以乙肝病毒核心蛋白为载体制备肠道病毒71型非结构蛋白3D单克隆抗体①

李永超 朱 瑞 徐龙发 巫洋涛 赵 欢 吴 坤 刘东晓 程 通 夏宁邵

(厦门大学公共卫生学院分子疫苗学与分子诊断学国家重点实验室，国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心，厦门361102)

·免疫学技术与方法·

以乙肝病毒核心蛋白为载体制备肠道病毒71型非结构蛋白3D单克隆抗体①

李永超 朱 瑞 徐龙发 巫洋涛 赵 欢 吴 坤 刘东晓 程 通 夏宁邵

(厦门大学公共卫生学院分子疫苗学与分子诊断学国家重点实验室，国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心，厦门361102)

目的：预测肠道病毒71型(EV71)非结构蛋白3D的表位，以HBc蛋白为载体展示多肽，制备并鉴定抗EV71-3D的特异性单克隆抗体(mAb)。方法：应用生物信息学方法分析预测出EV71 3D蛋白亲水性和免疫原性指数较高的多肽片段，并运用HBc颗粒型蛋白载体展示肽段，构建多肽融合蛋白，免疫BALB/c雌鼠，通过杂交瘤技术和亲和层析技术制备和纯化抗EV71-3D蛋白的特异性mAb，用间接ELISA、ELISPOT、IFA和IHC对mAb的性质进行初步鉴定。结果：构建表达分别嵌合3D蛋白34～43位氨基酸残基、 61～76位氨基酸残基、151～164位氨基酸残基的HBc重组蛋白，免疫并经过多轮克隆化筛选，获得抗EV71-3D单克隆抗体3E1，其亚类为IgG2a；免疫荧光试验、ELISPOT法和免疫组织化学染色结果显示其可与EV71特异性结合。结论：成功制备可特异性识别EV71的单克隆抗体3E1，为病毒的检测及进一步研究3D蛋白的功能奠定了基础，同时还验证了生物信息学技术与HBc颗粒型载体展示多肽技术相结合可快速高效地制备单克隆抗体。

乙肝病毒核心蛋白；肠道病毒71型；非结构蛋白3D；单克隆抗体

手足口病(Hand,foot and mouth disease，HFMD)是一种常见的婴幼儿传染性疾病，其主要病原体之一为肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)。EV71感染不仅可引起患者的手、足和口腔等部位出现疱疹，重症者还可引发心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜炎或脊髓灰质炎样麻痹等严重的神经系统并发症，个别严重患者甚至引起死亡[11-16]。EV71属小RNA病毒科肠道病毒属，病毒基因组为单股正链RNA，含一个开放阅读框(ORF)，由P1-P3编码翻译产生。其中P3区编码的前体蛋白可被水解成非结构蛋白3A、3B、3C和3D。3D蛋白由462个氨基酸组成，是有一段核定位信号(Nuclear localization signal，NLS)的RNA 依赖多聚酶(RNA dependent RNA polymerase，RDRP)，能催化VPg蛋白的尿苷酸化，启始病毒RNA的复制[11-13]。此外，有研究证明3D蛋白可以使宿主细胞停滞在S期，从而影响病毒感染细胞后的整个生命周期[14,15]。因此，快速获得针对3D蛋白的单克隆抗体，能更好地研究3D蛋白在EV71病毒致病机理中所起的作用。

本研究利用生物信息学方法和颗粒型蛋白载体展示技术预测并表达重组蛋白，成功制备抗EV71非结构蛋白3D的单克隆抗体，验证生物信息学预测多肽技术和颗粒型蛋白载体展示技术在单抗筛选中的可行性。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1细胞株、病毒株和实验动物细胞株 小鼠骨髓瘤细胞(Sp2/0)为本实验室保存；人恶性胚胎横纹肌瘤细胞(RD)购于ATCC；病毒株:EV71 JS-06-52-3 (GenBank:FJ600325.1)为C4亚型，来源于江苏省CDC；PSVA-EV71-Mp4为鼠适应株[16]，原型株为感染性克隆PSVA-EV71(GenBank:AB469182，Satoshi Koike博士惠赠)；实验动物:6～8周龄SPF级BALB/c雌鼠，14～18日龄SPF级BALB/c孕鼠，均购自上海斯莱克实验动物有限公司。

