贝类标志技术的研究进展

周珊珊，王伟定，丰美萍，毕远新，梁 君，张洪亮

（浙江海洋大学海洋与渔业研究所，浙江省海洋水产研究所，农业部重点渔场渔业资源科学观测实验站，浙江省海洋渔业资源可持续利用技术研究重点实验室，浙江舟山 316021）

贝类标志技术的研究进展

周珊珊，王伟定，丰美萍，毕远新，梁 君，张洪亮

（浙江海洋大学海洋与渔业研究所，浙江省海洋水产研究所，农业部重点渔场渔业资源科学观测实验站，浙江省海洋渔业资源可持续利用技术研究重点实验室，浙江舟山 316021）

贝类标志技术已在贝类种群密度、死亡与资源补充、生长和遗传等研究中广泛应用，并已成为贝类种群估算、资源评估及分布调查的重要手段。目前，贝类标志技术的研究仍相对较少，且由于贝类多变的形态结构和复杂的生存环境，造成了标志技术的应用仍存在问题。本文对近年来国内外在贝类标志技术方面已取得的进展进行了综述，并比较分析了几种标志方法的优缺点，以期为我国贝类标志技术的应用与研究提供依据。

贝类；标志方法；物理标志；化学标志；生物标志；分子标志

世界上现存贝类11万多种，其中大部分为海洋贝类，而我国目前已知的贝类约4 000余种，其中重要的经济贝类包括皱纹盘鲍Haliotis discus hannai、文蛤Meretrix meretrix、魁蚶Anadara broughtonii、缢蛏Sinonovacula constricta、扇贝Pecten maximus等[1-2]。自上世纪50年代，英国的HANCOCK et al开展螺类的标志研究后，国内外学者分别开展了多种贝类标志方法的研究[3]。贝类标志是指在贝类内部或外部通过悬挂、卡入或染色等方式产生某种标识，从而进行标志个体间、标志种群与野生种群等进行区分，进而开展贝类生长、行为、死亡、种群动态、遗传学等领域的后续研究。随着近年来海洋牧场建设的兴起，标志技术也作为贝类增殖放流效果评价的重要手段[4-5]。由于贝类种类多样，存在贝壳形态、行为学、栖息环境的差异，且不同研究目的需要的标志保持时间不同，造成贝类标志技术的应用仍存在较大的问题。近年来，在浙江、山东、辽宁等地开展了文蛤、魁蚶、缢蛏、皱纹盘鲍等贝类的增殖放流,并已取得了明显的经济和生态效益[6-8]，但尚缺乏贝类标志技术的系统研究。

目前，国内外贝类常用的标志技术可以分为四类：（1）物理标志法（a.外部标志法，b.内部标志法）；（2）化学标志法；（3）生物标志法；（4）分子标志法。本文综述了国内外四种标志方法的相关研究，并对其优缺点进行了比较，以期为今后贝类增殖放流标志技术的选择提供依据，为贝类标志技术的研究奠定基础。

