血清抗幽门螺旋杆菌抗体和抗AQP4抗体在中枢神经系统脱髓鞘病中的相关性研究①

熊英琼 梅竹君 章 伟 屈新辉 吴晓牧

(南昌大学研究生院，南昌330006)

血清抗幽门螺旋杆菌抗体和抗AQP4抗体在中枢神经系统脱髓鞘病中的相关性研究①

熊英琼 梅竹君②章 伟 屈新辉②吴晓牧②

(南昌大学研究生院，南昌330006)

目的：探讨血清抗幽门螺旋杆菌抗体(HP-IgG)和抗AQP4抗体在多发性硬化(MS)、视神经脊髓炎(NMO)中的相关性。方法：对33例MS患者、7例NMO患者和35例健康体检者采用间接酶联免疫吸附法(ELISA法)检测血清中抗HP的IgG抗体，采用细胞间接免疫荧光法(CBA)检测血清标本抗AQP4抗体；分析MS、NMO患者中HP-IgG及抗AQP4抗体的阳性率，并对比抗AQP4抗体阳性与抗AQP4抗体阴性患者间HP-IgG阳性率的差别。结果：MS组、NMO组和正常对照组血清中抗血清HP-IgG抗体阳性率分别为69.70%、85.71%、42.86%，差别有统计学意义(P<0.05)，其中MS组、NMO组与正常对照组血清中抗HP-IgG抗体阳性率差别均有统计学意义(P<0.05)；但MS组与NMO组血清中抗HP-IgG抗体阳性率差别无统计学意义(P>0.05)。MS组、NMO组和正常对照组血清中抗AQP4抗体阳性率分别为4.2%、85.71%、0%，差别有统计学意义(P<0.05)。MS组和NMO患者组中抗AQP4抗体阳性患者与抗AQP4抗体阴性患者抗HP-IgG抗体阳性率分别为72.73%、79.31%，差别无统计学意义(P>0.05)。结论：HP感染是引起MS及NMO疾病发生的危险因素，而与MS及NMO患者是否含有抗AQP4抗体无关。

多发性硬化；视神经脊髓炎；抗幽门螺旋杆菌抗体；抗AQP4抗体

多发性硬化(Multipe sclerosis,MS)和视神经脊髓炎(Neuromyelitis optica,NMO)均为自身免疫介导的中枢神经系统的脱髓鞘疾病，这两种疾病确切的病因以及发病机制尚不清楚，但多发性硬化及视神经脊髓炎临床进程的异质性表明，这两种脱髓鞘疾病的发病机制包含复杂的遗传和环境因素[1,2]，其中环境因素包括感染因素(病毒及细菌等)和非感染因素。近年来，幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori，HP)感染被证明与自身免疫性疾病有关，如其可导致自身免疫性胃炎等[3]，其亦被怀疑与MS及NMO有关[4]。本研究通过检测MS、NMO患者和正常对照者血清中抗血清幽门螺旋杆菌抗体阳性率，探讨幽门螺旋杆菌感染在MS及NMO发生和进展中的作用。

1 资料与方法

1.1临床资料 收集江西省人民医院神经内科2012年4月至 2015 年5月住院的MS、NMO患者(表1)，并收集同期我院体检中心的健康体检者血清作对照。MS符合2005年修订的McDonald诊断标准，NMO符合2006年Wingerchuk等提出的NMO新校正标准。MS患者33例，NMO患者7例，健康体检者35例。各组在年龄、性别构成上差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1血清标本采集 在患者及健康体检者知情同意下，清晨空腹状态下，经患者手背浅表静脉采集外周静脉血3～4 ml,置促凝管中，2 000 r/min，离心10 min，取血清，置于EP管中，标号，置于-80℃冰箱冻存备用。

