封闭式薄片法在睾丸单精子冷冻保存中的应用探索

马超+胡明广+金波

[摘要]目的 探讨封闭式薄片法对梗阻性无精子症（OA）患者睾丸单精子的冷冻效果，以期为非梗阻性无精子症（NOA）患者单精子冷冻保存提供一种简单有效的方式。方法 选取2016年6～12月在大连市生殖与遗传医学中心诊断为OA 15例患者作为研究对象，应用封闭式薄片法冷冻方式对睾丸单精子进行冷冻保存。睾丸冷冻精子解冻复苏后（冷冻组），对体外成熟（IVM）卵子行卵胞浆内单精子显微注射技术（ICSI），统计其受精率与卵裂率，并与睾丸新鲜精子（新鲜组）ICSI进行比较，以期对睾丸单精子解冻后受精能力进行评估。冷冻组及新鲜组精子均来自上述15例患者。结果 应用封闭式薄片法对睾丸单精子进行冷冻，解冻后具有很高的精子回收率与存活率（92.00%，65.94%）。冷冻组与新鲜组具有相似的受精率（56.00% vs. 70.66%）和卵裂率（97.44% vs. 95.83%），两组差异无统计学意义（P>0.05）。结论 封闭式薄片法玻璃化冷冻方式可有效保存OA患者睾丸单精子，且精子复苏后具有较高的受精能力，为NOA患者单精子冷冻保存应用于临床奠定了实验基础。

[关键词]睾丸单精子；冷冻保存；无精子症；回收率

[中图分类号] R321.33 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）08（c）-0019-04

[Abstract]Objective To investigate the effect of Closed-Sheet Method on testicular spermatozoa in patients with obstructive azoospermia（OA），in order to provide a simple and effective cryopreservation for individual numbers of testicular spermatozoa in patients with non-obstructive azoospermia（NOA）.Methods 15 patients were diagnosed with OA by Reproductive Medicine & Genetic Center of Dalian from June to December 2016.Single testicular spermatozoa was frozen with Closed-Sheet Method，and we compared cleavage rate and fertility rate after ICSI between frozen-thawed individual numbers of testicular spermatozoa and fresh testicular sperm with abandoned in vitro maturation of immature oocytes，and the fertilization rate of frozen-thawed testicular spermatozoa was evaluated.Both frozen and fresh groups were from the above 15 patients.Results The frozen-thawed individual numbers of testicular spermatozoa had higher recovery rate and viability rate（92.00%，65.94%） with the Closed-Sheet Method.The fertility rate （56.00% vs 70.66%）and cleavage rate （97.44% vs 95.83%） of frozen testicular spermatozoa was similar to fresh testicular sperm after ICSI，and no significant difference（P>0.05）.Conclusion Since the frozen-thawed testicular spermatozoa had a higher ability of fertilization.The Closed-Sheet Method was effective to cryopreserve individual numbers of testicular spermatozoa in patients with OA.This study laid the experimental basis for the clinical application of single sperm cryopreservation in patients with NOA.

[Key words]Individual numbers testicular spermatozoa；Cryopreservation；Azoospermia；Recovery rate

隨着Bung等[1]1953年成功对人类精子进行冷冻保存，精子冷冻技术在当今发展已趋于成熟，可作为不孕不育患者的一种常规辅助生育手段。然而对于无精子症患者睾丸精子的冷冻保存，尤其是对非梗阻性无精子症（nonobstructive azoospermia，NOA）患者来说，采用常规精液冷冻保存技术往往不能达到满意的效果[2]。为了避免取卵日因睾丸取精失败而取消周期，同时避免反复睾丸活检对睾丸功能的损伤，对睾丸微量精子甚至单精子进行冷冻保存具有重要意义。在笔者以往的研究中，应用封闭式薄片法对正常精液标本微量精子进行冷冻并取得成功[3]。本研究进一步将此方法运用到OA患者睾丸单精子的冷冻保存中，观察解冻后精子的相关指标以及受精能力，以期为NOA患者单精子冷冻保存应用临床打下实验基础。endprint

