秦七风湿方水提液和醇提液对巨噬细胞功能的影响△

周瑞，刘东，唐志书*，宋忠兴，桂蓁蓉，葛秋萍，陈永琴

(1.陕西中医药大学 陕西省中药资源产业化协同创新中心 陕西省中药基础与新药研究重点实验室，陕西 咸阳 712083；2.咸阳市实验中学，陕西 咸阳 712000)

·基础研究·

秦七风湿方水提液和醇提液对巨噬细胞功能的影响△

周瑞1，刘东1，唐志书1*，宋忠兴1，桂蓁蓉2，葛秋萍2，陈永琴2

(1.陕西中医药大学 陕西省中药资源产业化协同创新中心 陕西省中药基础与新药研究重点实验室，陕西 咸阳 712083；2.咸阳市实验中学，陕西 咸阳 712000)

目的：研究秦七风湿方水提液和醇提液对巨噬细胞RAW264.7增殖和分泌一氧化氮(NO)的影响。方法：采用水煎煮和乙醇超声分别制备秦七风湿方水提液和醇提液，通过HPLC测定水提液和醇提液指标性成分含量；利用CCK-8研究水提液和醇提液对RAW264.7增殖的影响；通过Greiss法测定水提液和醇提液对巨噬细胞分泌NO的影响。结果：含量测定发现醇提液的指标性成分含量高于水提液，说明不同提取溶剂所得秦七风湿方指标性成分具有差异；水提液和醇提液对RAW264.7增殖的影响呈现浓度依赖性，具有促进和抑制的作用；水提液和醇提液对LPS诱导的巨噬细胞分泌NO具有显著的抑制作用。结论：通过研究发现秦七风湿方水提液和醇提液对RAW264.7增殖和分泌NO均具有一定的影响，呈现浓度依赖性，并且初步证实了水提液和醇提液均具有一定的抗炎活性，为将其发展为治疗RA的临床新药提供理论参考。

秦七风湿方；巨噬细胞；一氧化氮

2.XianyangShiShiyanMiddleSchool，Xianyang712000，China)

类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种累及周围关节为主的炎症性自身免疫疾病，属中医“痹症”范畴[1-2]。目前临床上用于治疗RA的化学药主要有非甾体抗炎药、糖皮质类激素类药，由于这些药物长期服用会引起肝肾损害等毒副作用，达不到理想的治疗效果[3]。以辨证论治为主的中药复方在抗RA方面具有良好的抗炎、镇痛及免疫调节等作用[4]。组方自陕西太白“七”药的秦七风湿方是由珠子参、秦艽、山茱萸组成，是陕西中医药大学杨秀清教授的临床经验方，在临床上以汤剂应用多年，已被证实具有益气养阴、祛风止痛之功效，对类风湿关节炎具有显著疗效。秦七风湿方中珠子参(扣子七)为五加科人参属植物，为方中君药，已被证实具有多种药理活性[5]。《全国中草药汇编》中记载“珠子参主治跌打损伤、风湿关节痛、胃痛，外用治外伤出血。”秦艽具有宣痹止痛、舒筋活络之功效，已被应用于多个治疗类风湿关节炎的复方制剂中[6]。《本经》中指出秦艽“主寒热邪气、寒热风痹，肢节痛。”《别录》中提到秦艽“功在舒经通络，流利关节，惟治痹痛痉挛之症。”秦艽与方中君药珠子参相伍，协同君药通痹止痛，为方中臣药。山茱萸具有多种药理活性[7]，已有研究发现其对类风湿关节炎具有治疗作用[8]。《医学衷中参西录》中指出山茱萸“大能收敛元气，振作精神，固涩滑脱，敛正气而不敛邪气”，《本经》中指出其具有逐寒湿痹的作用。山茱萸为方中佐使药，一方面协同君臣之味，以逐寒湿痹痛；另一方面山茱萸具有补肝肾、敛元气、振作精神之效，与具有补肺养阴之功的珠子参相伍，共同达到补益肺肾之气、养肺肾之阴的作用，使元气充盛、气血流畅、痹痛自除；另外山茱萸又酸敛固脱，防珠子参、秦艽湿燥之性。秦七风湿方中虽三药相伍，但配伍精当，补而不腻，温而不燥，凉而不寒，环环入扣，共奏益气养阴、补益肺肾、舒经通络、宣痹止痛之效，达到了元气充盛，风、寒、湿、热痹自愈的目的。由于该方作用于RA的机制尚不清楚，限制了其广泛应用。

