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响应面法优化菲律宾蛤仔黏附污泥多糖的提取工艺

2017-09-19周海军

关键词:絮凝剂产率污泥

周海军,穆 军,邢 宇

(浙江海洋大学海洋科学与技术学院,浙江舟山 316022)

响应面法优化菲律宾蛤仔黏附污泥多糖的提取工艺

周海军,穆 军,邢 宇

(浙江海洋大学海洋科学与技术学院,浙江舟山 316022)

菲律宾蛤仔黏附污泥(RPM)具备优异生物絮凝、脱色、沉淀性能,推测是由黏附污泥中的活性微生物产生的多糖类大分子为主引起的。本文通过响应面法研究了菲律宾蛤仔黏附污泥多糖(RPMP)的最佳提取工艺。首先通过单因素实验考察了提取温度、提取时间、水料比、提取次数对RPMP提取产率的影响,确定了单独适宜的提取温度、提取时间、水料比和提取次数。进而通过响应面法选取提取温度、提取时间、水料比作为变量,多糖产率为响应值进行各项提取参数的优化设计,得到RPMP的最佳提取工艺:提取温度为92℃,提取时间为4 h,水料比为20 mL/g,提取2次。在最佳提取参数下实际提取率是0.121%±0.002%(n=3),与模型预测的提取率0.122%较接近。因此,用响应面法对菲律宾蛤仔黏附污泥的多糖(RPMP)提取条件的优化方案是合理可行的。本研究为进一步阐明RPM的絮凝分子机理以及精制活性成分奠定了基础。

菲律宾蛤仔黏附污泥;多糖提取;响应面优化

絮凝剂在给水处理、污水净化、食品和发酵工程等领域有着极为广泛而关键的应用[1-2]。微生物絮凝剂是由微生物产生的具有絮凝活性的天然高分子化合物,无毒无害且易降解,因此备受人们关注[3-4]。对微生物絮凝剂的化学组成进行分析可知绝大多数都是以多糖为主要成分的胞外聚合物[5-7]。

菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum是一种重要的贝壳类海产品,目前全世界每年的养殖产量约为400×104t[8]。菲律宾蛤仔黏附污泥(RPM),特指新鲜贝类在除沙过程中贝类吐出的絮团状的泥沙沉淀物,湿重产量约为贝类重量的十分之一。前期研究表明,RPM虽然来自于贝类,却表现出极佳的微生物絮凝剂特征,具备絮凝、脱色、重金属去除等典型微生物絮凝剂活性;由RPM分离到大量的微生物絮凝剂产生菌,部分菌株对高岭土的絮凝效果明显,对多种模拟染料废水的染料脱色率达到95%以上[9-10],加大了RPM作为一种天然生物絮凝剂,实质上是由其中的活性微生物产生的微生物絮凝剂的推测。

本研究试图从菲律宾蛤仔黏附污泥中提取具有絮凝活性的多糖类大分子物质(RPMP),采用目前较流行的响应面法优化出最佳提取工艺,从而为阐明RPM的絮凝分子机理以及精制活性成分奠定基础。迄今为止,这是首次对菲律宾蛤仔黏附污泥中絮凝活性组分的优化分离。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

本研究中菲律宾蛤仔采集于浙江省舟山市普陀区朱家尖一处海水养殖场。无水乙醇、浓硫酸、苯酚和葡萄糖标准品等均为国产分析纯试剂。

1.2 实验仪器

旋转蒸发仪(RE-2000型,上海亚荣生化仪器厂);电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9023A型,上海一恒科学仪器有限公司);数显恒温水浴锅(HWS24型,上海一恒科学仪器有限公司);高速冷冻离心机(Multifuge 1R型,塞默飞世尔科技有限公司);循环水式真空泵(SHB-Ⅲ型,郑州长城科工贸有限公司);涡旋振荡器(VG3S025型,IKA);电子天平(LE204E型,上海梅特勒-托利多仪器有限公司);便携式可见分光光度计(DR1900型,上海世禄仪器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 黏附污泥的预处理

