浙江沿海潮间带多毛类环节动物DNA条形码数据库初建

姚 瑞，谢斐昂，严安琪，陈永久,

（1.浙江海洋大学国家海洋设施养殖工程技术研究中心，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大学海洋科学与技术学院，浙江舟山 316022）

浙江沿海潮间带多毛类环节动物DNA条形码数据库初建

姚 瑞1，谢斐昂2，严安琪2，陈永久1,2

（1.浙江海洋大学国家海洋设施养殖工程技术研究中心，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大学海洋科学与技术学院，浙江舟山 316022）

多毛纲环节动物是形态学分类鉴定极为困难的一类海洋生物。本研究旨在构建浙江沿海常见多毛类的DNA条形码数据库。2015年1-10月期间，针对多毛类环节动物在浙江沿海潮间带进行了多次定性采样，并对样本进行了形态学鉴定以及线粒体COⅠDNA序列分析。从形态学上共鉴定了8个多毛类物种，隶属于4个科，即双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis、威氏围沙蚕 P.wilsoni、独齿围沙蚕P.cultrifera、杂色伪沙蚕Pseudonereis variegata、双管阔沙蚕Platynereis bicanaliculata、短毛海鳞虫Halosydna brevisetosa、岩虫Marphysa sanguinea、四索沙蚕Lumbrineris tetraura。共得到长度为680～930 bp的13条DNA序列，其中2条属于P.wilsoni、2条属于M.sanguinea的片段，这两个物种的序列还未在BOLD中收录；1条H.brevisetosa的COⅠ基因序列与GenBank上的同名序列差异较大。计算得到样本的种内平均遗传距离为2.8%，科内种间平均遗传距离为23.9%，科内种间距离远远大于种内距离；从而印证了COⅠ可作为多毛类动物分类的条形码。此外，本研究还设计了一对多毛类动物COⅠ片段的特异性引物，而且适用于扩增A+T含量较高的多毛类物种。

DNA条形码；线粒体COⅠ序列；形态学；多毛类；浙江沿海

多毛类是环节动物门最大的一个纲。包括80余科，1 600多个属，10 000多个已描述的种类[1]。多毛类动物大多生活在海洋生境中，是鱼类及其他动物的重要饵料，以及海洋资源调查的重要组成部分，也是海洋生物中尚待开发、利用和保护的潜在对象。然而，相比其他常见类群，如甲壳动物、软体动物、棘皮动物，多毛类分类学研究的进展最为缓慢[2]。目前，分类学家们已经意识到单以形态学方法来进行多毛类物种的分类鉴定显得极为繁琐和耗时[3]。国内外已经发表了许多关于海洋底栖生物多样性的文章，其中有关多毛类的鉴定也大多数使用科或属水平[4]。这是因为目前多毛纲动物还存在着许多不能确定的物种分化，许多类群缺少相关的分类学家；同时，由于受现阶段的采样方法和采样工具的限制，很难获得较为完整的多毛类样本，大多数样本都不完整且个体众多[5]。此外，多毛类动物具有复杂的生活史，不同生长发育阶段形态各异，加之隐生种的存在，给形态学分类带来了极大的挑战[6]。

对多毛类资源进行开发、利用和保护，都要求对形态相似的物种进行确切的划分。然而，仅依赖形态学分类显然难以满足这些要求，因此建立一套基于遗传信息的快速、高效、精确并且国际化的多毛类物种鉴定标准，这对提高海洋生物资源调查和海洋生态系统评估的效率和科学性具有深远的意义。2003年加拿大分类学家HEBERT等[7]提出以线粒体COI DNA序列作为普遍的动物DNA条形码。与形态学鉴定参考标准不同，DNA条形码是直接将采样个体与全球化的DNA条形码数据库中的序列信息进行比较[8]，从而较为客观、准确地鉴定物种；由于条形码检测对样本的完整程度和形态特征没有限制，故可用于鉴别多毛类碎片样本，以及不同生长生活阶段的个体。但是这一方法的真正推行，有赖于全球范围内的相关研究人员，以统一的标准、同一形式对尽可能多的多毛类物种进行条形码提取和数据库构建，以降低人为因素造成的误差[9]。