巨噬细胞是机体免疫系统不可缺少的功能细胞，在RA的病理进程中起着重要的作用[9]。巨噬细胞能够一方面迅速识别并清除如病原微生物和变异自身产物，同时也能够将所吞噬的物质进行降解，将其中的抗原递呈给T淋巴细胞，执行抗原递呈细胞的功能。巨噬细胞发挥吞噬和细胞内降解作用，均离不开其被活化后分泌的一氧化氮(nitric oxide，NO)及一系列细胞因子的作用。NO是巨噬细胞对病原体和肿瘤细胞产生毒活性的效应分子，活化的巨噬细胞通过分泌NO进一步介导机体的炎症反应[10]。课题组前期基于分离技术对秦七风湿方的制备[11]、指标性成分差异[12]及物理化学[13]进行了研究。本文采用水溶液提取和醇溶液提取，开展秦七风湿方水提液和醇提液的指标性成分含量测定，并进一步研究了秦七风湿方水提液和醇提液对巨噬细胞增殖和分泌NO的影响，阐明不同提取技术制备的秦七风湿方指标性成分差异，初步证明秦七风湿方的抗炎活性，为将其发展为治疗RA的临床药物提供理论参考。

1 材料与仪器

1.1 材料

试验用珠子参、秦艽、山茱萸饮片均购于西安盛兴中药饮片有限公司，符合《中华人民共和国药典》2015版相关规定；对照品竹节参皂苷Ⅳa、莫诺苷、龙胆苦苷和马钱子苷(中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号依次为20140518、20151024、20151021、20141108)；甲醇、乙腈均为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器

HH-2型电热恒温水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司)；KQ-300DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；OSB-2100油浴锅(上海爱朗仪器有限公司)；Aglient Hplc.1260；Aglient 7C-C18(2)；FW-1000AD高速万能粉碎机；FA21040N型电子天平(德国塞多利斯公司)；D101型电热鼓风干燥箱(北京科伟永鑫实验仪器设备厂)；GQ76管式分离机(上海市离心机械研究所有限公司)。

2 方法

2.1 秦七风湿方的提取

2.1.1 水提取液制备 按照处方比例称取秦七风湿方药材共400 g，置1000 mL烧杯中，加入一定量的水共煎煮3次，每次煎煮2 h，过滤，合并滤液，并将所得滤液浓缩至400 mL量瓶中定容，得到质量浓度为1 g·mL-1的生药，所得的药液置于高速离心机内，20 000 r·min-1离心15 min，弃去沉淀物，将上清液冷冻干燥为干粉，备用。

2.1.2 醇提取液制备 按照处方比例称取秦七风湿方药材共400 g，将药品进行粉碎，分置两个500 mL锥形瓶中，加入一定量的乙醇共超声3次，每次超声30 min，抽滤，对滤液进行旋蒸，直至成油状物，放置在阴凉处进行保存，备用。

2.2 HPLC测定各指标

2.2.1 HPLC测定竹节参皂苷IVa含量 色谱柱：Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)；检测波长：203 nm；流速：1.0 mL·min-1；流动相：乙腈-0.2%磷酸(35∶65)；柱温：25 ℃。理论塔板数按竹节参皂苷IVa峰计算应不低于3 000[14]271-272。