1.1.2主要试剂培养基 RPMI1640和MEM培养基均购自Gibco公司；细胞培养用胎牛血清(FBS)购自Invitrogen公司；弗氏不完全和弗氏完全佐剂购自Sigma公司；抗体纯化介质Protein A购自GE公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG及 TMB显色底物购自北京万泰生物药业有限公司。

1.2实验方法

1.2.1EV71 3D蛋白的预测及表达载体的构建 EV71 3D蛋白抗原预测 根据EV71 JS-06-52-3中非结构蛋白3D的序列信息，采用protean、IEDB、epitopia等软件对3D蛋白氨基酸序列进行亲疏水性和免疫原性分析。选取亲水性高，免疫原性强的氨基酸区段为候选展示肽段，由上海生物工程公司进行全基因合成。对合成的肽段进行上下游引物互搭，反应体系为48 μl水，上下游引物各1 μl，混合后于90℃反应4 min，然后置于70℃反应10 min，缓慢冷却至室温。将互搭好的片段插入到pC149/mut载体上，插入位点为BamHⅠ和EcoRⅠ[17]。将连接后的重组质粒转化ER2566菌株，挑取单克隆菌落进行PCR和测序鉴定(测序由英骏生物技术有限公司进行)，从而获得包含目的片段的阳性克隆。

1.2.2重组蛋白的表达、纯化与鉴定 将包含正确重组质粒的ER2566菌进行诱导表达，诱导表达条件为0.2 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在30℃诱导表达6 h。收集菌液于磷酸盐缓冲液(0.5 mmol/L EDTA，300 mmol/L NaCl，0.2 mol/L NaHPO4,0.2 mol/L NaHPO4,pH6.0)中重悬并进行超声破碎离心，将离心得到的上清组分经热变性(65℃，反应30 min)和饱和硫酸铵沉淀方法进行纯化，接着将纯化后的重组蛋白透析至10 mmol/L PBS缓冲液中，随后运用SDS-PAGE凝胶电泳和负染透射电镜观察鉴定。

1.2.3透射电镜观察与同源模建 将蛋白样品滴加到200目的铜栅上，吸附10 min，接着用纯水洗涤铜栅2次并晾干，最后用2%磷酸钨溶液负染铜栅15 min后直接进行电镜观察。运用软件以HBV衣壳蛋白(PDB:4G93)为模板进行3D模建。

1.7.3 脾细胞介导羊红细胞定量溶血分光度实验(QHS) 按照钟昕[8]方法，分别制备补体、SRBC悬液和脾细胞悬液。将0.25 mL SRBC，0.25 mL脾细胞悬液和0.25 mL补体混合，37℃反应60 min，3 000 r/min离心3 min，吸取上清测定413 nm吸光值。空白对照用生理盐水代替补体。

1.2.4单克隆抗体制备与纯化 将纯化好的重组蛋白按0、2、4和6周间隔免疫BALB/c小鼠，每种蛋白平行免疫5只小鼠，免疫剂量为100 μg/只，初次免疫使用弗氏完全佐剂，加强免疫时使用弗氏不完全佐剂，并在0、2、4、6和8周采血。在进行细胞融合前3D经脾脏对小鼠进行加强免疫，免疫剂量为50 μg/只。选取小鼠免疫后血清与免疫原亲和力高且能特异性结合EV71的小鼠脾细胞，按10∶1的比例与Sp2/0融合，采用差检ELISA法对杂交瘤细胞进行筛选，具体方法为：在融合后7 d，将待检培养上清一式两份，分别加入包被了重组蛋白和载体蛋白的ELISA板上，运用常规的间接ELISA法进行后续的检测，根据待检培养上清对重组蛋白的反应性与载体蛋白的反应性差异对杂交瘤细胞进行筛选，对重组蛋白反应为阳性同时对载体蛋白反应为阴性的杂交瘤细胞克隆判断为阳性。对检测阳性的克隆采用有限稀释法进行至少2次以上的克隆化，直到筛选出稳定的克隆株。将阳性克隆细胞进行扩增培养后注入小鼠腹腔，待小鼠腹部明显膨大，收集腹水，用辛酸-饱和硫酸铵沉淀和Protein A亲和层析纯化。