1.2.2血清幽门螺旋杆菌IgG(HP-IgG)抗体检测 采用纯化抗原预包被板ELISA原理，以酶标记SPA作为标记物。加入底物TMB显色后，反应终止，于450 nm波长测各孔OD值，OD值的大小与待检抗HP-IgG抗体含量成正比。取96/48孔酶标板，设置阳性对照孔、阴性对照孔、各血清孔、空白孔。加样前先将阳性对照液、阴性对照液、血清充分混匀。 加样： 每孔各加入相应血清100 μl, 空白孔不加，将反应板充分混匀，置37℃震荡培养器，反应30 min。洗板：用稀释洗涤液充分洗涤5次，滤纸印干。每孔加入酶标抗体工作液100 μl，将反应板充分混匀后，置37℃震荡培养器，反应30 min。洗板：用稀释洗涤液充分洗涤5次，印干。每孔加入底物工作液100 μl，混匀后置37℃震荡培养器，暗处反应 30 min。每孔加入100 μl终止液，充分混匀。提前5 min预热Multiskan Ascent酶标仪，30 min内将ELISA反应板置Multiskan Ascent酶标仪，在450nm处测吸光值。所有OD值均减除空白值后再计算。判定结果：P/N=标本OD值/阴性对照OD值。P/N≥2.1为阳性；1.5≤P/N<2.1为可疑标本。P/N<1.5为阴性。阴性对照小于0.10时以0.10计。阴性对照OD值正常范围应<0.21，阳性对照≥0.40以上实验结果成立。

表1患者组病例资料

Tab.1Clinicalcharacteristicsofsubjects

GroupsMaleFemaleAgeCourseofdiseaseEDSSMSpatients141945.59±14.1412.58±18.993.90±1.88NMOpatients1643.14±17.2112.86±12.212.31±1.57Healthycontrol152044.57±15.26

1.2.3血清抗AQP4抗体检测 将pEGFP-N1-M23-AQP4质粒通过磷酸钙转染试剂转染接种于6孔细胞培养板的HEK293细胞，在荧光显微镜下观察并选择瞬时转染率高的细胞培养孔，用含G418的筛选培养液筛选并挑单克隆细胞进行培养扩增，获得绿色荧光稳定表达的单克隆细胞，并以此细胞为底物，采用CBA法检测M23-AQP4表达及分布，以鉴定获得绿色荧光稳定表达的单克隆细胞是否为M23-AQP4稳定表达细胞。EK293-M23-AQP4接种并固定于96孔细胞培养板，PBS浸洗2 min×5次，正常山羊血清工作液(50 μl/孔)室温封闭1 h，去除封闭液，血清标本(1∶50稀释，50 μl/孔，每个标本设3个孔)4℃孵育过夜，PBS浸洗2 min×5次，Cy3标记的羊抗人二抗(1∶500稀释，50 μl/孔)室温孵育1 h，PBS浸洗2 min×5次，50%(体积分数)甘油-0.5 mol/L pH9.0～9.5碳酸盐缓冲液封闭，荧光显微镜下观察，蓝光激发下的绿色荧光区域，经绿光激发后观察到红色荧光为阳性，无红色荧光为阴性。将检测结果为阳性的血清标本用倍比稀释法稀释为1∶50～1∶1 638 400检测抗AQP4抗体，以不能观察到红色荧光的最小稀释比例的前一比例作为该标本的抗AQP4抗体滴度。

1.3统计学处理 采用SPSS17.0软件进行数据分析。各组间抗体阳性率比较，采用χ2检验或校正χ2检验公式计算。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1三组间幽门螺旋杆菌IgG抗体比较 MS组、NMO组分别与健康对照组抗HP IgG抗体阳性率比较，差别均有统计学意义；MS组与 NMO组抗 HP IgG抗体阳性率比较，差别无统计学意义，见表2。

表2各组间血清抗幽门螺旋杆菌IgG抗体阳性率检测

Tab.2ComparisonofpositivedetectingrateofHP-IgGineachgroup

GroupsnHp-IgGpositiveHp-IgGnegativePositiverateMSpatients33231069.7%1)NMOpatients76185.7%1)Healthycontrol35152042.86%

Note：Vs control group，1)P<0.05.

图1 AQP4抗体检测(CBA法，荧光显微镜，标尺50 μm)Fig.1 AQP4 antibody detected(CBA,fluorescemce mic-roscope,scaleplate 50 μm)

2.2三组间抗AQP4抗体比较 以HEK293-M23-AQP4细胞为底物的CBA法检测显示，与荧光显微镜下经绿光激发可观察到红色荧光的是抗AQP4抗体阳性血清标本(图1C2)，且红色荧光与绿色荧光重叠(图1C3)，不能观察到红色荧光的是抗AQP4抗体阴性血清标本(图1D2)，以HEK293-pEGFP-N1细胞为底物也不能观察到红色荧光(图1E2)。

MS组、NMO组分别与健康对照组抗AQP4抗体阳性率比较，差别均有统计学意义；MS组与 NMO组抗AQP4抗体阳性率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

2.3抗AQP4抗体阴、阳性患者间抗HP-IgG抗体阳性率比较 MS组与NMO组中抗AQP4抗体阳性者与阴性者抗HPIg-G抗体阳性率比较，差别无统计学意义。见表4。

表3各组间血清抗AQP4抗体阳性率检测

Tab.3CompartisonofpositivedetectedrateofAQP4ineachgroup

GroupsnAQP4antibodypositiveAQP4antibodynegativePositiverateMSpatients3352815%1)2)NMOpatients76185.7%1)Healthycontrol35000

Note：Vs control，1)P<0.05；vs NMO group 2)P<0.05.