2.2.2 HPLC测定龙胆苦苷含量 色谱柱：Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)；检测波长：254 nm；流速：1.0 mL·min-1；流动相：乙腈-0.1%醋酸溶液(35∶65)；柱温：25 ℃。理论塔板数按龙胆苦苷峰计算应不低于3000[14]270-271。

2.2.3 HPLC测定马钱苷和莫诺苷含量 色谱柱：Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)；检测波长：240 nm；流速：mL·min-1；流动相：0～20 min，乙腈-0.3%磷酸溶液(7∶93)，20～50 min，乙腈-0.3%磷酸溶液(7→20∶93→80)；柱温：25 ℃。理论塔板数按马钱苷峰计算应不低于3000[14]27-28。

2.2.4 对照品溶液的制备 精密称取对照品竹节参皂苷IVa、龙胆苦苷、马钱子苷及莫诺苷适量，配制成1.0 g·L-1的对照品溶液，备用。

2.2.5 供试品溶液的制备 精密称取适量的秦七风湿方水提液和醇提液药品干粉，配成1.0 g·L-1的溶液，过0.22 μm无机过滤膜，取续滤液备用。

2.3 细胞实验

2.3.1巨噬细胞RAW264.7的培养 小鼠巨噬细胞RAW264.7(上海中科院细胞库)，培养RAW264.7 的完全培养基组成为 90%RPMI1640培养基、10%胎牛血清及1% 100 U·mL-1、100 mg·L-1青链霉素，培养条件为37 ℃，5% CO2培养箱。

2.3.2 细胞活力测定 将培养良好的巨噬细胞RAW264.7细胞传代接种于96孔板中(2×105个细胞/孔)，放入37 ℃，5%CO2的培养箱中培养4 h，之后弃去上清液，设对照组(无血清培养基)、加药组。各加药组分别加入5～1000 mg·L-1的水提药液和醇提药液，24 h后，向各孔中加入0.5 mg·L-1CCK-8试剂，1 h后用酶标仪在450 nm波长处检测其吸光值。

2.3.3 秦七风湿方对巨噬细胞分泌NO的影响 将培养良好的巨噬细胞RAW264.7细胞传代接种于96孔板中(2×105个细胞/孔)，4 h之后弃去上清液，设对照组(无血清培养基)、加药组。各加药组分别加入含有5～1 000 mg·L-1的水提液和醇提液的无血清培养基，24 h后，取细胞上清液50 μL。利用Griess法测定NO的浓度，取50 μL细胞上清置于96孔板中，先给各孔加入50 μL磺胺(Sulfanilamide，Sul)，再加入50 μL萘基乙烯己二胺(N-1naphthylethylenediamine dihydrochloride，NED)试剂，用酶标仪在550 nm波长处检测其吸光度值。

2.3.4 秦七风湿方对LPS诱导的巨噬细胞分泌NO的影响 将培养良好的RAW264.7细胞进行传代接种于96孔板中(细胞数：2×105个/孔)，4 h后弃去上清液，设对照组(无血清培养基)、LPS组(1 mg·L-1LPS )、LPS加药组(1 mg·L-1LPS+不同浓度各药品)。先给各加药组孔中加入不同浓度的秦七风湿方水提和醇提药液，孵育2 h后，再加入 1 mg·L-1LPS，20 h后取细胞上清液，利用Griess法测定NO的生成(步骤见2.3.3)。