1.2.5单克隆抗体类型及亚类鉴定 采用Sigma公司的小鼠单克隆抗体分型试剂盒鉴定单克隆抗体的类型及亚类。首先，以纯化的免疫原包板，用PBS缓冲液稀释抗体，稀释策略为首孔1 μg/ml按2倍比梯度稀释8孔，加入100 μl稀释抗体至预先包被好的板中，37℃孵育1 h；其次，PBST缓冲液洗板3次后，分别加入50 μl HRP标记的羊抗鼠IgA、IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3，37℃孵育30 min；接着PBST缓冲液洗板3次后，每孔加入100 μl TMB底物，37℃孵育10 min；最后每孔加入50 μl终止液，在酶标仪上进行读数。

1.2.6单克隆抗体对病毒特异性鉴定 (1)间接免疫荧光试验:将13 mm×13 mm圆形玻璃片放入24孔板中，铺入1×106个/孔的RD细胞，实验组按MOI=0.1接种EV71；37℃感染12 h后，用4%多聚甲醛固定30 min并依次加入通透液、抗EV71单克隆抗体、GAM-FITC IgG和DAPI染液，封片后在荧光显微镜下进行结果观察。(2)ELISPOT法:将EV71接种于96孔板单层的RD细胞中，37℃培养至出现细胞明显病变，用0.2%戊二醛固定1 h后依次加入通透液、标记了HRP的抗EV71的单抗和等体积混合的A/B显色液，显色结束后，拍干显色液，用酶联斑点分析仪拍照及计数。(3)免疫组织化学染色法:首先用鼠适应株PSVA-EV71-Mp4对一日龄新生小鼠进行攻毒，将收集到的攻毒死亡或濒临死亡的动物进行初步解剖，暴露其组织器官并放入4%的福尔马林中固定72 h；充分固定后采集小肠和肌肉组织进行病理制片和检测[18,19]。

2 结果

2.1重组表达载体的构建 设计和合成编码EV71-3D(aa34-43)、EV71-3D(aa61-76)和EV71-3D(aa151-164)多肽区段的上下游引物，引物见表1，将上下游引物进行互搭获得相应的片段。接着，以本实验室构建的表达质粒pC149/mut为载体，在其免疫优势区插入EV71 3D蛋白相应区段(图1A)，通过PCR和测序鉴定，最终获得正确的pC149-3D(aa34-43)、pC149-3D(aa61-76)和pC149-3D(aa151-164)质粒。

2.2重组蛋白的表达、纯化与鉴定 重组大肠杆菌ER2566/pC149-3D和ER2566/pC149经0.2 mmol/L IPTG诱导6 h后得到表达，经鉴定主要以可溶形式表达于上清。接着用热变性、饱和硫酸铵沉淀等方法纯化获得重组蛋白。结果如图1B所示，HBc3D(aa34-43)、HBc3D(aa61-76)和HBc3D(aa151-164)目的蛋白条带大小符合预期，单体约20 kD,纯度高达95%，重组蛋白可形成明显的二聚体。负染电镜结果显示，纯化后的目的蛋白均能够很好地组装成VLP，颗粒大小和形态与对照蛋白HBc(aa1-149)颗粒类似，呈直径为30 nm左右大小均匀的完整的空心球体结构(图1C)。此外，同源建模结果显示，EV71-3D(aa34-43)、EV71-3D(aa61-76)和EV71-3D(aa151-164)多肽区段理论上可展示在颗粒的表面(图1D)。

2.3免疫小鼠多抗血清评价及杂交瘤细胞株的筛选 运用间接ELISA法检测各组小鼠的免疫血清对各自免疫抗原和对照抗原HBc(aa1-149)的特异性抗体滴度。结果见图2A和2B，免疫四针后嵌合表位肽融合蛋白诱导产生的总体抗体水平高于抗HBc(aa1-149)蛋白抗体；如HBc3D(aa34-43)蛋白免疫血清针对免疫抗原产生的总体抗体滴度为3.3×106，而针对HBc(aa1-149)蛋白的抗体滴度仅为3.8×104，表明HBc3D(aa34-43)免疫原可较好地诱导小鼠机体产生针对3D(aa34-43)表位的抗体。此外，运用IFA检测各组小鼠的免疫血清对EV71的结合活性，结果显示，仅HBc3D(aa34-43)蛋白免疫血清可特异性结合EV71感染的RD细胞(图2C)。根据以上实验结果，挑选HBc3D(aa34-43)蛋白免疫的小鼠进行细胞融合，以差检ELISA法对融合细胞进行筛选，最终获得1株稳定分泌单克隆抗体的细胞株，命名为3E1。