从养殖场采集5 kg鲜活的菲律宾蛤仔置于洁净的敞口塑料容器内,加入5 L经自然沉淀的天然海水暂养过夜。18~24 h后捞出蛤仔,余液静置10 min,弃掉容器上层海水,将底部蛤仔黏附污泥(RPM)收集置于烧杯中备用。取出适量湿泥在烘箱中50℃烘干至恒重,得到的干泥用于工艺流程的探究。

1.3.2 提取工艺

工艺流程:干泥→热水提取→离心→上清液→浓缩→醇沉→离心→沉淀物烘干→粗多糖。

具体操作是:称取干泥粉末适量,依据各设定的提取条件加入一定体积的蒸馏水,于热水浴中进行多糖提取。提取液于10 000 r/min、4℃条件下离心10 min,旋转蒸发浓缩至原体积的1/10,浓缩液加入无水乙醇至体积分数为75%,充分振荡,4℃冰箱中静置过夜,8 000 r/min、4℃条件下离心20 min,保留沉淀物。将沉淀物置于50℃烘箱中烘干,即为菲律宾蛤仔黏附污泥多糖粗提物(RPMP)。

1.3.3 多糖提取率的测定

采用苯酚-硫酸法[11-12]对水提溶液中的多糖含量进行测量。制得的葡萄糖标准曲线是A=0.010 9 C+0.032 1,R2=0.998 7,其中C为总糖浓度(mg/L),A为490 nm处的吸光度。

1.3.4 单因素实验

单因素试验中所用的干泥的质量为1 g,分别以提取温度、提取时间、水料比为单变量考察因素,以多糖提取率为目标,在不同条件下进行多糖提取实验。

(1)时间对提取的影响

各取1 g干泥,液固比 20:1,在温度为 90℃的恒温水浴中分别浸提 1、2、3、4、5 h,各提取 1次,分别计算多糖得率。

(2)温度对提取的影响

各取 1 g干泥,液固比 20:1,温度为 60、70、80、90、100 ℃的热水中分别浸提 3 h,各提取 1 次,分别计算多糖得率。

(3)料液比对提取的影响

各取 1 g 干泥,按液固比 10:1、15:1、20:1、25:1、30:1,分别在 90 ℃的恒温水浴中浸提 3 h,各提取 1次,分别计算多糖得率。

(4)提取次数对提取的影响

各取1 g干泥,在液固比30:1,温度为90℃的恒温水浴中分别浸提1、2、3、4次,每次浸提3 h,分别计算多糖得率。

1.3.5 响应面设计

在单因素实验的基础上,以干泥多糖得率为指标,以提取温度(X1),提取时间(X2),提取料液比(X3)为实验变量,通过响应面分析法,采取Box-Behnkn三因素三水平模型优化多糖的提取工艺参数。为便于统计计算,将实验变量设为-1、0、+1三个水平,各因素的实验设计水平及编码见表1。

表1 BBD中心组合实验设计实验因素水平编码Tab.1 Level and code for experimental variable of BBD design

其中xi是自变量的编码值,X0是自变量在中心点的实际值,△Xi是步长差值。计算值如下:

Box-Behnkn中心设计实验方案见表2,中心实验设计包括12个试验点和5个重复的中心点。依据表2进行实验,将实际得到的多糖产率值填入对应的结果中。

单因素实验均平行重复3次,实验数据通过SPSS进行显著性分析。Box-Behnken设计采用Design Expert 8.0.6进行数据分析及二次回归模型的建立,显著性由F-检验来确定。P<0.05用来表示实验数据是否显著。响应面的回归结果可用回归二次方程来表示,该数学模型公式包括一次项,二次项,相互交叉影响项。