3 结果

3.1 HPLC法测定秦七风湿方各指标性成分含量

通过HPLC测定秦七风湿方水提液和醇提液中竹节参皂苷Ⅳa、龙胆苦苷、马钱子苷、莫诺苷的含量，结果见表1，除马钱子苷之外，醇提液各指标性成分含量均高于水提液。

表1 秦七风湿方水提液和醇提液各指标性成分含量 %

3.2 秦七风湿方水提液和醇提液对巨噬细胞增殖的影响

秦七风湿方水提液(ST)对RAW264.7增殖的影响，结果如图1 A所示，与对照组(Ctrl)相比，5 mg·L-1的水提液表现出促增殖的作用(***P<0.001)，10～25 mg·L-1水提液对细胞增殖无显著影响(NS)，当质量浓度高于50 mg·L-1，水提液对细胞增殖表现出不同程度的抑制作用(*P<0.05，*P<0.01，***P<0.001)，1000 mg·L-1水提液对细胞增殖的抑制率达91.7%。醇提液(CT)对RAW264.7增殖的影响如图1 B所示，与对照组(Ctrl)相比，5～25 mg·L-1的醇提液对细胞增殖无明显影响(NS)，50～500 mg·L-1醇提液对细胞增殖表现出不同程度的促进作用(*P<0.05，*P<0.01，***P<0.001)，1 000 mg·L-1醇提液抑制细胞增殖，抑制率为34.2%。由此结果可知，秦七风湿方水提液和醇提液对巨噬细胞增殖具有促进或者抑制作用，影响呈现浓度依赖性。在相同质量浓度下，以1 000 mg·L-1为例，秦七风湿方水提液对巨噬细胞表现出比醇提液更大的毒性，导致此结果的原因还有待进一步研究。

注：A.水提液；B.醇提液；*P < 0.05，*P< 0.01， ***P< 0.001；下同。图1 秦七风湿方对巨噬细胞增殖的影响

3.3 秦七风湿方水提液和醇提液对巨噬细胞自身分泌NO的影响

利用Greiss法测定了秦七风湿方水提液和醇提液对巨噬细胞分泌NO的影响。结果如图2A所示，与对照组(Ctrl)相比，25～100 mg·L-1的水提液对巨噬细胞自身分泌NO无显著影响(NS)，250 mg·L-1水提液对细胞自身分泌NO具有抑制作用(*P< 0.05)；另外，25～250 mg·L-1醇提液对细胞分泌NO具有显著的抑制作用(*P< 0.05，*P< 0.01，***P< 0.001)，高浓度的醇提液(500 mg·L-1)无显著影响(NS)(见图2 B)。此结果表明醇提液与水提液对细胞自身分泌NO的影响不同，很可能是由于两者成分的差异导致的，还需要进一步的研究证实不同提取方法对秦七风湿方生物活性的影响。

图2 秦七风湿方对巨噬细胞分泌NO的影响

3.4 秦七风湿方水提液和醇提液对LPS诱导的巨噬细胞分泌NO的影响

通过秦七风湿方水提液和醇提液对巨噬细胞增殖以及自身分泌NO的影响，筛选出了质量浓度5、10、25 mg·L-1，进一步研究秦七风湿方水提液和醇提液对脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞分泌NO的影响，初步探索其抗炎活性。与空白对照相比，各个组产出NO的相对值结果如图3所示，1 mg·L-1的LPS可以显著激活巨噬细胞分泌NO(A，B)，5、10、25 mg·L-1的水提液和醇提液对LPS诱导的NO生成具有显著的抑制作用，并且呈现浓度依赖性(***P<0.001)，通过计算得出不同浓度水提液对LPS诱导的NO抑制率分别为51%、58%、77%，醇提液的抑制率为57%、59%、77%。由此结果可以看出，在低质量浓度(5 mg·L-1)时醇提液的抑制活性更为明显，而高质量浓度下水提液和醇提液对LPS诱导的NO抑制活性无明显差异，表明秦七风湿方水提液和醇提液均对LPS诱导的巨噬细胞炎症模型表现出一定的抗炎活性。NO只是机体的炎症介质之一，要深入探索秦七风湿方的抗炎活性还需要进一步的研究。