至今，以COⅠ基因为基础的条形码数据库BOLD（http://www.barcodinglife.org）已经覆盖了4 827 188个物种，但是关于多毛类的条形码只有10 430条，而其中鉴定到种这一分类阶元的仅有6 555个。从物种范围上看，大多数仅停留在特定属和种[10-12]，大量多毛类物种的条形码信息仍尚未报道。而从地理分布来讲，大多数研究的主要集中于美国—加拿大—阿拉斯加沿海，以及中国黄渤海沿海以及葡萄牙、挪威等地沿海[13]，其他海域和近海的研究十分匮乏。根据BOLD数据库（2014）的统计显示，虽然已描述的多毛类环节动物已有一万多种，但是仅793个物种的DNA条形码在BOLD上收录。

本研究为了构建浙江沿海多毛类环节动物的DNA条形码数据库，在浙江沿岸潮间带进行定性采样。结合形态学鉴定，通过对线粒体COⅠDNA序列测序和分析，探索一套较为系统、完整的条形码数据库构建的基本思路及关键技术，初步建立浙江沿海多毛类DNA条形码数据库，也为使我国多毛类物种鉴定早日摆脱繁琐、耗时的手工操作局面创造技术和数据条件。

1 材料与方法

1.1 样本采集与保存

本研究于2015年1月至10月期间，在浙江沿海潮间带进行了多次多毛类动物定性采样。采样地最北至舟山东极青浜岛，最南至苍南；涉及到泥沙相、沙相、岩相以及砾石相等多种潮间带底质环境。采样点包括舟山东极岛、朱家尖岛和六横岛，以及象山，温州洞头岛，平阳南麂列岛和苍南（图1）。采集采样深度不超过10 m。采样点的溶解氧（DO 值）在 0.768～0.938 mg/L，盐度在 28～33范围内。

采集到的活体样本带回实验室后，置于孔径0.5 mm的钢筛上，先用海水冲洗，再用蒸馏水浸泡活体30 s进行麻醉使其刚毛、疣足、触须等结构完全舒展，以便于观察，最后在解剖镜下进行形态学鉴定。对需要进行分子生物学鉴定的个体（每个采样点同一个物种选2～3个个体）在近尾部剪取2 mm3大小的肌肉组织样本置于95%的乙醇溶液中，以备提取总DNA。其余部分和其他个体也置于相同浓度的乙醇中，并放入硫酸纸标签密封保存，置于4℃标本陈列柜中长期保存。样本编号、采集地等信息见表1。

图1 采样点分布图Fig.1 Map shows sampling sites

1.2 形态学观察样本

本研究使用Optec光学解剖镜，对所有样本进行观察、解剖、对比，并参考《中国动物志·无脊椎动物门·多毛纲·沙蚕目》和《中国近海多毛环节动物》中各物种的分类特征[14-15]，对标本进行特征记录和绘图。对于刚毛和疣足上其他微小结构制作了临时装片，用Olympus-CX31光学显微镜对显微结构的观察，拍照和绘图。用数码显微镜对每一个物种进行整体拍照，辅以详细的形态描述，以达到准确鉴定的目的。

1.3 DNA提取和储存

在形态学鉴定的基础上，选取一部分具有物种和地理代表性的样本提取基因组总DNA。提取方法采用高盐法[16]。提取的总DNA溶于DEPC水或TE溶液，然后通过Thermo公司的Nanodrop 2000/2000C分光光度计检测DNA产品的OD260 nm、OD280 nm值，以及浓度和纯度，并用1%的琼脂糖凝胶电泳（160 V、80 A）检测DNA产品的质量。符合实验要求的DNA样本保存于-20℃冰箱中备用。

1.4 COⅠ基因PCR扩增

线粒体COⅠ基因的PCR扩增使用了2对引物，其中第一对参考FOLMER等[17]设计的引物；第二对是针对多毛纲环节动物自行设计的特异性引物PolyCoⅠF2（5‘-TCCACTAATCAYAAAGAYATTGG-3’）和PolyCoⅠR4（5‘-GCGAGTCATCTAAATACTTTAAT-3’）。两对引物使用前都经梯度PCR验证，引物设计使用Primer 3软件（http://primer3.ut.ee/）。根据引物的在已知COⅠDNA序列的位置，我们推算第一对引物可以扩增出750 bp，第二对可扩增出约900 bp的DNA片段，所有引物均由上海生工生物有限公司合成。

PCR 总体积为 25 μL 体系，反应体系为 1×Taq MasterMix(Dye)12.5 μL，模板 DNA 1 μL（＜10 ng），正、反向引物各1 μL（0.4 μM），灭菌的双蒸水9.5 μL。TaqMix为康维世纪有限公司的产品。扩增反应在PTC-100型PCR仪上进行，反应程序为先94℃预变性4 min；之后运行35个循环，即94℃变性45 s，46～48℃退火30 s，72℃延伸 1 min。循环结束后在72℃ 再延伸7 min使PCR产物稳定。扩增产物用Loading Buffer染色后，经混有绿如蓝荧光染料的1%的琼脂糖凝胶电泳分离，并用凝胶成像系统观察、拍照，检测扩增产物的质量。

1.5 DNA测序及序列分析

选取扩增质量良好的PCR产物寄往上海生工生物有限公司测序。每个样本都采用了双向引物测序，以确保所得序列的准确性。

所得到的双向序列采用Sequencher v5.4软件 (Gene Codes)进行核对、校正。校正好的序列采用BioEdit 7.0软件比对，剪去引物和首尾测序质量较差的部分，然后通过与GenBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）和BOLD数据库中收录的序列比对来确定物种。最后用MEGA 5.0软件[18]对排列好的全部序列进行Kimura双参数（K-2-P）遗传距离分析，并采用邻接法（Neighbor-joining，NJ）聚类。聚类树的置信度采用10 000次Bootstrap重采样检验。

2 结果

2.1 形态学鉴定结果

通过对采集获得的样本进行形态学观察、记录，参考多毛类形态学分类著作，依据口前叶结构、颚齿形状和排列方式、疣足和刚毛结构等主要形态学分类学标志。本研究收集到的样本共鉴定得到了8个多毛类物种，即双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis、威氏围沙蚕P.wilsoni、独齿围沙蚕P.cultrifera、杂色伪沙蚕Pseudonereis variegata、双管阔沙蚕Platynereis Bicanaliculata、短毛海鳞虫Halosydna brevisetosa、岩虫Marphysa sanguinea、四索沙蚕 Lumbrineris tetraura。其中 P.aibuhitensis、P.wilsoni、P.cultrifera三个物种隶属于围沙蚕属 Perinereis；P.variegata属于伪沙蚕属 Pseudonereis；P.bicanaliculata属于阔沙蚕属Platynereis；Perinereis、Pseudonereis、Platynereis这三个属都归于沙蚕目沙蚕科。H.brevisetosa属于叶须虫目背鳞虫科的海鳞虫属Halosydna；而M.sanguinea和L.tetraura则都是属于矶沙蚕目的物种，前者属于矶沙蚕科岩虫属Marphysa，后者是索沙蚕科索沙蚕属Lumbrineris的物种，具体分类学信息见表1。

2.2 线粒体COⅠDNA序列分析

本研究获得了13个样本的线粒体COⅠDNA序列，其中12条是由第一对引物扩增获得，长度约为680 bp；只有样本KY129886是第二对引物扩增获得，长度约为930 bp。所得的序列都编辑成长度为590 bp的片段进行变异指数、单倍型、遗传距离以及聚类分析。分析表明，COⅠ片段中T，C，A，G的平均含量分别为31.4%，24.9%，26.7%，17.0%；A+T含量（58.1%）显著高于G+C含量（41.9%）。具体见表1。

所有13条DNA都提交至GenBank。每一条序列都给予唯一的GenBank登录号，对应于样本编号，以便后续的工作。BLAST搜索发现，只有部分序列样本在GenBank中可找到相似度高于99%的同源序列（表1）。BOLD数据库查找表明，除了KY129888、KY129889这两个样本所属物种与KY129890所对应物种没有被BOLD确认外，给出的其余物种与本研究得到的形态学鉴定结果一致。

一个来自于舟山东极岛的样本KY129886与GenBank参考序列（HM473396.1）相似度仅为88%。该参考序列的物种为Halosydna brevisetosa，2010年7月上传至BOLD，标本采集地为加拿大不列颠哥伦比亚省沿海。本研究中采自东极的一个样本（GenBank登录号KY129886）在BOLD数据库中较早发布的H.brevisetosa序列相似度达100%。根据本实验形态学鉴定的结果，KY129886可以认定为H.brevisetosa。KY129888和KY129889这两个样本与GenBank参考序列（KC800623）相似度为94%；根据形态学鉴定结果，它们应属于Perinereis wilsoni。但是BOLD数据库中缺少该序列相应的形态学和图片信息，故本研究将其序列和形态学和图片数据共同上传于BOLD数据库作为条形码。此外，KY129890这个样本与GenBank参考序列，KF733802的相似度达99%。在BOLD数据库中缺乏这些序列的参考物种信息，结合本研究的形态学和分子学两方面鉴定结果，我们认为KY129890属于Marphysa sanguinea。并将其序列和形态学和图片数据共同上传于BOLD数据库作为条形码。

2.3 聚类关系与遗传距离

从图2 NJ聚类树上可以看出，13个样本可清晰地分为8个物种，即双齿围沙蚕、威氏围沙蚕、独齿围沙蚕、杂色伪沙蚕、双管阔沙蚕、短毛海鳞虫、岩虫Marphysa sanguinea、及四索沙蚕。在NJ聚类关系中，围沙蚕属Perinereis的三个物种没有形成单系群。在聚类树上，采用形态学鉴定的八个物种与来自GenBank的八条参考物种序列相吻合，即 Pseudonereis variegata，Platynereis bicanaliculata，Perinereis wilsoni，P.cultrifera，P.aibuhitensis，Marphysa sanguinea，Lumbrineris tetraura，Halosydna brevisetosa. 与 JX503027、GU362685、KC800623、KC80062、KF611806、KF733802、EU352318、及 HM473400 分别聚成置信度极高（Bootstrapping值均为100%）的单系群。

表1 采集样本的信息包括拉丁名、采集地、CO I DNA GenBank登陆号、A+T 含量、形态学鉴别的特征（触角、触手、触须、眼、颌、颚齿）；以及来自GenBank参考物种序列的登陆号、BLAST 比对的相似度Tab.1 Sample information including scientific name, collection site, GenBank accession code for CO I DNA, A+T content, and characters used in morphological identification (palp, tentacle, tentacular cirri, eye, jaws), as well as accession code for reference sequence

本研究中的13条序列样本属于4个科，即沙蚕科Nereidae、矶沙蚕科Eunicidae、索沙蚕科Lumbrineridae和背鳞虫（亚）科Lepidonotinae。沙蚕科Nereidae 包括3个属Pseudonereis、Perinereis、Platynereis；矶沙蚕科Eunicidae有1个属Marphysa；索沙蚕科有1个属Lumbrineris，背鳞虫亚科Lepidonotinae有1个属Halosydna。故按各个科物种计算种内遗传距离，由于沙蚕科Nereidae有3个属Pseudonereis、Perinereis、Platynereis，故以此计算科内种间遗传距离。不同分类水平上，种内、科内种间及科间的Kimura双参数距离数据汇总于表2。种内平均遗传距离为2.8%，在0.2%～14.3%的范围内波动，而科内种间平均遗传距离为23.9%，在20.6%～26.9%的范围内波动；科间平均遗传距离为31.3%，在28.1%～35.5%范围内波动。显然，科内种间平均遗传距离远大于种内平均遗传距离，且前者最小值也大于后者最大值，两者已形成了遗传距离上的沟壑。

表2 基于13个多毛类样本及8个参考物种CO I DNA序列计算得到的种内、科间种内及科间的K-2-P遗传距离，包括平均值、最小值、及最大值Tab.2 The mean,minimum,and maximum values of K-2-P distances within species,between species within family and between families

图2 基于COⅠDNA序列的多毛类NJ聚类树Fig.2 NJ tree of polychaetes based on COⅠDNA sequences

3 讨论

3.1 多毛类线粒体COⅠPCR的引物

与其他无脊椎动物相同，多毛纲动物COⅠDNA序列A+T含量较高。本研究所有样本A+T的平均含量高达58.1%，其中Marphysa sanguinea的A+T含量最低为56.5%，而Halosydna brevisetosa则高达60.4%。A+T含量高一方面使得多毛类COⅠ基因序列PCR扩增时必须要使用较其他类群更低的退火温度，一般是48℃左右，H.brevisetosa等物种需要46℃。较低的退火温度造成了PCR产物纯度下降，增加了该物种COