复发性自然流产MTHFR基因多态性与中医证型相关性的临床研究

王晨晔 丁彩飞

浙江省杭州市红十字会医院 浙江 杭州 310003

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复发性自然流产MTHFR基因多态性与中医证型相关性的临床研究

王晨晔 丁彩飞#

浙江省杭州市红十字会医院 浙江 杭州 310003

复发性自然流产 亚甲基四氢叶酸还原酶 中医证型 肾虚血瘀

复发性自然流产(RSA)，是指2次或2次以上连续发生的自然流产，发生率约5%，排除常见原因，仍有50%左右RSA不明原因[1-2]。研究表明：凝血相关基因亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR），其C677T位点的突变将导致酶活性降低，同型半胱氨酸(Hcy)水平升高，可引起胎盘栓塞，从而引发流产[3]。本次临床研究通过对复发性自然流产患者MTHFR基因分型进行检测，探讨复发性自然流产MTHFR基因突变特点及其与中医证型相互关系，为中医临床治疗复发性自然流产MTHFR基因突变提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 诊断标准：西医参照《复发性流产的诊断和治疗》[4]与同一性伴侣连续遭遇2次或2次以上在妊娠20周前的胎儿(体重≤500g)丢失。中医辨证标准：参照《中药新药临床研究指导原则》[5]《中医妇科临床研究》[6]有关内容拟定。肾虚血瘀型：主症：屡孕屡堕连续2次及2次以上,腰膝酸软；次症：①头晕耳鸣；②面色晦黯；③既往月经量少或有血块；④夜尿频数；⑤潮热盗汗或畏寒肢冷；⑥眼睑轻微浮肿；⑦性欲减退；舌脉：舌淡、苔白或舌质紫黯，舌边有瘀点或瘀斑，脉沉细滑或涩或尺脉弱。脾肾两虚型：主症：屡孕屡堕连续2次及2次以上,腰膝酸软或小腹隐痛下坠；次证：①神疲乏力；②面色萎黄或晦黯；③头晕耳鸣；④夜尿频多；⑤眼眶黯黑或面有黯斑；舌脉：舌淡或有齿痕、苔白润,脉沉细弱。气血两虚型：主症：屡孕屡堕连续2次及2次以上；次证：①神疲乏力；②头晕目眩；③气短懒言；④面色淡白；舌脉：舌质淡、苔薄白，脉细弱。肾虚血热型：主症：屡孕屡堕连续2次及2次以上，腰膝酸软；次证：①月经色深红质稠；②面赤唇红；③口干咽燥；④便结尿黄；舌脉：舌红、苔黄，脉弦滑数。肝气郁结型：主症：屡孕屡堕连续2次及2次以上；次证：①胸胁、乳房、少腹胀痛；②脘闷不舒，时叹息；③嗳气食少；舌脉：苔薄白或薄黄，脉弦。以上辨证均符合主症兼具次症中任一项结合舌质脉象，即可诊断。

1.2 排除标准：夫妇双方中一方外周血染色体核型异常者；生殖系统解剖畸形者；TORCH检测异常者；抗心磷脂抗体检测阳性者；抗精子抗体(AsAb)检测阳性者；夫妇ABO血型抗体系统检测IgG抗A抗体、IgG抗B抗体滴度大于1∶256，RH因子阴性者；有严重的心肝肾疾病、自身免疫性疾病者；尿HCG阳性者。

1.3 一般资料：收集2016年1月至2017年1月在杭州市红十字会医院生殖科门诊就诊及病房住院符合不明原因复发性流产患者100例为RSA观察组，年龄24～42岁，平均31.78±4.39岁；平均体重56.68±5.76kg。门诊就诊拟行孕前检查的无不良妊娠史的育龄期健康妇女50例为正常对照组（简称对照组），年龄23～41岁，平均31.12±3.84岁，平均体重57.21±4.59kg。两组年龄、体重差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。

1.4 方法：分述如下。

1.4.1 研究方法：①血标本采集：RSA观察组及正常对照组均空腹静脉采血，0.2%EDTA抗凝，血细胞做提取DNA用。②MTHFR基因C677T多态性检测：低渗溶血法分离白细胞，酚、氯法提取人基因组DNA。PCR反应：RT-PCR试剂与引物合成（武汉博士得生物工程有限公司）总蛋白提取试剂盒SBSCenetech公司，PCR仪（德国Biometra公司）；MTHFR：C677T引物序列，上游：5'－TGAAGGAGAAGGTGTGTGCGGGA－3'，下游：5'－AGGAGGGTGGGGTGAGAGTG－3'。PCR扩增循环条件：91℃预变性和变性各2min，56℃退火1min、74℃45s30个循环、72℃5min、4℃12h，cDNA产物置于-20℃保存。3%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物进行分析。具体试验操作由我院中心试验室完成。