1 物理标志法

1.1 外部标志法

挂牌标志方法是应用最广泛的贝类标志技术，主要利用在壳上打孔或粘结剂黏贴等方式，将印有编码的塑料标志挂于或粘贴于贝壳表面。JEREMY[9]最早利用铆钉将编码的塑料圆盘挂于鲍鱼Haliotis rubra壳上，1 a后的脱签率为4%～35%，标志易操作，对鲍鱼刺激小，可作为鲍鱼的有效标志方法。KIM et al[10]比较钻孔标志、金属线码（铜丝）标志、螺母标志（围鳃腔）、壳面粘贴螺母四种标志方法对鲍鱼的标志效果，研究表明螺母标志法的标志率达96.6%，且对生长存活影响较小，是鲍鱼的有效标志方法。利用贝类部分突出部位进行打孔挂牌标志，主要应用于扇贝、螺类等壳上具有突起的贝类的标志活动中[11,12]。通过在扇贝翼状突起上打孔，将带有编码信息的lock塑料标签穿于孔中，6个月的脱签率为10%，这种标志方法俗称为“打耳标志”[11]；在蛾螺Buccinum undatum螺壳边缘打孔挂牌，也获得了100%的标志保持率[12]。利用黏贴剂粘贴标志牌也是较常用的挂牌方法，其中常用的黏贴剂有氰基丙烯酸酯胶粘剂、环氧树脂、牙粘固粉等[13]。LEMARIE et al[13]利用氰基丙烯酸酯胶粘剂进行珠蚌科贝类的贴牌标志，2年内的脱签率仅为0.46%。ROSS et al[14]比较了刻画标志、微型金属丝、贴牌标志3种标志方法标志扇贝的标志效果，发现贴牌标志效果较好，且6种粘贴剂（标准环氧树脂、快速环氧树脂、防水环氧树脂、牙粘固粉、氰基丙烯酸盐粘合夜、氰基丙烯酸盐粘合胶）中，快速环氧树脂、氰基丙烯酸盐粘合夜、氰基丙烯酸盐粘合胶与贝壳的粘合速度快（1～3 min），其中氰基丙烯酸盐粘合胶因操作简单，对扇贝生长存活影响小，被认为是扇贝的最佳粘贴剂。VASCONCELOS et al[15]利用Dymo标牌标志骨螺Hexaplex trunculus，去除表面海水后，使用氰基丙烯酸盐粘合剂粘贴标牌，再在标签表面覆盖一层环氧基树脂。贴牌标志应注意选择合适的标志牌黏贴部位，壳边缘有放射肋凹槽的部位与平滑的壳顶部位相比，其标签粘合更牢固[13-14]。国内学者发明了粘结粉和粘结液相混合的新型粘结方法、无毒透明环氧树脂胶液直接涂覆于贝壳表面的标志方法[16-17]。挂牌标志方法具有以下优点：（1）无毒；（2）标志易辨别；（3）对被标志个体的生长发育无显著影响；（4）携带详细标志信息。缺点主要为：（1）操作繁琐，需要化学腐蚀在贝壳表面形成凹陷来黏贴标签；（2）贝类与底质的机械作用下标牌易脱落或标志信息易磨损；（3）不适用于小型贝类及幼贝的标志；（4）部分挂牌方法仅适用于特定贝类而难以推广；（5）标牌过于明显而导致标志个体易被敌害生物捕食。

标签标志通常利用具有抗腐蚀耐磨特性的金属标签，将标签卡入贝壳边缘，标签能随着壳的生长逐渐被外套膜分泌的珍珠质包裹，从而与贝壳融为一体。MENKE[18]发明了“一种螺旋状CLIP标签”的标志方法，可应用于皱纹盘鲍、扇贝等贝类的标志放流。国内已利用不锈钢签在山东等地开展了鲍鱼的标志工作，但尚未见相关的文献报道。周珊珊[19]利用倒刺型不锈钢标签标志魁蚶幼贝，标签保持率为64.25%（160 d），标签对魁蚶幼贝的生长存活存在一定的负面影响。标签标志方法具有以下优点：（1）无毒；（2）标志易辨别；（3）携带详细标志信息。（4）标签不易腐蚀、磨损。缺点主要为：（1）操作繁琐，双壳贝类麻醉开壳后才能进行卡签操作；（2）标志初期，标签易脱落；（3）对小型贝类及幼贝进行卡签操作，易造成贝壳的破损；（4）损伤贝类软体部，影响被标志个体的生长发育。

刻划标志法是指利用电动砂轮、电刻笔等工具，刻划贝壳表面或贝壳边缘，从而形成缺刻、凹陷等标志信息，可以避免标志过于明显而造成的标志个体被捕食的现象[20-21]。1970年ROPES et al[22]最早开展浪蛤Spisula solidissima的刻画标志，ROSS et al[14]利用刻画标志扇贝，KIM et al[10]开展了鲍鱼的钻孔标志。我国学者游奎等[4]利用电动砂轮对贝类壳边缘进行缺刻标志，付龙龙等[23]利用电刻笔对三角帆蚌进行刻划标志，顾炎斌[5]利用电刻笔对文蛤进行标志，刻画标志通常在短期内标志清晰可见，标志保持率为100%。刻划标志具有以下优点：（1）操作简单，成本低廉；（2）应用广泛，可用于多种贝类的标志；（3）无毒，不影响标志生物的生长存活。缺点主要为：（1）缺乏全面的标志信息；（2）易造成贝壳破碎等物理损伤。（3）破坏贝壳的角质层，碳酸钙层易腐蚀造成标志模糊。