1资料与方法

1.1研究对象

选取2016年6～12月在本中心男科门诊接受睾丸活检的15例OA患者作为研究对象，活检后剩余精子作为研究标本。其中2例有睾丸炎病史，其余均为原因不明的无精子症。OA的诊断标准为3次射出精液离心沉淀后未见到精子，经皮睾丸精子抽吸术（testicular spermextraction，TESA）后，均可见精子。所有患者染色体检查均为46，XY（3例小Y，1例大Y），性激素测定均在正常范围之内。体外成熟（in vitro maturation，IVM）卵子来源于同期卵胞浆内单精子显微注射技术（ICSI）周期。本研究经大连市妇女儿童医疗中心伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2研究方法

1.2.1 TESA精子获取 若采卵日（ICSI）周期获取未成熟卵子较多（大于10枚），告知男科医师次日上午行TESA活检术，活检标本（新鲜组）部分直接用与IVM卵子ICSI；部分冷冻保存，日后解冻（冷冻组）用于IVM卵子ICSI。活检具体步骤如下：常规皮肤消毒，用5 ml注射器吸入少量培养液后经阴囊皮肤穿刺刺入睾丸，抽吸针管获得少许睾丸组织，将睾丸组织送实验室检查，解剖显微镜下用1 ml注射器撕碎分开生精小管，G-MOPS-plus（Vitrolife）中清洗2遍，尽量多地去除红细胞，然后用吸管反复吹打混匀，吸入离心管，混悬液1000 r/min离心5 min，留取沉淀，培养箱中孵育后备用。

1.2.2冷冻载体的制备 冷冻载体是由手工裁剪聚丙烯薄片和常规精子冷冻管组成。具体构造见文献[3]。

1.2.3睾丸精子冷冻及复苏 ①冷冻前准备：注射皿（BD FALCON 1006）中做好50 μl长条液滴，矿物油覆盖，巴斯特吸管吸取约5 μl的离心后沉淀，加入液滴下端，置于37℃预温5 min。②冷冻过程：使用显微操作系统（RI-Integra Ti）从精子微液滴中吸取10根活力较好精子，冷冻薄片置于100 mm皿（BD FALCON 3003）中，用移液枪将1.0 μl含10%人血清清蛋白的HEPES缓冲液加在冷冻薄片前段，同时快速将注射针落入冷冻微滴中，并将吸入精子注入微液滴中，立即用无菌镊子将冷冻薄片夹入精子冷冻管中，旋紧螺帽，液氮上方1 cm熏蒸2 min，随即投入液氮中保存。③复苏前准备：将3 ml矿物油倒入培养皿中（BD FALCON 3001），置于37℃培养箱中预温备用。④复苏过程：将精子冷冻管从液氮中取出，旋开螺帽，用镊子将冷冻薄片夹出，迅速浸入37℃矿物油中复苏。37℃培养箱中孵育5 min，随即可对复苏后精子进行评估。

1.2.4精子复苏后相关指标评估 解冻复苏后对精子回收率、活动率及存活率进行评估。具体评估方式如下：精子回收率=回收精子数/冷冻精子数；精子活动率=（前向运动精子数+非前向运动精子数）/回收精子数；精子存活率（低渗肿胀实验）=尾部卷曲精子数/回收精子数。

1.2.5超促排卵及卵子的获取 超促排卵采用超长方案、长方案和短方案[4]，当有≥2个优势卵泡直径20 mm时，注射绒毛膜促性腺激素（HCG）10 000 IU，36 h后行阴道B超引导下穿刺取卵术。

1.2.6 IVM卵子收集、受精及卵裂情况 对采卵首日ICSI周期获取卵子行剥除颗粒细胞后，一旦发现MI期或GV期卵子，转移至G-IVF-plus（Vitrolife）培养液中过夜培养，次日上午观察极体排出情况，若发现第一极体排出，则可用于ICSI。冷冻组精子选择：解冻后挑选形态正常活动或不动精子行ICSI，不动精子经低渗肿胀实验后，选取尾部卷曲精子行ICSI。新鲜组精子选择：挑选形态正常活动精子行ICSI。ICSI具体步骤按本中心常规操作。ICSI后16～18 h观察受精情况，正常受精标准为双原核（2PN）出现。ICSI后40～42 h观察卵裂情况，2细胞以上视为发生卵裂。

1.3统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件对数据进行分析，计数资料以率表示，比较采用χ2检验分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1睾丸单精子冷冻复苏后相关指标

15例患者TESA后均见活动精子，睾丸单精子冷冻解冻后回收率、活动率与存活率分别为92.00%（138/150）、16.67%（23/138）、65.94%（91/138）。

