论酒精发酵中酵母菌的有效活化与营养管理

都振江，徐金辉，曹明秀*

（1. 中粮长城葡萄酒（烟台）有限公司，山东蓬莱 265608；2. 吐鲁番楼兰酒庄股份有限公司，新疆鄯善 838201；3. 上海杰兔工贸有限公司，上海 200120）

论酒精发酵中酵母菌的有效活化与营养管理

都振江1，徐金辉2，曹明秀3*

（1. 中粮长城葡萄酒（烟台）有限公司，山东蓬莱 265608；2. 吐鲁番楼兰酒庄股份有限公司，新疆鄯善 838201；3. 上海杰兔工贸有限公司，上海 200120）

本文通过大量的研究案例和成果，深入论述了酵母的活化保护及营养管理的重要性及其对酒精发酵的贡献。在酵母活化复水时应用专业活化保护剂Goferm Protect，可以补充大量甾醇类，强化酵母菌细胞膜，显著增强其生存能力，降低死亡率。在酒精发酵1/3阶段，使用有机营养剂Fermaid O，相比使用单纯的无机氮源DAP，不仅能够提高发酵速率，缩短发酵时间，而且显著提升了葡萄酒的感官品质。

酒精发酵；酵母菌；活化保护剂；营养

在葡萄酒酿造中，酵母面临渗透压、长时间处于不断上升的乙醇酒汁中、自生菌的竞争、培养基的酸度以及营养物质缺乏等环境限制[1]。酵母菌应对不同的环境胁迫有多种反应机制：细胞内累积甘油以应对外界高渗透压；排出质子以调节pH；胞内排出乙醇；释放嗜杀型毒素以抵抗自生菌污染等。然而一旦环境中的限制因素作用时间长并不断加强时，有机体必须调动能量和资源来应对挑战，同时，防御系统越来越弱，对外界的刺激越来越敏感，直至死亡。具体到酒精发酵中，会引起发酵偏差或缓慢，酒汁感官品质差，甚至会造成发酵停滞。因此，对酵母菌进行有效活化和营养管理是保障酒精发酵顺利进行的关键工艺点。

1 酵母的选用及有效活化

生物个体对环境的反应能力是不同的，例如不同酵母的耐酒精能力也不同，因此，针对糖度较高的葡萄酒汁发酵，通常会选用耐酒精的经典款酵母BDX、D254、Clos、DV10、EC1118、L2226及L2323等[2]。

为了抵制发酵恶劣环境，可以在酵母活化时为酵母添加一层甾醇，强化酵母细胞膜，提高在困难环境中的生存能力。在一定条件下，酵母自身在氧气参与的条件下可以合成甾醇，但是过多的氧气会给酵母带来不稳定的甾醇。在酵母复水活化阶段，酵母菌能将复水活化液中的甾醇加入到自身细胞膜上。研究发现，经Goferm Protect活化保护的酵母细胞膜在电镜下观察明显比未经处理组厚实[3-4]。

在酒精发酵过程中，高糖、高酸、高澄清或缺氧的环境对酵母的影响是非常显著的。图1显示了三种酵母在酒精发酵完成后死亡细胞数量的变化[3-4]。由图1可以观察到，三种酵母菌株DV10、KD和58W3在添加活化保护剂Goferm Protect后，均显著的增强自身生存能力，空白组的死亡率明显高于Goferm Protect组。试验也证实营养剂在发酵动力学和感官方面有非常积极的影响，而对酵母存活率没有直接影响。因此，使用专业酵母活化保护剂能够使酵母更强地抵抗含有酒精和其他毒素等基质胁迫和压力，显著降低感官偏差的风险。

2 全面平衡的营养

抵抗环境胁迫存活下来只是酵母的第一道关卡，如何在酒精发酵中更好的表现出其品质也是同样重要的。葡萄汁中平衡充足的营养物质是酵母顺利完成发酵的前提条件，这些主要的营养物质包括：酵母可同化利用氮、矿物质、维生素等[5]。

2.1 氮源

葡萄汁中的氮以不同的形式存在：蛋白质、多肽、铵离子（NH4+）和其他α-氨基酸。酵母可同化利用氮由铵离子和除脯氨酸以外的α-氨基酸组成。纯天然葡萄汁中的可同化吸收利用氮浓度在60～500 mg/L之间，根据葡萄的品种、年份以及微气候略有不同。通常情况下，天然葡萄汁中的可同化利用氮是缺乏的。可同化利用氮能够被酵母吸收利用合成蛋白质，保障自身繁殖，对发酵动力学也有重要影响。酵母前期的自身繁殖会消耗大量的可同化利用氮，后期氮水平降低，酵母的蛋白合成和糖转运功能降低，此时加入外源可同化利用氮将提高发酵速率，缩短发酵时间。

广泛的研究发现，氮的最佳添加时间是1/3酒精发酵阶段（当酵母数量达到最大值时），此时葡萄汁中的氮消耗殆尽[6]。在酒精发酵开始时应控制无机氮源的大量存在，否则会导致酵母大量快速繁殖，氮被大量消耗的同时会产生过多的热量，从而不会有多余的氮供酵母消耗将糖转化为酒精。如果是有机氮源，可以在酒精发酵开始时添加，并在1/3阶段补加。因为可同化吸收氮中的氨基酸态氮（有机氮）和铵离子氮（无机氮）吸收利用方式是不同的。氨基酸通过主动运输的方式进入细胞累积，能够被直接利用合成蛋白质，降解为NH4+或者转化为谷氨酸。这种吸收利用方式相比无机氮的利用缓慢、稳定而有效，而NH4+直接被酵母消耗掉而未必有益。

图1 Goferm Protect对酵母存活率的影响

2.1.1氨基酸对酵母酯类物质产量的影响

葡萄汁中的氨基酸组成及含量对葡萄酒的香气感官有重要影响，换句话说，发酵中氨基酸的含量影响着酒精和酯类物质的生成。在新疆霞多丽葡萄汁中分别添加无机氮源DAP、有机营养剂包（Fermaid O）和营养剂组合（DAP和Fermaid O）进行发酵对比，图2显示了部分试验结果，添加与DAP相同含量可同化利用氮（50 mg/L）的复合营养剂，各种酯类化合物均有不同程度的增加；而添加24 mg/L的有机营养剂包Fermaid O的处理中多种酯类化合物均显著增加[6-7]。可以得出结论：等量的可同化利用氮（YAN），含有部分氨基酸态氮的营养剂更能促进酯类化合物的生成；而相比营养剂组合，完全有机营养剂包Fermaid O（即使可同化利用氮含量低，但氨基酸含量更高）更能够显著提升酯类物质产量。

图2 DAP和Fermaid O含量对酯类物质产量的影响（2014霞多丽，中国新疆）

2.1.2不同氮源对硫醇物质产量的影响

硫醇化合物的生成也与氮的代谢有关。研究发现，发酵中过多的铵离子（无机氮）或在开始发酵时添加过多的铵离子（无机氮）会限制酵母对葡萄品种香气硫醇物质的释放[8]。这种现象可被解释为代谢阻遏，铵离子阻断了酵母氨基酸的合成和转运，进而限制硫醇前体物质半胱氨酸进入细胞，最终使细胞内合成不稳定易分解的硫醇。在新疆赤霞珠葡萄上试验显示（图3），当发酵中使用无机氮源DAP时，硫醇物质3-MH和3-MHA产量明显降低[6-7]。另一个试验（图4）是对法国罗纳河谷的鸽笼白葡萄酒精发酵开始时和1/3酒精发酵阶段分别添加两种不同的有机营养剂进行发酵，可以发现，两种有机营养剂对3-MH和3-MHA的产出均有积极作用，能够促进硫醇物质的转化和释放[6-7]。

2.1.3有机营养剂对葡萄酒感官品质的影响

酯类物质和硫醇类物质是葡萄酒中的主要香气成分，酯类和硫醇产量的增加必将提升葡萄酒的香气品质。通过大量的感官试验对比，有机营养剂和无机氮源营养剂的应用效果（图5）有显著差别，而且，有机营养在发酵中的应用对葡萄酒最终的感官品质具有非常积极的影响，所酿酒品深受专业品酒者的喜爱，口感更复杂，香气更浓郁和持久[6-7]。

图3 DAP对3-MH和3-MHA产量的影响

2.2 矿物质

葡萄汁中矿物质的生物利用率通常很低，因其经常和葡萄汁中的其他成分（如蛋白质和多酚）结合。过熟的葡萄矿物质含量更低，而被真菌感染的葡萄会被消耗掉大量矿物质。土壤类型和栽培管理对矿物质含量也有重要影响。此外，葡萄中各种矿物质之间的平衡也很重要，研究发现过多的钙会抑制镁的正常吸收。酵母细胞对镁需求高，因为镁参与一些酶的激活，在糖酵解途径中，对酵母的己糖激酶和磷酸果糖激酶活性起着重要作用；镁稳定细胞膜结构，在抵抗酒精渗透压方面也有重要作用，有限的镁会限制酵母的生长和发酵活度。有研究显示，钾素缺乏会影响酵母细胞存活率，尤其在低pH环境中容易引起发酵停滞[9]。因此，补足丰富多样的矿物质对酒精发酵具有积极作用。

2.3 维生素

生物素是维生素的一种，对发酵中酯类物质的产生和酵母细胞的活力有重要作用。当生物素缺乏时，会显著影响酵母细胞生长。泛酸（维生素B5）帮助避免H2S和挥发酸的产生。硫胺素（维生素B1）对发酵速率有重要影响，缺乏容易引起发酵停滞，供应充足能够增进酵母细胞数量和发酵速率[10]。在发酵初期，大多数葡萄汁含有酵母需要的部分主要维生素，但是变化很快。例如硫胺素和生物素在发酵的第一个阶段很快被消耗掉，如果硫胺素和SO2的结合则不能被酵母利用。在预发酵阶段，野生菌也会消耗大部分的主要维生素。因此，补足维生素的极其重要。