激光标志是一种新兴的刻划标志技术，利用激光发射器发射的高能激光束照射标志生物表面，将光能快速转化为热能，激光照射位置在高温作用下瞬间熔融或气化而形成标志，已广泛应用于海洋捕捞、水产品加工、水产养殖、鱼类激光标志等领域[24-25]。2012年，付龙龙等[26-27]首次利用四种强度的激光标志了三角帆蚌Hyriopsis cumingii，研究发现标志的位置和大小、激光强度会影响帆蚌的生长存活，标志大小0.65 cm，激光强度0.30 A，标志幼贝85日龄以上为三角帆蚌的最佳标志方法。2013年，顾炎斌利用激光雕刻机对文蛤进行激光标志，实现了计算机控制的自动化激光标志，激光标志速度可达30只/min，标志后60 d的标志保持率为100%，对文蛤生长存活无显著影响[5]。目前激光标志贝类的研究仍较少，与传统的刻划标志相比，激光标志具有以下优点：（1）非接触性标志，不产生机械损伤；（2）自动化程度高，标志速度快，成本低廉，可自定义标志信息。其缺点是：（1）标志操作人员素质要求高，需具备计算机操作能力；（2）不适于表面不光滑、具放射肋的种类；（3）对标志贝类造成一定程度的热损伤。

1.2 内部标志法

新兴的内部标志技术利用注射器、标志枪等标志设备将标志物植入贝类体内，再利用接收器进行标志识别。内部标志可以有效避免传统外部标志法存在的标签易脱落、磨损等缺点，而逐渐应用于贝类的标志放流活动，其主要包括微编码线标志技术（CWT）、被动整合雷达标志技术（PIT）等。CWT为携带编码的不锈钢金属丝，通过金属探测器进行标志的识别，选择适当的标志部位，掌握正确的操作技术可有效提高标志保持率[28-29]。贝类CWT标志的报道最早见于日本河蚬Corbicula japonica，CWT标志注入河蚬铰合部肌肉后对其生存、软体重、壳长、肥满度无显著影响，标签保持率高达93%[28]。LAYZER et al[29]利用注射器将CWT标志注射到黑檀贝Fusconaia ebena铰合部肌肉中，标志2 a后其存活率和标志保持率均为100%。铰合部肌肉是双壳贝类较常见的CWT标志注射位置，而利用黏贴剂粘贴金属片至螺类壳顶部位具有较好的标志效果[30]。CWT具有以下优点：（1）金属丝规格小，对贝类损伤较小；（2）标签保持时间长；（3）无需捕捞标志个体，即可得到标志信息。缺点为：（1）金属丝材质要求高，忌生锈；（2）植入过程繁琐；（3）检测距离限制，对穴居、底栖贝类的探测效果不佳。（4）检测设备较贵。

PIT利用注射器将芯片植入贝类外套膜、组织中，通过固定或手持的无线电探测装置激活芯片，激活后的芯片发射出编码信息，再利用PIT探测装置检测水深2 m以内的芯片信号。LAYZER et al[31]将芯片植入北美珍珠蚌Lampsilis cariosa外套膜组织，标志保持率为93%，死亡率小于2%，回捕率高达95%。HALE et al[32]研究了3种芯片植入方式（壳背部粘贴、壳腹部粘贴、足部注射）对平托鲍鱼Haliotis kamtschatkana标志效果的影响，发现不同植入方式对鲍鱼的生长存活均无影响，而注射芯片法的标志保持率显著低于粘贴法的标志保持率；壳腹部粘贴芯片的标志效果较好，主要是由于腹部的PIT逐渐被外套膜分泌的珍珠质层包裹，且包裹后不影响标志的识别，获得了较高的标志保持率。PIT标志的主要优势包括：（1）可以有效提高放流个体的回捕率；（2）标签保持时间长；（3）无需捕捞标志个体，即可得到标志信息，可实时监测标志贝类的活动情况。缺点为：（1）芯片、探测设备价格昂贵；（2）芯片植入过程繁琐；（3）植入芯片对贝类造成生理损伤；（4）芯片规格较大，仅适用于大个体贝类，应用具有局限性；（5）有检测距离限制2～150 cm），对穴居、底栖贝类的探测效果不佳。