其中Y是响应值,β0、βi、βii、βij分别是回归方程的截距,一次项系数,二次项系数,交互项系数。Xi和Xj是独立的互不相关的变量(i≠j)。

2 结果与分析

2.1 单因素结果

2.1.1 提取时间对黏附污泥多糖产率的影响

如图1A所示,固定提取的温度为90℃,料液比为20 mg/L,提取时间为3 h,提取次数为1次,分别加热 1、2、3、4、5 h。结果显示多糖产率从 1 h 到 4 h 呈逐渐上升趋势(P<0.05),然而随着加热的时间延长至5 h后,多糖产率呈现下降趋势。这可能是由于多糖浸提过程伴随着提取时间延长,溶解在水中的部分溶解的多糖被降解,当多糖降解的速率大于多糖溶出的速率时,产率就会出现下降现象。这种加热时间对多糖产率影响的关系以前也曾报道过[13],因此将最佳提取的时间初步选在4 h。

2.1.2 提取温度对黏附污泥多糖产率的影响

如图1B所示,固定料液比为20 mg/L,提取时间为3 h,提取次数为1次时,提取温度分别为60、70、80、90、100℃。结果显示,提取温度从60℃到90℃时对多糖产率有明显影响(P<0.05)。从90℃到100℃时,多糖产率略有下降。这可能是随着提取温度升高,水溶液的热分子运动加快,导致黏附在污泥上的多糖溶解出来速度加快。当温度继续增加时,部分多糖的结构不稳定使溶解在水中的多糖的产率下降。因此将90℃作为优化设计的中心点。一般来说,多糖提取温度都是在85~95℃范围内较为普遍[14]。

2.1.3 水料比对黏附污泥多糖产率的影响

如图1C所示,固定温度为90℃,提取时间为3 h,提取次数为1次时,水料比分别为10:1、15:1、20:1、25:1、30:1。结果显示,水料比从10:1上升至20:1,水料比对多糖产率的影响差异达到显著水平(P<0.05)。而从20:1到30:1,水料比对多糖产率的影响不那么显著(P>0.05)。这可能是由于随着水料比的增大,多糖分子的转移扩散能力一直提高,从而会使多糖产提取率不断提高,但当糖分子的浓度在水中达到溶解平衡时,继续溶出的可能性小[15]。考虑到之后浓缩步骤的难易,所以选择20:1作为水料比的中心点。

2.1.4 提取次数对黏附污泥多糖产率的影响

如图1D所示,固定温度为90℃,提取时间为3 h,水料比为20:1时,提取次数分别为1、2、3、4次。研究结果表明,提取次数从1次到2次时多糖提取率有极显著影响(P<0.05)。随着提取次数增大,多糖产率呈上升趋势。但当提取次数增大到3、4次时变化趋于平缓(P>0.05)。结合提取成本和综合原料利用率来看,提取实验用2次较为合适。

图1 提取时间(A)、提取温度(B)、水料比(C)、提取次数(D)对提取率的影响Fig.1 Extraction time(A),extraction temperature(B),water to solid ratio(C),and number of extraction times(D)on the yield of RPMP.Data are shown as the mean±SD(n=3)

2.2 多因素响应面分析

BBD实验设计组合的多糖产率见表2,多糖产率响应面二次模型方差分析结果见表3。从得到的数据来看,BBD中心组合实验得到的回归模型值F值为43.29,只有0.01%能引起模型F值噪声,属于非常显著的水平(P<0.001),表明该模型是显著的。失拟F值2.65意味该模型相对于实验绝对误差无显著差异(P>0.05)。此模型的预计回归决定系数0.982 38和实验校正系数0.959 7基本一致,表明仅有小于5%的实验数据误差。

通过Design expert 8.0.6软件得到的多糖提取模拟回归方程是:

从 X1,X2,X3的 P 值来看,X2<X1<X3,提取时间、提取温度、水料比这三个因素对实验的显著性影响大小为提取温度>提取时间>水料比。只有当“Pro>F”的值小于0.05时,该项指标才算是显著性水平[15]。

表2 BBD实验设计组合及蛤仔黏附污泥多糖提取结果Tab.2 BBD matrix and response values of extraction yield for polysaccharide from RPM

表3 多糖产率响应面二次模型方差分析Tab.3 Variance of response surface quadratic model for RPMP yield

2.3 主要因素交互影响分析

响应曲面图和等高线图是从外观图象上对统计软件建立的二次回归方程的直观描述。图形能反映所选取的自变量的交互作用对实验变量的影响是否显著,对变量条件是否符合实验的需要做个评判。等高线若呈椭圆形,对应的变量交互作用显著,等高线若呈圆形,对应的变量交互效应不显著[14]。