1.4.2 中医证型分析：100例RSA观察组患者，均由我院两位以上主治中医师根据患者的症状、体征、舌苔、脉象，四诊合参，根据中医证候诊断标准予以临床辨证分型。

1.4.3 统计学方法：采用SPSS17.0软件包处理，计量资料以±s表示，采用t检验，计数资料采用百分率，采用χ2检验，以P＜0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 两组MTHFR基因型频率分析：见表1。

2.2 两组3种MTHFR基因型，纯合突变型TT、杂合子型CT、野生型CC中医证型频率分析：见表2。

表1 两组MTHFR C677T基因型频率[例（%）]

表2 两组MTHFR基因型（TT、CT、CC）中医证型频率[例（%）]

3 讨论

亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是甲硫氨酸－叶酸代谢中的一个关键酶,其中最常见的是C677T点突变，造成碱基T替换了C，其编码的氨基酸也由缬氨酸代替了丙氨酸，突变可直接影响酶的活性和热稳定性，影响叶酸的合成与代谢，体内N5-甲基四氢叶酸合成降低，导致甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸合成量下降，DNA转甲基转移酶活性降低，Hcy和S-腺苷同型半胱氨酸堆积，导致高同型半胱氨酸血症(HHcy)。妊娠期高同型半胱氨酸血症可致血液高凝状态，增加胎盘栓塞危险。高同型半胱氨酸血症还可能引起绒毛膜绒毛血管化不良，造成胚胎死亡，另外由于胎盘组织中MTHFR活力缺乏，致使作为甲基间接供体的5－甲基四氢叶酸生成障碍，进一步影响嘧啶、嘌呤和核酸的代谢及DNA甲基化，使得胎儿发育必需的生物成分包括DNA和蛋白质的甲基化不足，导致RSA[7]。

中医学将复发性流产归为“滑胎”范畴。其主要发病机理为母体冲任不固及胎元不健，病因病机多为肾虚，气血虚弱，血热、肝郁及血瘀，病位多责之于肾，且古人曰：胞脉者系于肾，“肾藏精，主生殖”。若母体因先天肾气不足，或房劳伤肾，或久病及肾，或孕后不节房事，导致肾精、肾气匮乏，以致冲任虚衰，胎失所养，胎结不实，堕胎小产反复发作而成滑胎。反复流产易伤及冲任胞络，导致瘀血滞留胞中，再孕后又因精血聚于下以养胎，汇聚之精血增加气血运行阻力，进而加剧了瘀血形成，瘀血不去，有碍新血归经，不能养胎，最后致胎元不固而流产。可见堕胎之后，一则损伤肾气，二则伤及冲任胞脉，导致瘀留胞中不能养胎载胎，最终可形成肾虚血瘀之证。结合复发性流产MTHFR基因突变后所存在的血液高凝状态、胎盘栓塞等这些病理变化，因而在中医辨证均与血瘀证有密切的相关性。由此，推测肾虚血瘀可能参与复发性流产MTHFR基因突变发生发展过程。

本研究结果也显示，复发性流产患者MTHFR基因TT型显著高于对照组，提示MTHFR基因型中TT型与复发性流产密切相关。复发性流产患者TT型中，肾虚血瘀型显著高于脾肾两虚型、气血两虚型、肾虚血热型、肝气郁结型。提示复发性流产患者MTHFR基因型中TT型基因突变与肾虚血瘀型密切相关，提示肾虚血瘀可能是复发性流产MTHFR基因突变的基本病机之一。由于本次研究样本量较少，结果可能存在一定的局限性，在今后工作中将扩大样本数量做进一步深入研究。

[1]Aruna Meka，B Mohan Reddy.Recurrent Spontaneous Abortions：AnOverview ofGenetic andNon-Genetic Backgrounds[J].Int J Hum Genet,2006,6(2)：109-117.

[2]陈祥艳,马大正,孙云,等.活血安胎方为主治疗高D-二聚体复发性流产21例观察[J].浙江中医杂志,2016,51(6)：431.

[3]董素芹，杜欣莹，刘学云.MTHFR基因多态性与不明原因习惯性流产中相关性分析[J].实用妇产科杂志，2006，22（8）：500-501.

[4]张建平，林其德，李大金，等.复发性流产的诊断和治疗[J].现代妇产科进展,2006,15(7)：481-492.

[5]郑筱萸.中药新药临床研究指导原则[M].北京：中国医药科技出版社，2002：253-258.

[6]肖承悰.中医妇科临床研究[M].北京：人民卫生出版社，2009：170-174.

[7]王苏梅，邱毅，高雪琴，等.亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与妊娠相关疾病[J].国外医学：妇产科学分册，2004，31 (5)：303.

2017-02-20

# 通讯作者：丁彩飞，E-mail：183415322@qq.com