2 化学标志法

2.1 荧光染料标志

化学标志法通常利用染料涂抹或浸泡贝壳，从而在贝壳上形成颜色标志，目前主要利用的化学染料包括油漆涂抹、铁锈覆盖、荧光染料等。其中，荧光标志法是大规模标志活动中应用最广泛的标志方法，通常选用无毒或毒性甚微的荧光染料，通过浸泡、注射等方式使荧光染料与钙离子发生络合反应，可在贝壳表面形成长久的颜色标志，颜色标志在一定波长光源照射下激发出荧光[33]。常用的荧光染料包括茜素红S（alizarin red S）、钙黄绿素（calein）、茜素络合指示剂（alizarin complexone）等，而氧四环素（oxytetracycline）、四环素（tetracycline）等抗生素药物因不利于水产品安全而逐渐被淘汰[34-36]。国外学者利用荧光标志后标志壳与新生组织、新生壳颜色的差异，开展了贝类幼体器官、贝壳的分化生长过程的研究[34-35,37]。荧光染料对贝类不同生长阶段的标志效果不同，如中性红染色标志斧蛤D型幼虫的标志效果较好，而斧蛤、布氏蚶稚贝则以茜素红S标志效果最佳[34]。钙黄绿素是标志浪蛤最好的生长标志物，不影响浪蛤的存活生长，生长速度为20 d生长23 mm，SrCl2、茜素红的标志效果则无法观察或较不清晰[35]。此外，国内外学者利用钙黄绿素成功标志了扇贝幼贝[37]、小型贝类满月蛤Loripes lacteus[38]、贻贝Mytilus trossulus幼虫[39]、澳大利亚河蚌Westralunio carteri[40]、青口贝Perna canaliculus幼虫[41]，利用钙黄绿素和考马斯亮蓝成功标志珠母贝Pinctada mazatlanica[42-43]。

目前国内外将荧光标志应用于贝类增殖放流的研究较少，可能与贝类增殖放流活动兴起时间较晚有关。相比于生长速度的相关研究，应用于增殖放流活动的荧光标志方法应具有标志色保持时间更持久的特性，因此相关研究中荧光染料的浓度、浸泡时间、标志色保持时间等均有相应的增加或提高。LUCAS et al[44]首次将荧光标志应用于增殖放流工作，利用氧四环素（500 mg/L）、茜素红S（10～20 mg/L）、钙黄绿素（10～50 mg/L）三种荧光染料标志碟扇贝Amusium balloti幼虫（2～15 mm），研究表明氧四环素可以有效标志碟扇贝，且荧光标志可保持10个月；钙黄绿素标志的荧光标志几个月后衰减消失，使用高浓度的钙黄绿素标志可能增加钙黄绿素荧光标志的保持时间；茜素红S标志造成了扇贝幼虫的大量死亡，未能有效标志扇贝幼虫。此外，国内外学者成功利用钙黄绿素（250 mg/L）标志了河蚌，茜素红S（200、300 mg/L）和钙黄绿素（200、300 mg/L）成功标志了魁蚶幼贝，获得了较长的标志保持时间，可以用于后续增殖放流的标志活动。