表1EV713D蛋白表位片段克隆引物序列

Tab.1SequenceofoligonucleotideprimerforEV713Depitopefragments

PrimerSequence3D(aa34-43)-FGATCCTTCGAGGGAAATAAGGAACCAGCTGTCTTGG3D(aa34-43)-RAATTCCAAGACAGCTGGTTCCTTATTTCCCTCGAAG3D(aa61-76)-FGATCCAAGTATGTGGGAAATACACTACATGAGCCTGACGAGTACATCAAAGAGG3D(aa61-76)-RAATTCCTCTTTGATGTACTCGTCAGGCTCATGTAGTGTATTTCCCACATACTTG3D(aa151-164)-FGATCCGATCTTCCTTACTCCACTTATGTCAAGGACGAGCTGCGCTCAG3D(aa151-164)-RAATTCTGAGCGCAGCTCGTCCTTGACATAAGTGGAGTAAGGAAGATCG

图1 重组克隆的构建及表位肽融合蛋白的性质分析Fig.1 Construction of chimeric HBc proteins and analysis of purified recombinant VLPsNote: A.Schematic presentation of the construct；B.SDS-PAGE analysis of purified recombinant proteins.Lane M.Molecular mass marker;Lane 1.HBc(aa1-149);Lane 2.HBc3D(aa34-43);Lane 3.HBc3D(aa61-76);Lane4.HBc3D(aa151-164);C.Electron microphotographs;D.Molecular modeling.EV71-3D(aa34-43),EV71-3D(aa61-76)and EV71-3D(aa151-164)epitopes located on the surface of HBc-VLPs colored by red,yellow and blue.

2.4单克隆抗体性质鉴定 (1)单抗的类型及亚类鉴定:使用小鼠单克隆抗体分型试剂盒对单克隆抗体3E1进行亚型鉴定，结果发现其属于IgG2a亚型。(2)间接免疫荧光验证单抗:检测结果显示，感染EV71的RD细胞显示出较亮的绿色荧光，而未感染病毒的细胞则未观察到绿色荧光反应，见图3A。(3)ELISPOT检测:结果如图3B显示，接种EV71的RD细胞显示出蓝色的病变斑，而未感染病毒的细胞则未观察到病变斑，且单抗3E1稀释至 2.5 μg/ml 时仍可特异性结合EV71。(4)单抗在受

图2 免疫小鼠多抗血清评价Fig.2 Evaluation antiserum of immune miceNote: A.HBc3D(aa34-43),HBc3D(aa61-76)and HBc3D(aa151-164)as coated proteins respectively to detect the antibodies of antiserum;B.HBc(aa1-149)as coated protein as a control;C.Detection EV71 in RD cells by immunofluorescence assay using the antiserum.

图3 单克隆抗体3E1性质鉴定Fig.3 Reactivity of anti-EV71-3D mAb 3E1 with EV71Note: A.Immunofluorescence assay of EV71 infected RD cells;B.Elispot assay of EV71 infected RD cells;C..Immunohist-ochemistry staining assay of pSVA-EV71-MP4 infected and uninfected mice tissues with 3E1.

感染小鼠组织中的免疫组织化学染色:将攻毒后5～8 d 发生肢体瘫痪或死亡的乳鼠组织进行免疫组织化学(IHC)检测，结果如图3C所示，在感染EV71小鼠的小肠和肌肉中检测到病毒阳性信号，而在阴性小鼠组织中未发现阳性信号。间接IFA、ELISPOT检测和免疫组织化学染色实验结果均表明单抗3E1可特异性结合EV71。

3 讨论

手足口病是一种由人肠道病毒引起的全球性传染病，常见于5岁以下的婴幼儿。其临床症状主要为手、足和口等部位出现水泡样溃疡或皮疹，重症患者可引发严重的神经系统疾病，甚至死亡。手足口病的重症和死亡病例主要由EV71感染引起的，目前尚无特效治疗药物，且对EV71的致病机制尚未完全明了。EV71主要由RNA、结构蛋白和非结构蛋白组成，其中非结构蛋白3D是RNA多聚酶的主要组分，可催化VPg蛋白尿苷酸化，参与病毒的复制过程。鉴于其在病毒生命周期中的重要的作用[14,15]，获得稳定、可靠的抗3D蛋白的单克隆抗体是进一步研究该蛋白作用机制的重要基础。

