袋鼠传染性腹泻病的病原分离与鉴定

张 琴

(上海野生动物园，上海，201399)

袋鼠传染性腹泻病的病原分离与鉴定

张 琴

(上海野生动物园，上海，201399)

稿件运行过程

袋鼠； 传染性腹泻； 大肠杆菌 O9； O79菌株

袋鼠(Macropusspp.)是袋鼠目(Diprotodontia)袋鼠科(Macropodidae)的有袋动物，主要分布于澳大利亚大陆和巴布亚新几内亚的部分地区。上海野生动物园饲养的主要是东部灰大袋鼠(Macropusgiganteus)和赤大袋鼠(Macropusrufus)两个种类，种群大小随着发病次数的增多而下降。开园以来先后发生过5次传染性腹泻病，平均发病率达32.7%，死亡率高达72.9%，对袋鼠的生命健康造成极大的威胁，也给上海野生动物园造成极大的损失。为了找到发病的病原，预防此类疾病的再次发生，我们总结了每次流行病学调查结果、临床诊查特征、病理剖检情况以及实验室分离鉴定，确诊为引起本病的病原为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)，并对菌体抗原进行鉴定，结果为O9菌株和O79菌株。此病例在国内未见报道，只有徐麟木等报道过袋鼠球虫和大肠杆菌混合感染的病例[1]，而上海野生动物园发病的病原纯为大肠杆菌感染，并且通过制作自家苗免疫后，取得了理想的防治效果。现将诊断的经过报告如下。

1 发病情况

上海野生动物园袋鼠自开园以来发生过5次传染性腹泻病的流行(表1)。发病季节主要是在春季(3～4月)和秋季(10～11月)。春季发病有2批，分别在2003年和2010年；秋季发病的有3批，分别在2002年、2009年和2011年。从表中可以看出春季发病都是连着前一年秋季的，且春季发病率(19.4%、22.7%)要比秋季(31.8%、30.4%、68.2%)的低。前后共发病48头次，死亡35只(15♂20♀)，平均发病率32.7%，致死率达72.9%。发病不分年龄和性别，但分种类。根据日期划分，前面3次发病和死亡的都是赤大袋鼠(文中简称赤大)，死亡共计23只，平均死亡率为80.9%(3次死亡率为85.7%、85.7%、71.4%)。后面2次死亡的全是东部灰大袋鼠(文中简称灰大)，共计12只，平均死亡率为60%(2次死亡率都为60%)。此病每次流行时间为7～14 d。

表1 5次发病情况的数据统计

Tab.1 The data statistics on the incidence of the diseases in 5 times

注：发病率=动物发病数/动物存栏数，死亡率=动物死亡/动物发病数

Note：Morbidity=Numbers of disease kangaroo/ Numbers of all kangaroo，Mortality=Numbers of dead kangaroo/ Numbers of disease kangaroo

2 临床症状与治疗

赤大袋鼠发病时主要临床症状为食欲废绝，而后呈水样便腹泻，严重时呈黑色稀水样便或血便，且至后期呈脱水状态，精神萎靡、呆立，粪失禁；体温在病初轻度升高为37℃左右或正常，正常(35.8±1.2)℃，个别升高至39.9℃，而后温度变化不大，除了在临死之前；病程一般在2～5 d死亡，最急性的病例第一天晚食欲与粪便都正常，第二天晨发现死亡；白细胞严重降低，发现不食时白细胞都极端偏低，在1 000个/mm3左右，正常为(4 970±1 870)个/mm3，最低的达到500个/mm3。

灰大袋鼠发病时的临床症状和赤大袋鼠基本相同，体温在病初轻度升高为36.5℃左右，正常(35.3±1.6)℃，个别也升高至39.9℃。灰大袋鼠刚发病时白细胞降低或不变，正常为(6 250±3 210)个/mm3，而后随着病程的发展，白细胞迅速地降低，最低的达到500个/mm3。有的尿液隐血。