荧光标志的标志效果，与染料种类、贝类种类、贝类大小等因素决定。钙黄绿素标志鲍鱼幼贝[33]、浪蛤[35]、碟扇贝[45]等贝类的标志效果优于四环素类染料、茜素红S等，主要与四环素类染料、茜素红S等染料产生的荧光与这些贝类贝壳的自身荧光波长接近，无法准确区分有关；钙黄绿素可以成功标志含有黑色角质层的贝类，如澳大利亚河蚌、绿唇贝Perna canaliculus等[40-41]，但尚没有茜素红S成功标志黑色角质层贝类的相关报道；钙黄绿素标志对魁蚶幼贝、鲍鱼幼贝、贻贝幼虫、扇贝幼虫、青边贻贝Perna perna等多数贝类的生长存活无显著影响，茜素红S标志对魁蚶幼贝、鲍鱼幼贝的生长存活无显著影响，而茜素红S标志青边贻贝则具有较高的死亡率[33,39,44-47]。因此，针对目标贝类进行荧光标志时，应选择适宜的染料和贝类规格，并开展染料毒性试验以获得好的标志效果。荧光标志主要具有以下优点：（1）具有操作方法简单快速，价格低廉；（2）毒性小；（3）标志保持率高、保留时间长，适用于进行贝类增殖放流大规模标志。其缺点是：（1）携带信息量低，只能标志放流群体，无法区分放流个体；（2）其标志色影响其食用和经济价值；（3）标志初期鲜明的标志色导致标志贝类易被敌害生物捕食。

2.2 其它染料标志

油漆、染料、铁锈等染料涂抹于贝类表面，形成颜色标记也是目前应用较广泛的标志方法。HANCOCK et al[3]最早利用油漆涂于海螺Buccinum undatum壳面进行标记；ITO[48]利用贴牌-油漆标记、挂牌-油漆标记进行日本浪蛤Pseudocardium sybillae的标志，发现两种标志方法结合的标志效果优于单一标志方法，贴牌-油漆标记法为浪蛤的最佳标志方法；KESLE et al[49]利用krylon染料（白底漆和荧光橙）成功标志淡水贝类（Elliptio complanata、Lampsilis radiata）。染料覆盖标志具有以下优点：（1）成本低廉，应用广泛，可用于多种贝类的标志；（2）对贝类生长存活影响小；（3）标志易辨认。其缺点是：（1）操作繁琐，携带标识信息少；（2）染料易受海水腐蚀或贝类移动而磨损脱落。KOSHIKAWA et al[50]利用铁锈附着法标志杂色蛤Ruditapes philippinarum，标志蛤附着的铁锈厚度约16 μm，可以肉眼识别标志贝，且铁锈标志法对杂色蛤的生长存活无显著差异，标志杂色蛤底播于潮间带270 d后的标志保持率为83.7%，获得了较好的标志效果和较高的回捕率。铁锈标志法具有无毒、易肉眼辨认、操作方便快速等显著优势，但国内尚无铁锈法应用于增殖放流标志、贝类生长的相关研究报道，应加强铁锈法在我国增殖放流标志活动中的应用。

3 生物标志和分子标志法

生物标志利用生物的形态学、生态分布等特征差异来区分不同生物群体，其对标志生物的生长存活无影响、标志成本低或无成本，具有一定的标志优势，但目前报道的生物标志的方法较少。国内外学者利用文蛤不同种群壳色花纹的差异进行文蛤的生物标志，利用饵料造成的贝壳颜色差异标志蝾螺属Turbo spp.、鲍螺属Haliotis spp.贝类，利用光照造成的贝壳颜色差异标志紫贻贝Mytilus edulis[51-54]。生物标志方法的优点是：（1）标志成本低廉，不影响标志个体的生长发育；（2）无毒，不影响标志贝类经济价值；（3）标志色永久保持。缺点是：（1）只能标志特定种类的贝类，应用局限；（2）缺乏全面的标志信息；（3）标志所需时间长。