图3 秦七风湿方LPS诱导的巨噬细胞分泌NO的影响

4 结论

秦七风湿方是由珠子参、秦艽、山茱萸3味中药组成，在临床已应用多年，已被证实具有益气养阴、祛风止痛的作用，对类风湿关节炎具有显著疗效。本文采用HPLC研究秦七风湿方水提液和醇提液指标性成分含量，发现了已测的4个指标性成分，除马钱子苷外，在醇提液中的含量均大于水提液，这很有可能是由于水提取能够提出更多水溶性的多糖及大分子成分，而导致指标性成分含量相对较低。通过细胞增殖的实验，我们发现秦七风湿方水提液和醇提液对巨噬细胞增殖呈现显著的质量浓度依赖性，随着质量浓度的变化，对巨噬细胞具有一定的促增殖和抑制增殖的作用。并且在相同质量浓度下，秦七风湿方水提液比醇提液对增殖抑制作用更为明显，引起此结果的原因还有待进一步研究。本文研究还发现水提液各浓度对巨噬细胞自身分泌NO影响不大，而醇提液低浓度表现出抑制NO的作用，表明在相同质量浓度下，秦七风湿方醇提液对巨噬细胞自身分泌NO的影响更为明显。最后，通过LPS诱导巨噬细胞构建炎症细胞模型，我们初步证明了秦七风湿方水提液和醇提液各浓度对LPS诱导的巨噬细胞分泌NO具有显著的抑制作用，此抑制作用呈现浓度依赖性。有趣的是在一定的质量浓度下，秦七风湿方醇提液对巨噬细胞增殖、自身分泌NO以及LPS诱导的NO均表现出优于水提液的活性，导致此结果的原因是否是由于醇提液中已测的指标性成分竹节参皂苷Ⅳa、龙胆苦苷、莫诺苷含量高于水提液，还需要进一步研究证实。本文结果表明秦七风湿方水提液和醇提液均具有一定的抗炎活性，并且呈现质量浓度依赖性。本文的研究为将秦七风湿方发展为治疗RA的临床新药提供理论参考。

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EffectofQinqiRheumatismFormulaAqueousExtractandEthanolExtractonCellFunctionofMacrophage

ZHOURui1，LIUDong1，TANGZhishu1*，SONGZhongxing1，GUIZhenrong2，GEQiuping2，CHENYongqin2

(1.ShaanxiUniversityofChineseMedicine/ShaanxiCollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrialization/ShaanxiProvinceKeyLaboratoryofNewDrugsandChineseMedicineFoundationResearch，Xianyang712083，China；

Objective：To study the effect of Qinqi Rheumatism formula aqueous extract and ethanol extract on the proliferation and production of nitric oxide (NO) with RAW264.7 macrophage.Methods：Qinqi Rheumatism formula aqueous extract and ethanol extract were prepared through aqueous decoction and ethanol ultrasonic respectively，the index components of aqueous extract and ethanol extract were detected by HPLC.The effect of aqueous extract and ethanol extract on the proliferation of RAW264.7 was evaluated using the CCK-8 assay.The effect of aqueous extract and ethanol extract on the secretion of NO was measured by the Griess reaction method.Results：The index components of ethanol extract were higher than those of aqueous extract，which showed the differences of the index components of Qinqi Rheumatism formula prepared by different extraction solvents.The aqueous extract and ethanol extract promoted or inhibited the proliferation of RAW264.7 in a dose-dependent manner.The inhibitory effect of the aqueous and ethanol extract in the production of NO in LPS-stimulated RAW264.7 was found.Conclusion：The effects of the aqueous extract and ethanol extract of Qinqi Rheumatism formula on the proliferation and secretion of NO in RAW264.7 was found in a dose-dependent manner，and the anti-inflammatory activity of aqueous extract and ethanol extract was confirmed preliminarily.This study will provide theoretical basis for developing Qinqi Rheumatism formula as a new drug for the treatment of RA.

Qinqi Rheumatism formula；macrophage；nitric oxide

陕西省教育厅专项科研计划项目(16JK1214)；陕西省重点科技创新团队(2012KTC-20)；陕西省科技资源开放共享平台项目(2015FWPT-01)

] 唐志书，教授，研究方向：中药新产品研发与中药制备新技术的应用研究；Tel:(029)38185060，E-mail:tzs6565@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.6.010

2016-10-20)

*[