表4抗AQP4抗体阴、阳性患者间抗HPIg-G抗体阳性率

Tab.4ComparisonofpositivedetectingrateofHP-IgGbetweenAQP4positivegroupandnegativegroup

GroupsnPositiveNegativePositiverateAQP4positive118372.73%AQP4negative2923679.31%

Note：Comparison of two groups，P>0.05.

3 讨论

虽然MS、NMO的病因和发病机理还不清楚，但大量研究显示，MS及NMO最有可能是由多基因遗传和复杂的环境因素(包括感染因素和非感染因素)相互作用引起的。根据分子模拟学说，MS患者感染的病原体，可能与中枢神经系统髓鞘蛋白(MBP)或少突胶质细胞存在共同抗原，病原体感染后，激活体内T细胞，活化的T细胞通过血-脑屏障(Blood-brain barrier,BBB)，与抗原呈递细胞(Antigen presenting cell,APC)呈递的MBP等靶抗原结合后，触发自身免疫反应，导致中枢神经系统白质脱髓鞘病变，临床上出现各种神经功能缺失症状[5]。幽门螺旋杆菌感染作为MS及NMO进程中自身免疫反应潜在的触发因素，越来越受到人们的重视。

HP为革兰染色阴性，呈弯曲状、螺旋形或S形,微需氧。HP感染较为常见，为慢性、持续性感染，其感染范围广，呈世界性分布，在发展中国家尤甚。虽然幽门螺旋杆菌HP仅定植于胃黏膜，但是其与宿主间相互作用，通过诱导大量的炎性介质及细胞因子的释放，导致慢性自身免疫反应，引起自身免疫性疾病，如特发性血小板减少性紫癜等[6]。研究认为，幽门螺旋杆菌中性粒细胞激活蛋白(HP-NAP)与引起吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barre syndrome,GBS)的空肠弯曲菌蛋白显著同源，提示HP感染有可能参与脱髓鞘疾病(如GBS、 MS及NMO等)的发生与进展[7]。还有研究发现，在MS及MNO进程中，一系列涉及HP感染的相关因素参与BBB的破坏，包括炎症介质(HP-1感染诱导产生的细胞因子，趋化因子)和氧化应激，且HP介导的血脑屏障损伤或许可允许抗AQP4抗体及T淋巴细胞进入中枢神经系统，因此，其在NMO的病理机制中发挥了重要作用；此外，HP-NAP可激活中性粒细胞、单核细胞和肥大细胞，从而参与血脑屏障的破坏[8]。近年来，有学者报道HP感染在MS中的致病因素，即通过促进各种趋化因子/炎症介质的释放，包括主要的中性粒细胞趋化因子IL-8和中性粒细胞激活蛋白(Neutrophil activator protein,NAP)的参与，抗水通道蛋白4(Aquaporin4,AQP4)抗体相关的神经损害，如MS患者感染HP后，体内可产生抗幽门螺旋杆菌中性粒细胞激活蛋白抗体(即抗HP-NAP抗体)和/或抗AQP4抗体，因HP可能和神经组织之间存在交叉模仿，故可引起神经损伤，导致脱髓鞘反应[9]。新近在希腊的一个中心观察到MS的一种特殊类型，即临床孤立综合症(Clini-cally isolated syndrome，CIS)与HP感染有强烈相关性，在为期两年的研究中观察到，与CIS对照者比较，成功根除HP的CIS患者，其第二次发作的可能性大幅下降，且平均EDSS评分下降，即HP-1在希腊的CIS患者中更为常见，且对HP感染的CIS患者而言，根除HP能延缓CIS的进展[10]。综上，目前研究认为，HP感染参与MS与NMO疾病的发生和进展。

本研究通过各组间血清抗HP抗体阳性率的比较，MS与NMO组抗体阳性率均高于健康组，进一步证实HP感染参与了MS与NMO疾病的发生和进展。此外，抗AQP4抗体阳性率在两组疾病中统计学有差异，与目前对NMO疾病的诊断标准相符，抗AQP4抗体阳性支持NMOSD的诊断。

目前对于HP感染在参与MS及NMO疾病的发生与进展的过程中，是否与患者含有抗AQP4抗体有关仍有争议。2009年通过研究亚洲人两个不同的MS，即经典型MS(CMS)和视神经脊髓炎型MS(OSMS)，结果显示抗AQP4抗体阳性MS，其HP感染率显著高于抗AQP4抗体阴性的MS(即CMS组)；同时还观察到与健康对照组比较，抗AQP4抗体阳性的MS患者和抗AQP4抗体阴性的OSMS患者的HP-NAP抗体更常见，并且HP-NAP抗体水平与Kurtzke′s扩展残疾状态量表评分(EDSS)呈正相关,即提示抗HP-NAP可能与MS患者中抗AQP4抗体相关的神经损伤有关[11]。也有研究认为，HP只对抗AQP4抗体阳性的NMO/NMOSD是危险因素，而对抗AQP4抗体阴性的NMO/NMOSD则不是危险因素[12]。

本研究发现抗AQP4抗体阳性者与阴性者抗HP-IgG抗体阳性率差别无统计学意义，HP感染参与了MS及NMO疾病的发生与进展，但与患者是否含有抗AQP4抗体无关。HP-NAP与抗AQP4抗体并不都是捆绑存在于HP上，而HP-NAP与AQP4间的分子交叉模拟可能并不是一个可靠的潜在的机制。但本研究的NOM组患者样本例数较少，导致抗AQP4抗体阳性样本不足，对两种抗体的相关性研究有必要继续扩大样本量，分不同疾病组进行分析。

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[收稿2017-04-24]

(编辑 许四平 刘格格)

Astudyofcorrelationofanti-Helicobacterpyloriantibodyandanti-aquaporin4antibodyincentreneurologicalsystemdemyelinationdisease

XIONGYing-Qiong,MEIZhu-Jun,ZHANGWei,QUXin-Hui,WUXiao-Mu.

GraduateSchoolofNanchangUniversity，Nanchang330006,China

Objective:To investigate the relationship between anti-Helicobacter pylori antibody(Hp-IgG)and anti-aquaporin 4 antibody which are in neuromyelitis optica(NMO)and multiple sclerosis(MS).Methods: Serum specimens were collected from the 33 patients with MS,7 patients with NMO,and 35 health examination cases.Hp-IgG were detected by enzyme-linked immunosorbent assasy and anti-aquaporin 4 antibody were detected by cell based assay respectively. The positive rate of Hp-IgG and anti-aquaporin 4 antibody were analyzed,and the difference of Hp-IgG positive rate was compared between patients with Hp-IgG positive and negative.Results: Serum Hp-IgG positive rate of MS,NMO and normal control groups were 69.70%,85.71% and 42.86% respectively with a significant statistically difference of Hp-IgG(P<0.05).Positive rate of serum anti HP-IgG antibody in MS group,NMO group and normal control were significantly different(P<0.05);but there was no statistical significant difference of anti HP-IgG antibody positive rate between MS group and NMO group(P>0.05).Serum anti AQP4 antibody positive rate of MS,NMO and normal control groups were 4.2%,85.71% and 0% respectively with a significant statistically difference of anti AQP4 antibody(P<0.05). The positive rates of anti HP-IgG which were in MS patients and NMO patients with positive anti AQP4 antibody were 72.73%,the positive rates of anti HP-IgG which were in MS patients and NMO patients with negative anti AQP4 antibody were 79.31%,the difference was not statistically significant(P>0.05).Conclusion: HP infection is a risk factor for the occurrence of MS and NMO,but not associated with MS and NMO patients with anti AQP4 antibodies.

MS;NMO;Anti-Helicobacter pylori antibodym;Anti-aquaporin 4 antibody

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.09.020

①本文为江西省科技厅科研院所基础设施配套项目(20123BBA13050)和国家临床重点专科建设项目(卫办医政函[2012]649号)。

熊英琼(1976年-)，女，硕士，主任医师，主要从事神经免疫及神经重症方面的研究，同时供职于南昌大学研究生学院，E-mail：xyq21cn@139.com。

及指导教师：屈新辉(1970年-)，男，硕士，主任医师，主要从事神经免疫及神经变性病方面的研究，E-mail：quxinhui@163.com。

R741

A

1000-484X(2017)09-1371-04

②江西省人民医院神经内科,南昌330006。