分子标志技术伴随分子生物技术的产生而迅速发展，利用生物的DNA水平多态性特征，可以用于追踪放流生物、区分不同放流群体及分析回捕群体与放流群体间亲缘关系等研究，可以准确评估增殖放流效果[55-57]。目前应用较多的两种分子标志技术为线粒体DNA标志（mtDNA）和微卫星标志（SSR），主要应用于长牡蛎Crassostrea gigas[58]、海湾扇贝Argopecten irradians[59]、皱纹盘鲍[60]、虾夷扇贝Patinopecten yessoensis[61]、魁蚶[62]等贝类的标志。分子标志具有受环境影响小，稳定性高，比形态标志更准确的优点，但存在需要进行微卫星、线粒体DNA标志位点筛选且检测成本高等缺点，这就制约了分子标志技术在增殖放流活动中的广泛应用。

4 贝类常用标志方法图示

由于贝类增殖放流成活率高，近年来贝类的增殖放流均取得了较好的经济和生态效益，在浙江省各种海珍品与贝螺类底播增殖中，以厚壳贻贝比重较大，成为新增主流放流品种，其放流数量在“十一五”期间得到了快速增长[63]。此外，从东海区的情况出发，应根据海域环境条件选择适宜的贝类增殖品种，目前浙江沿岸放流较多的品种还包括荔枝螺、缢蛏等沿岸滩涂底播增殖贝类[64]。山东省的贝类增殖品种则较为丰富，主要增殖品种包括文蛤、菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum、青蛤Cyclina sinensis、毛蚶Scapharca subcrenata、牡蛎 Ostrea gigas thunberg、魁蚶、竹蛏 Solen strictus、缢蛏等沿海护养的滩涂贝类，栉孔扇贝Chlamys farreri、虾夷扇贝、皱纹盘鲍、刺参Stichopus japonicus、海胆、紫石房蛤Saxidomus purpuratus等底播增殖的海珍品。然而国内对贝类标志技术的研究仍然停留在简单的物理标志技术，主要应用的包括打孔挂牌标志、黏贴挂牌标志、缺刻标志等，通常具有标志简单、成本低的特点，但又存在标志易脱落、携带的标志信息少等缺陷，而科技含量高的物理标志如微编码线标志技术（CWT）、被动整合雷达标志技术（PIT）、激光标志等方法较大程度提高了标志的保持效果，并具备了一定的标志追踪功能，但存在费用较高等应用瓶颈。国内在化学标志、生物标志及分子标志的应用更加欠缺。作为理想的贝类标志方法应该有如下的特点：（1）标志保持时间长，不易脱落、褪色；（2）标志易识别；（3）对标志贝类生理行为等损伤小；（4）标志过程易操作；（5）标志成本低；（6）标志携带信息量大；（7）可以在不杀死贝类的情况下跟踪标志信息。目前所采用的贝类标志方法大多只能满足部分研究的要求，迄今为止还未发现一种可以适用于贝类各方面研究的理想标志方法，仍有待于科技工作者进一步探索。

图1 几种标志方法示意图Fig.1 Shells with different marking method

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A Review of the Marking Methods Used in the Study of Shellfish

ZHOU Shan-shan,WANG Wei-ding,FENG Mei-ping,et al
(Marine and Fishery Institute of Zhejiang Ocean University,Marine Fisheries Research Institute of Zhejiang Province,Scientific Observing and Experimental Station of Fishery Resources for Key Fishing Grounds,MOA,Key Laboratory of Sustainable Utilization of Technology Research for Fishery Resources of Zhejiang Province,Zhoushan 316021,China)

Shellfish marking technology was widely used in shellfish population density,and resource recruitment,growth and genetic researches,and has become a shellfish population estimates,resource assessment,as well as an important means of migration and distribution.Nowadays,the studies in shellfish marking methods was relatively few,and still have difficult in shellfish marking because of the different shell type and complex habitat.This review briefly summarized the progress of research on shellfish marking methods,and the advantages and disadvanlages of using each marking method was discussed.We hope this review will support the application and research of shellfish marking method.

shellfish;marking methods;physical marking;chemical marking;biological marking;molecular marking

S932.6

A

1008－830X(2017)02－0172－08

2017-01-10

农业部公益性行业（农业）科研专项经费（201303047）

周珊珊（1988-），女，青海西宁人，博士，研究方向：海洋生态修复.E-mail:muxihuashan@126.com

王伟定.E-mail:wdwang@sohu.com