图2 提取时间(X1)、提取温度(X2)和水料比(X3)对泥多糖提取的响应曲面图Fig.2 Response surface plot depicting the effect of the extraction time(X1),extraction temperature(X2),water to solid ratio(X3)on the polysaccharide extraction yield from RPM

2.3.1 提取温度(X2)和提取时间(X1)

从图2A可以看出,当固定水料比在零点水平,开始时随着提取温度(X2)和提取时间(X1)的不断增加,多糖提取率相应值也在增大,当过了顶点峰值后,随着提取温度和提取时间的进一步增大,多糖的提取率在下降。从等高线图上的圆形可以看出,提取温度和提取时间的交互作用对多糖提取率的影响不显著。

2.3.2 提取时间(X1)和水料比(X3)

从图2B可以看出,当固定提取温度比在零点水平,开始时随着提取时间和水料比的不断增加,多糖提取率相应值也在增大,从等高线图上的圆形可以看出,水料比和提取时间的交互作用对多糖提取率的影响显著。这和回归方程X1X3的系数有显著性影响是一致的。

2.3.3 提取温度(X2)和水料比(X3)

从图2 C可以看出,当固定提取时间比在零点水平,开始时提取温度和水料比的不断增加,多糖提取率相应值也在增大,当过了顶点峰值后,随着提取温度和水料比进一步增大,多糖的提取率在下降。从等高线图上的圆形可以看出,提取温度和提取时间的交互作用对多糖提取率的影响不显著。

2.4 实验验证

通过RSM模型以及Design expert 8.0.6数据处理分析,得到菲律宾蛤仔黏附污泥多糖提取最佳工艺条件提取温度为91.59℃,提取时间为4.07 h,水料比为20.07 mL/g,提取次数为2次。为方便操作,各个工艺参数实际提取温度为92℃、提取时间为4 h、水料比为20 mL/g、提取次数为2次。提取实验平行3次,得到多糖实际产率为0.121±0.002%(n=3),和预测值0.122%较接近(表4),表明RSM模型建立的实验方案是合理的。

表4 最佳条件下的泥多糖提取率实际值和预测值Tab.4 Experimental and predicted yields of RPMP under optimal conditions

3 结论

本文通过响应面法首次研究了菲律宾蛤仔黏附污泥多糖的最佳提取工艺。首先通过单因素实验考察了提取温度、提取时间、水料比、提取次数对菲律宾蛤仔黏附污泥多糖提取产率的影响,进而通过响应面法选取提取温度、提取时间、水料比作为变量,多糖产率为响应值进行各项提取参数的优化设计。由多因素交互作用分析得出,水料比和提取时间的交互作用对多糖提取率的影响显著(P<0.05),提取温度和提取时间的交互作用以及提取温度和水料比的交互作用对多糖提取率的影响不显著(P<0.05)。最终通过回归方程的优化处理得到多糖的最佳提取工艺条件为:提取温度为92℃,提取时间为4.0 h,水料比为20 mL/g,提取次数为2次。在最佳条件参数下预测提取率是0.122%,实际提取率是0.121±0.002%,二者较为一致,表明该实验优化方案是合理可行的。

[1]郭俊元,赵 净,付 琳.稻秸秆制备微生物絮凝剂及改善污泥脱水性能的研究[J].中国环境科学,2016,36(11):3 360-3 367.

[2]皮姗姗.微生物絮凝剂及磁性微生物絮凝剂去除四环素的效能研究[D].哈尔滨:哈尔滨工业大学,2016.

[3]ZHAO Haijuan,ZHONG Chunyinh,CHEN Honggao,et al.Production of bioflocculants prepared from formaldehyde wastewater for the potential removal of arsenic[J].Journal of environmental management,2016,172:71-76.

[4]陈 蕾,徐 涛.微生物絮凝剂的研究进展及发展趋势[J].环境研究与监测,2016(2):69-72.