2.2两组ICSI结果的比较

两组受精率、2PN率和卵裂率差异均无统计学意义（P>0.05）（表1）。

3讨论

ICSI技术结合显微外科取精术解决了大多数男性无精子症患者的生育问题，但对NOA患者来说，首次手术取精成功后，再次取精仍然有30%失败风险[5]，因此对第一次活检找到的微量睾丸精子进行冷冻保存，显得十分必要。虽然人类精子冷冻技术在1953年经Bung等[1]研究获得成功，并已经在辅助生殖技术中常规开展，但对来自NOA患者的睾丸精子，因为获取数量少，精子活力低，且精子成熟度差等原因，常规精液冷冻保存技术往往无法达到冻存要求。因此，找到一种合适的冷冻方法对微量精子甚至是单精子进行冷冻保存，已经成为辅助生殖技术中的一个函待解决的问题。

随着玻璃化冷冻技术的发展与完善，人们逐渐认识到可通过玻璃化冷冻方式对精子进行冷冻和复苏[6-9]。现有研究资料显示，国内外研究者采用空透明带冷冻法[10]、冷冻环法[11]、微麦管法[12]、ICSI针法[13]、冷冻薄膜及Cell sleeper法[7]，极体活检针法[14]等方式对微量精子进行冷冻保存。根据冷冻方法不同，精子复苏后回收率可达59%～100%，存活率可达8%～85%[14]。但上述方法由于可操作性差和儲存安全性低等原因，很难常规在临床上开展应用。我们过去尝试应用封闭式薄片法对正常精液标本单精子进行冷冻并取得成功[3]，大大改善了冷冻可操作性和储存安全性，并获得了较高的精子回收率与存活率。同时比较了冷冻保护剂与无冷冻保护剂对微量精子的冷冻效果，结果显示，二者具有相似的冷冻效果。本研究进一步将此方法运用到睾丸单精子的冷冻保存中，采用无冷冻保护剂玻璃化冷冻的方式，同样获得了较高的精子回收率和存活率。endprint

值得注意的是，睾丸精子解冻复苏后活动率极低，基本无前向运动精子，活动精子均表现为尾巴偶尔轻轻摆动，需在镜下仔细长时间观察方可发现。究其原因，首先由于睾丸精子未经过在附睾的进一步成熟过程，精子细胞膜尚未完全成熟，抗冻能力较差。其次，通过TESA获得的睾丸组织混有少量血细胞和大量死亡精子碎片等杂质，且睾丸精子缺少精浆的保护，导致其易造成冷冻损伤，解冻后活动能力下降。

近来国内外文献报道传统方式冷冻睾丸精子解冻后行ICSI能取得与新鲜睾丸精子相似的受精率及临床妊娠率[15-16]。但国内外对睾丸单精子冷冻解冻后ICSI结局报道较少，Walmesly等[10]和Endo等[7]成功对睾丸单精子进行冷冻保存，并获得了较高的受精率与卵裂率。本研究结果显示，应用封闭式薄片法冷冻睾丸单精子，精子解冻后仍然具有较高的受精能力，与睾丸新鲜组比较后发现，冷冻组受精率虽然低于新鲜组，但两组受精率和卵裂率差异无统计学意义，我们的实验结果与国外报道基本一致。

此外，由于睾丸单精子冷冻复苏后多数为不动精子，如何选择不动精子行ICSI对临床结局尤为重要。应用睾丸不动精子行ICSI的临床应用国内外均有报道[7，17-18]，本研究通过选择正常形态的活动精子直接行ICSI，或不动精子经低渗肿胀实验后选取尾部卷曲精子行ICSI的方式对IVM卵子进行注射，获得了较高的受精率和卵裂率。

本研究初步探讨了封闭式薄片法在睾丸单精子冷冻中应用的可行性。由于NOA患者精子获取困难且非常珍贵，故本研究尝试用OA患者睾丸精子作为实验标本，应用封闭式薄片法玻璃化冷冻方式进行冷冻，复苏后获得较高的精子回收率与存活率，并取得了与新鲜睾丸精子相似的受精率与卵裂率。虽然OA患者的精子质量不能等同于NOA患者，但本研究结果为日后NOA患者单精子冷冻保存应用于临床奠定了实验基础。

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（收稿日期：2017-06-27 本文编辑：崔建中）endprint