]

(编辑 许四平 刘格格)

EffectofTRAP1oninvasionandmigrationofhumanbladdercancerthroughTGF/Smad3signalpathway

WANGZhe,ZHANGJing,CHENHuai-An,ZHANGChao,ZHANGXiao-Yun,LIUShuo,MIAOWen-Long,LIFeng-Qi.

DepartmentofUrology,FirstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity，Zhangjiakou075000,China

Objective:To investigate the effect and related mechanism of TRAP1 on the invasion and migration of human bladder cancer through TGF/Smad3 signal path.Methods: Selected from BIU-87 of high expression of TRAP1 in bladder cancer cell lines through Western blot techniques.TRAP1 knockdown lentivirus (LV3-TRAP1) was used to silence the expression of TRAP1.GFP fluorescene and PCR detector was used to detected the efficiency of gene silencing and the effectiveness of gene silencing;effect of TRAP1 on the invasion and migration ability of BIU-87 were detected by Transwell matrigel invasion assays and wound healing assays,CM-H2DCFDA fluorescent staining was used to deteced the cell ROS of BIU-87 with LV3-TRAP1.Detected the level of TGF/Smad3 signal protein by Western blot.Results: LV3-TRAP1 lentivirus could effectively inhibit the expression of TRAP1 compared with LV3-NC.LV3-TRAP1 lentivirus could effectively inhibit the cell RPS of BIU-87.Knockdown the expression of TRAP1 could inhibit the invasion and migration of BIU-87.Knockdown the expression of TRAP1 in BIU-87 could reduce the protein level of TGF/Smad3.Conclusion: Silencing TRAP1 could inhibit the invasion and migration of bladder cancer cell through TGF/Smad3 signal pathway.

TRAP1；Bladder cancer；TGF；Smad3；ROS

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.09.006

①本文受张家口市2016年度市级科技计划自筹经费项目资助(No.1621074D)。

王 哲(1978年-),男,硕士,主治医师,主要从事膀胱癌的基础和临床研究,E-mail：wangzhe1807@126.com。

R737.14

A

1000-484X(2017)09-1306-05

②河北北方学院附属第一医院肿瘤内科,张家口075000。

③河北张家口张北县人民医院外科，张北076450。