治疗原则是以抗菌消炎、止泻止血，平衡补液支持疗法。根据死亡动物培养出的细菌而选择的高敏抗生素治疗，但治疗效果极差，致死率较高。

3 剖检病变

赤大袋鼠剖解的主要病变集中在腹腔。腹膜呈大面积条状或斑点状出血(图1)，肠系膜严重出血(图2)。胃壁菲薄，黏膜充血出血，特别是在胃的近幽门处有大面积的黏膜脱落和出血，病程长的胃壁有多处出血性溃疡灶(图3)。十二指肠、空肠和回肠段肠壁菲薄、肠黏膜脱落，肠内充满暗红色肠液。结肠靠近直肠段有多处坏死段，坏死部分外观为暗红色(图4)，切开有暗红色伪膜，肠壁呈纵条状增厚约1～2 cm，增厚后局部隆起呈纽扣状。病程长的可达月余，但终以死亡转归，肠壁严重增生，堵塞肠腔，形成类似香肠样病变。肠系膜淋巴结严重的肿大、出血，呈暗红色；颌下淋巴结、肩前淋巴结和腹股沟淋巴结肿大、出血、呈暗褐色，淋巴结周围呈胶冻样浸润、水肿、出血。肝脏色泽深暗，有的表面有大量的针尖样出血点，有的边缘出血。肾脏质地软，严重的水肿、瘀血，皮质呈暗红色出血；心肌基本正常，少数有大小不一的出血点。肺有不同程度瘀血。

图1 腹部大面积斑点状出血Fig.1 Massive abdominal hemorrhage

图2 回肠系膜大面积出血Fig.2 Congestion in the mesentery

图3 胃壁有多处出血性溃疡灶Fig.3 Multiple hemorrhagic ulcer in the stomach

灰大袋鼠剖解的主要病变和赤大袋鼠基本相同，但灰大袋鼠的一部分病例的肝脏表面散在弥漫性的针尖状白色结节。

图4 肠段呈暗红色坏死段Fig.4 Ileum was dark red and necrosis

4 实验室检验

4.1 细菌分离培养

无菌取肝、脾、肾、心、颌下淋巴结分别进行普通营养琼脂培养基和血琼脂培养基培养；无菌取血液在增菌双相液进行培养；无菌取脾、肝、肠内容物分别接种于厌氧培养基上，进行厌氧单皿法培养。再分别从每个培养皿内长出的菌落取2～3个可疑菌落再分别接种于伊红美蓝培养基、麦康凯培养基、沙门氏菌筛选显色培养基和大肠杆菌O157筛选显色培养基。上述各培养皿和培养瓶都37℃培养18～24 h。各种培养基是由上海科玛嘉微生物技术有限公司生产。

各个脏器培养出的菌落眼观基本一致。普通培养基上可见圆形、湿润、隆起、光滑而边缘整齐的、露珠样的菌落。血平皿上可见生长为圆形、湿润、光滑的不溶血的菌落。厌氧培养基上可见针尖样小菌落。增菌液内培养的血，可见明显的均匀浑浊，液面管壁有菌环，管底有黏性沉淀。脾、肝在厌氧培养基上可见密集细小的菌落生长，肠内容物在厌氧培养基上也有密集细小的菌落生长，偶有个别的袋鼠同时有大菌落生长，染色为革兰氏阳性杆菌。伊红美蓝培养基上形成黑色带金属光泽的圆形菌落。麦康培养基上形成粉色圆形菌落。沙门氏菌筛选显色培养基上长有淡蓝色的菌落，未见粉紫色菌落，故非为沙门氏菌。在大肠杆菌O157筛选显色培养基上呈铁蓝色菌落，未见紫红色菌落，故非为大肠杆菌O157。

每批次发病后所培养的结果高度一致，只是个别个体还有其他细菌混合感染。而且个别急性发病袋鼠的脾和肾培养未见任何菌落生长。

4.2 染色镜检

在普通培养基、血培养基和厌氧培养基上挑取可疑菌落2～3个，进行革兰氏染色，镜检结果基本一致。可见两端略深的、多数散在排列，偶尔有2～3个连在一起的革兰氏阴性无芽孢的中等大小的直杆菌。

4.3 生化试验

挑取麦康凯培养基上的可疑菌落再接种于普通培养基，37℃，18～24 h培养后，用白金耳挑取2～3个菌落于0.85%生理盐水2 mL内，制成McFarland(麦氏比浊法)0.5浊度的菌悬液。再用灭菌滴管接种于生化发酵管内，其中精氨酸及其对照培养基、赖氨酸和鸟氨酸及其对照管培养基，在接种后各加灭菌液状石蜡0.5 mL。35～37℃培养18～24 h后判定。氧化酶试验纸条用蒸馏水浸湿后，再用白金环挑取菌落，涂抹于试纸上，根据颜色反应与否判断。每次生化结果基本一致(表2)。