从病毒颗粒中纯化天然蛋白或利用基因工程技术表达全长的重组蛋白，特别是一些分子量较大的蛋白，常需耗费较长的时间去摸索表达与纯化的策略；且当外源蛋白进入机体时，机体免疫应答并非通过识别完整的蛋白分子而发挥功能，往往识别的位点仅仅是外源蛋白的某一小区段，如抗原表位。但多肽表位分子量小，半衰期短，单独使用时免疫原性较弱，因此常借助表位展示载体的辅助作用增强其稳定性和免疫原性。类病毒颗粒如HBV-VLPs被认为是较理想的展示外源表位的运载工具。它不仅在体外可自发组装成类病毒颗粒，还可将表位展示在颗粒的表面，充分暴露表位的分布密度以增强其免疫原性。此外，如今运用生物信息学工具预测蛋白质的优势表位，已广泛应用于蛋白质表位的分析与鉴定[20,21]。因此，我们认为结合生物信息学和类病毒颗粒载体展示技术，能够作为一种快速、高效地筛选识别特定表位肽，并用于制备针对大分子量蛋白的单克隆抗体的重要技术策略。

基于此，本研究将生物信息学技术与HBc颗粒型蛋白载体展示技术相结合，并运用常规的杂交瘤技术筛选出针对EV71 3D蛋白的单克隆抗体3E1，抗体性质鉴定结果显示其能特异性结合EV71病毒，为进一步研究蛋白的功能奠定了基础。

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[收稿2017-01-11 修回2017-02-28]

(编辑 张晓舟)

Preparationofmonoclonalantibodiesagainst3DproteinofEV71basedonHBcparticlesasexpressionvector

LIYong-Chao,ZHURui,XULong-Fa,WUYang-Tao,ZHAOHuan,WUKun,LIUDong-Xiao,CHENGTong,XIANing-Shao.

StateKeyLaboratoryofMolecularVaccinologyandMolecularDiagnostics,NationalInstituteofDiagnosticsandVaccineDevelopmentofInfectiousDisease,SchoolofPublicHealth,XiamenUniversity,Xiamen361102，China

Objective:To prepare and preliminarily identify the monoclonal antibodies(mAbs) specifically against 3D protein of Enterovirus 71(EV71),using bioinformatics to predict the epitopes of 3D,with HBc protein as a carrier.Methods: Artificial screening of 3D protein epitope sequences by bioinformatic method,inserted into the major immunodominant region(MIR) area of Hepatitis B virus core protein(HBc),to construct the recombinant protein.BALB/c mice were immunized with the recombinant virus like particles(VLPs),to prepare the mAbs against 3D protein of EV71.Affinity chromatography technology was used to purify the mAb.The indirect ELISA,ELISPOT,immunofluorescence and immunohistochemistry staining methods were used to identify the characteristic of the mAb.Results: We displayed 3D(aa34-43),3D(aa61-76) and 3D(aa151-164) epitopes by constructing fusion protein using HBc VLPs as a vector,after hybridization,one positive hybridoma cell line(3E1) was selected by ELISA.The isotype of 3E1 was IgG2a.The results of immunofluorescence and immunohistochemistry staining assay showed that the mAb 3E1 could specifically recognize EV71.Conclusion: The prepared mAb 3E1 can specifically recognizes the EV71,which laid the foundation for the detection of virus and further study on 3D protein,and verified the bioinformatics technology combined with HBc carrier displaying peptides could prepare mAb quickly and efficiently.

Hepatitis B virus core protein;Enterovirus 71;Non-structural protein 3D;Monoclonal antibody

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.09.013

①本文受国家自然科学基金项目(No.31670933，No.81371817)资助。

李永超(1993年-)，男，实验员，主要从事肠道病毒功能方面的研究，E-mail:18850569602@163.com。

及指导教师：程 通(1977年-)，男，博士，副教授，硕士研究生导师，主要从事分子病毒学研究，E-mail:tcheng@xmu.edu.cn。

R392.11

A

1000-484X(2017)09-1341-05