[5]GIRI S S,HARSHINY M,SEN S S,et al.Production and characterization of a thermostable bioflocculant from Bacillus subtilis F9,isolated from wastewater sludge[J].Ecotoxicology and environmental safety,2015,121:45-50.

[6]LIU Weijie,HAO Yan,JIANG Jihong,et al.Production of a bioflocculant from Pseudomonas veronii L918 using the hydrolyzate of peanut hull and its application in the treatment of ash-flushing wastewater generated from coal fired power plant[J].Bioresource Technology,2016,218:318-325.

[7]郭俊元,张宇哲,赵 净.淀粉废水生产微生物絮凝剂及发酵动力学特征[J].中国环境科学,2016,36(9):2 681-2 688.

[8]NIE Hongtao,LIU Lianhui,HUO Zhongming,et al.The HSP70 gene expression responses to thermal and salinity stress in wild and cultivated Manila clam Ruditapes philippinarum[J].Aquaculture,2017,470:149-156.

[9]高 琦.菲律宾蛤仔黏附污泥制备生物絮凝剂及其应用研究[D].大连:大连交通大学,2009.

[10]GAO Qi,ZHU Xiuhua,MU Jun,et al.Using Ruditapes philippinarum conglutination mud to produce bioflocculant and its applications in wastewater treatment[J].Bioresource Technology,2009,100(21):4 996-5 001.

[11]DUBOIS M,GILLES K A,HAMILTON J K,et al.Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances[J].Analytical Chemistry,1956,28(3):350-356.

[12]陈 骞.牡蛎糖原的提取与抗疲劳活性研究[D].无锡:江南大学,2005.

[13]QIAO Delang,HU Bing,GAN Dan,et al.Extraction optimized by using response surface methodology,purification and preliminary characterization of polysaccharides from Hyriopsis cumingii[J].Carbohydrate Polymers,2009,76(3):422-429.

[14]ZHAO Ying,SHI Yongyong,YANG Huixin,et al.Extraction of Angelica sinensis polysaccharides using ultrasound-assisted way and its bioactivity[J].International journal of biological macromolecules,2016,88:44-50.

[15]FAN Tao,HU Jianguo,FU Lidan,et al.Optimization of enzymolysis-ultrasonic assisted extraction of polysaccharides from Momordica charabtia L.by response surface methodology[J].Carbohydrate Polymers,2015,115:701-706.

Response Surface Methodology Used for Extraction Process Optimization of Polysaccharides from Ruditapes philippinarum Conglutination Mud

ZHOU Hai-jun,MU Jun,XING Yu
(School of Marine Science&Technology of Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022,China)

Ruditapes philippinarum conglutination mud(RPM)showed good activities of flocculation,decolorization and settling,which is speculated contributing to polysaccharides produced by bioflocculant-producing microbes inside the mud.In this research,response surface methodology(RSM)was employed to optimize the extraction conditions of R.philippinarum conglutination mud polysaccharides(RPMP)based on Box-Behnken design.Firstly single factor experiment,including extraction time,extraction temperature,ratio of water to solid,and number of extraction times,was performed to obtain each suitable extraction condition.Afterwards,extraction time,extraction temperature and ratio of water to solid were selected for RPMP extraction optimization based on Box-Behnken design.Results indicated that the best extraction parameters were:extraction time 4 h,extraction temperature 92℃,ratio of water to solid 20 mL/g and twice extraction.Under the optimized extraction conditions,the observed extraction yield of RPMP 0.121%±0.002%(n=3)was in close agreement with the predicted yield 0.122%,which revealed that the RSM model was suitable for the optimization of the extraction process.This study laid a foundation for further elucidation of the molecular mechanism of RPMand the purification of its active components.

Ruditapes philippinarum conglutination mud;polysaccharide extraction;response surface methodology optimization

X703

A

1008-830X(2017)02-0115-07

2017-02-10

国家自然科学基金项目(21109004314);国家级大学生创新创业项目(201510340008);舟山科技计划项目(2014C41018)

周海军(1989-),男,湖北蕲春人,研究方向:海洋环境污染防治.

穆军,教授.E-mail:2240254374@qq.com

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