表2 此菌生化反应结果

Tab.2 Results of biochemical reaction of the bacteria

根据革兰氏阴性杆菌新编码鉴定手册[2]，结果鉴定为大肠埃希氏菌。

4.4 血清学鉴定

4.4.1 “O”抗原的制备

将纯培养的被检菌株分别接种在普通琼脂培养基和LB(Luria-Bertani)液体培养基中，于37℃恒温培养24 h后，用0.5%石炭酸生理盐水2～3 mL洗下普通琼脂培养物，放在试管中制成悬液，然后与液体培养物一起置于120℃，高压2 h，以破坏“K”抗原，制备成高压抗原。将制得的菌体再用无菌生理盐水洗涤，以8 000 rpm离心10 min，弃去上清液。最后将菌体用0.5%石炭酸生理盐水稀释成含菌109个/mL的菌悬液，置4℃的冰箱中保存备用。

4.4.2 “O”因子血清的稀释

多价血清的配制：将不同大肠埃希氏菌因子血清混合溶解在10 mL 0.5%的石炭酸生理盐水中，混匀后分装入1.5 mL指形管中，置于2～8℃冰箱保存备用。

单因子血清的配制：将一种大肠埃希氏菌因子血清溶解在5 mL 0.5%的石炭酸生理盐水中，混匀后分装入1.5 mL指形管中，置于2～8℃冰箱保存备用。

4.4.3 菌株“O”抗原的鉴定

分离菌株的血清型鉴定参照参考文献[3-4]所述方法进行。用接种环挑取一环多价血清后，再挑取一环制备好的抗原于玻板上，将多因子血清与高压灭活的抗原在玻板上进行混匀后，观察其凝集反应，半分钟内能够出现明显凝集反应即为“阳性”反应。若为阳性，再选取多因子血清所对应的单因子血清与此抗原进行玻板凝集反应；同时以高压灭活抗原与0.5%的石炭酸生理盐水混合物作为对照，观察有无自凝现象。

4.4.4 鉴定结果

根据玻板凝集反应，最终确定大肠埃希氏菌为O9和O79两个血清型。

4.5 药敏试验

把制成McFarland(麦氏比浊法)0.5浊度的菌悬液，用灭菌棉签涂抹普通琼脂，采用纸片扩散法进行药敏试验。药敏结果以抑菌圈直径(mm)作为判定标准，20以上判定为极敏，15～20判定为高敏，10～14判定为中敏，10以下判定为低敏，0判定为不敏。由于发病5次，每次都有不同药物药敏记录，且结果不统一。所以记录格式为(几次高敏几次中敏几次低敏几次不敏/总共做了几次：简称n极n高n中n低n不/N)。

GRNN神经网络的第一层为径向基网络层，||dist||表示这一层的权值函数，它是欧几里德距离度量函数，用来计算网络输入与第一层的权值iIW1,1之间的距离。图中符号“·*”表示||dist||的输出值与阀值b1的元素之间的乘积关系，并将结果形成净输入n1，传送到传递函数。径向基网络层的传递函数一般使用用高斯函数Ri(x)=exp(-||x-ci||/2σi2)。σi被称为光滑因子，σi越大基函数越平缓。

丁胺卡那(1极1高1中2不/5)，庆大(1高3中1不/4)，恩诺沙星(1高1中1不/3)，呋喃妥因(3高1不/4)，头孢三嗪(1极1高1不/3)，头孢他啶(1极1高1不/3)，头孢唑林(2高2不/4)，诺氟沙星(1极3不/4)，头孢噻肟(1极2不/3)，氧哌嗪青霉素(1高1中1不/3)，氯霉素(1极2不/3)，哌拉西林钠(1低/1)，头孢哌酮(1低/1)，阿奇霉素(1低/1)，阿莫西林(1低/1)，妥布霉素(1低/1)，复合磺胺(4不/4)，头孢呋辛、克林、环丙沙星、氧氟沙星均(2不/2)，青霉素、四环素、红霉素、链霉素、利福平、万古霉素、奥罗西林、林可、依诺沙星均(1不/1)。