图5 有机营养剂对葡萄酒感官品质的影响（2012维欧尼，法国罗纳河谷）

表1 活化保护剂及发酵营养剂各种主要成分分析

3 活化保护剂及发酵营养剂的主要成分

表1列出了添加量0.30 g/L的Goferm Protect、Fermaid E、Fermaid O以及DAP的各种重要因子或营养成分和可同化利用氮含量。Goferm Protect是一种酵母活化保护剂，其主要成分为甾醇，在酵母复水活化时添加，可强化酵母细胞膜，显著增强细胞生存能力，降低其死亡率。虽然Goferm Protect也含有部分营养物质（氨基酸、维生素、矿物质），但其不能替代发酵营养助剂。DAP只是简单的无机氮源，而没有其他营养物质，如果葡萄汁只是简单的氮缺乏，可以在1/3酒精发酵阶段适当补充。Fermaid O是完全有机发酵全营养包，富含多种有机营养（特别是氨基酸），对葡萄酒的感官品质有重要影响。Fermaid E是一种复合发酵全营养包，是无机氮源和有机全营养包的组合，氨基酸含量较Fermaid O略低。

4 小结

保障酒精发酵质量水平的第一个关键工艺点，就是对酵母的复水活化与保护。专业活化保护剂Goferm Protect的应用，为酵母补充甾醇而强化其细胞膜，显著增强其生存能力和健康活力，提高接种酵母的活化率。

天然葡萄汁中的营养物质通常是缺乏和不均衡的，并且在酒精发酵开始时易被酵母快速消耗殆尽以满足其细胞增殖。在酒精发酵启动及1/3阶段及时补充有机营养包Fermaid O或复合全营养包 Fermaid E，使葡萄汁中均衡且富含酵母所需各种重要有机营养物（氨基酸、维生素、矿物质）。不仅能够提高发酵稳定性和水平，缩短发酵时间，而且能够促进酯类和硫醇物质的生成，保障口感细腻，从而显著提升葡萄酒的感官品质。

[1] 徐国强, 杜婕, 吴满珍, 等. 酒精发酵过程中酿酒酵母耐受环境胁迫的研究进展[J]. 微生物学杂志, 2013(6): 80-83.

[2] 俞惠明, 曹明秀. 浅谈炎热气候条件下葡萄收获时间及酿酒方案的选择[J]. 中外葡萄与葡萄酒, 2017(2): 57-60.

[3] The state of the art. Yeast nutrition and protection for good alcoholic fermentation[EB/OL]. [2017-06-05]. http://www.vawa.net/ winemaking-articles/Lallemand%20Yeast%20Nutrition.pdf.

[4] Goferm protect detail[EB/OL]. [2017-06-04]. http://www. lallemandwine.com/ australia-new-zealand/ products/catalogue/ product-detail/6/nutrient-protectors/4/goferm-protect/.

[5] 李雪霞, 秦晓媛, 雷顺新. 葡萄汁生产及研究现状[J]. 轻工科技, 2010, 26(2): 1-3.

[6] The wine expert. The many roles of nitrogen in alcoholic fermentation[R/OL]. [2017-06-05]. http://www.lallemandwine.com/ wp-content/uploads/2015/08/WE8-Nitrogen.pdf.

[7] ORTIZ-JULIEN A, DUMONT A, LORDAT E, et al. Nitrogen plays many roles during fermentation uncovering the relationship between nitrogen and aroma development[J].Wine & Vines, 2016(1): 117-121.

[8] SUBILEAU M, SCHNEIDER R, SALMON J M, et al. New insights on 3-mercaptohexanol (3MH) biogenesis in Sauvignon Blanc wines: Cys-3MH and (E)-hexen-2-al are not the major precursors[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2008, 56(19): 9230-9235.

[9] KUDO M, VAGNOLI P, BISSON L F. Imbalance of pH and potassium concentration as a cause of stuck fermentations[J]. American Journal of Enology & Viticulture, 1998, 49(3): 295-301.

[10] BATAILLON M, RICO A, SABLAYROLLES J M, et al. Early thiamin assimilation by yeasts under enological conditions: Impact on alcoholic fermentation kinetics[J]. Journal of Fermentation & Bioengineering, 1996, 82(2): 145-150.

10.13414/j.cnki.zwpp.2017.04.030

2017-06-11

都振江，男，工程硕士，高级工程师，国家葡果酒评委，长期从事葡萄与葡萄酒的技术与管理工作。

*通讯作者：曹明秀（1991-），女，工学硕士学位，研究方向食品科学。E-mail: cmingxiu@jatou.com