4.6 动物试验

采用生化试验鉴定为大肠杆菌的菌落，移接于普通肉汤培养基中，恒温37℃，18～24 h，进行增菌培养，所得的增菌纯培养液作为动物试验的病原。由于本病例是多次发病的原因，共做过3次小白鼠毒力试验，3次结果高度一致。2次兔子毒力试验，结果也是高度一致。

实验小白鼠购买于上海西普尔-必凯试验动物有限公司，云南系，24只(体重20 g)，12♂12♀，雌雄各半，分为6组，每组4只。取肉汤增菌纯培养液0.3 mL给予A组腹腔注射，B组口服，C组皮下注射，D组腹腔注射空白肉汤0.3 mL，作为对照组。E组小鼠腹腔注射灭菌生理盐水0.3 mL，作为空白对照。20只小白鼠均隔离饲养72 h，定期观察，记录小白鼠发病，死亡情况(表3)。

对A组死亡小鼠剖解，结果为从十二指肠至回肠段肠壁变薄而黄，充满气体，剖开肠壁内可见黄绿色液体，其余个别小鼠有肺充血，肝呈暗绿色，腹腔内脏器壁层充血。取死亡小鼠心血、肝、肾进行分离培养，经鉴定，分离菌同原感染菌完全相同。

实验兔6只购于市场，年龄为1岁，3♂3♀，雌雄各半，分为2组。采购回来饲养3 d后，A组给予腹腔注射肉汤增菌纯培养液4 mL，B组给予口服肉汤增菌纯培养液4 mL。腹腔注射生理盐水4 mL，作为对照。每天观察以及采血记录(表4)。

表3 大肠埃希氏菌对小白鼠攻毒试验的结果

Tab.3 The results of escherichia coli poisoning attack test in mice

表4 大肠埃希氏菌对兔攻毒试验的结果

Tab.4 The results of escherichia coli poisoning attack test in rabbits

4.7 其他病原检测

4.7.1 寄生虫的检测

刮取多段出血肠段的内容物，置于载玻片直接压片观察，未见可疑的虫卵。

4.7.2 其他可能毒素的动物试验

取出血的回肠段肠内容物，与等量的生理盐水混合离心后，分别取其上清液5 mL给2只实验兔口服，观察3 d，体温食欲都无异常。同时取其上清液3 mL给2只实验兔分别肌注，观察3 d。第二天体温升高至40.5℃，第三天恢复，期间食欲无异常。

4.7.3 病毒检测

主要病变脏器经过电镜扫描未见可疑病毒。

5 讨论

5.1 根据流行病学的调查、临床症状、剖检病变的分析，结合实验室诊断，上海野生动物园袋鼠传染性腹泻的病原为大肠埃希氏菌，并根据其菌体抗原鉴定为O9菌株和O79菌株。

5.2 大肠埃希氏菌，俗称大肠杆菌，是人和温和动物肠道内正常菌群的主要成员之一，为条件性致病菌。根据菌体抗原(O)的不同，大肠杆菌分为166型，但致病性的血清型数量是有限的，常引起腹泻。根据毒力因子与发病机制的不同，与动物疾病有关的病原性大肠杆菌可分为5类，其中EHEC(肠出血性大肠杆菌)中O157最为典型症状为出血性腹泻，严重者可并发急性肾病。此次病例虽然排除了O157存在，但出现的临床症状和其非常相似，特别是肠出血和部分肾的病变，尤其接种的实验小鼠剖解的结果也高度一致。葛树刚等撰写的肠出血性大肠杆菌的研究进展中提到EHEC包括O26、O111、O121等10余种血清型，但未见O79菌株是否也属于EHEC[5]，有待于进一步证实。而O9菌株已被证实属于ETEC(产肠毒素大肠杆菌)[6]，易引起人和幼畜腹泻最常见的病原性大肠杆菌。但这次病例感染于袋鼠却不分年龄，这是个特异之处，也是说明此次细菌的来势凶猛，以及袋鼠可能比较敏感此大肠杆菌。

5.3 鉴于此次发病情况的调查，赤大袋鼠比灰大袋鼠发病数量多，且按发病的时间可看出，前面3次都是赤大发病，后面2次才是灰大。而后面2次发病时赤大的存栏数相比灰大来说要少得多，也许这是后面2次只是灰大发病的又一重要原因。从表1还可以得出赤大平均死亡率为80.9%，而灰大平均死亡率为60%，明显赤大的死亡率高于灰大。是否赤大比灰大更易感此大肠杆菌，有待于以后进一步探究。

5.4 此次病例对药敏结果不统一，且对大多数抗生素不敏感，对暂时敏感的抗生素也很快产生耐药性，故临床治疗效果很差。此药敏结果和贺丹丹等对不同动物源大肠杆菌的耐药性调查结果一致[7]。本病病程短，病情剧烈，一旦发病死亡率高，鉴于多次经验教训，在防治上改变过去的单纯依赖抗生素的方法，采用从分离到的菌株作为抗原，制备成自家灭活苗免疫袋鼠预防，预防至今未出现新的病例，达到了预期预防的良好效果。

5.5 上海野生动物园的袋鼠是大场地的半开放式饲养，所以对环境的控制比较差，容易引起大规模的疾病发生，因此笔者认为建立完善的消毒制度也是非常重要的，特别是在易发病季节每年的春季和秋季。每次发病多发生于长时间阴雨或者游客量较大以后，应激因素是本病发生的诱因，应减少动物的应激，提高动物的抵抗力可减少和防止本病的发生。

致谢：非常感谢同事徐春忠、吴昆、冯永其、段俊堂、姜传坤、徐静、王艳君等提供的前后多次发病原始资料和实验资料；特别感谢扬州大学的陈素娟老师的帮助。

[1] 徐麟木，张建荣，金铃，等，袋鼠急性肠炎的病因及病理学观察[J].中国兽医科技，1997，27(5)：40-41.

[2] 徐迪诚，蔡妙英.革兰氏阴性杆菌新编码鉴定手册[M].哈尔滨：黑龙江科学技术出版社，1994：12.

[3] 王世若，陈宗泽，梁焕春，等.兽医微生物学及免疫学实验指导[M].长春：吉林科学技术出版社，1984：192-195.

[4] 朱善元，陆辉，王健，等.禽源大肠杆菌的分离及其毒力因子的检测[J].微生物学报，2007，47(5)：795-799.

[5] 葛树刚，刘齐家.肠出血性大肠杆菌的研究进展[J].中国公共卫生，1990，6(4)：179-181.

[6] 陆承平.兽医微生物学[M].北京：中国农业出版社，2001：215-223.

[7] 贺丹丹，黄良宗，陈孝杰，等.不同动物源大肠杆菌的耐药性调查[J].中国畜牧兽医，2013，40(10)：211-215.

Kangaroo； Infectious diarrhea；Escherichiacoli； O9 strain and O79 strain

袋鼠(Macropus)传染性腹泻病在上海野生动物园先后发生过5次，平均发病率为32.7%，致死率为72.9%，造成了巨大损失。通过总结每次发病的流行病学调查结果、临床诊查特征、病理剖检情况、实验室分离鉴定以及动物实验结果，确诊引起本病的病原为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)，并根据菌体O抗原鉴定为O9菌株和O79菌株。由于此大肠杆菌对许多抗菌药不敏感，或对暂时敏感的抗生素也很快产生耐药性，导致治疗效果极差。因此通过此次病原的分离确诊，得以用制作自家苗的免疫方法，预防了袋鼠传染性腹泻病的再次发生。

Isolation and Identification of the Infectious Diarrhea Disease Pathogen in Kangaroo

Zhang Qin

(Shanghai Wild Animal Park，Shanghai，201399，China)

There have been five outbreaks of infectious diarrhea among Kangaroo at Shanghai Wild Animal Park and these caused enormous losses.The morbidity and mortality due to diarrhea were 32.7% and 72.9%，respectively.By summarizing the epidemiological survey，clinical symptoms，pathological alteration，laboratory examination and animal experiment of each outbreak，we confirmed that the diarrhea was caused by pathogenicEscherichiacolithat we identified as the O9 strain and O79 strain according to the bacteria O antigen test.The treatment effect was very poor because thisE.colistrain is resistant to many antibiotics，or temporarily sensitive to some antibiotics but soon resistant.We formulated our own vaccine by isolation of the pathogeny to protect kangaroos from infectious diarrhea.

张琴，女，42岁，学士，中级兽医师；主要从事野生动物临床诊断和治疗研究。E-mail：zhangqin555333@qq.com

2016-09-28

S858.9

A

修回日期：2016-11-10

发表日期：2017-05-10

2310-1490(2017)02-300-06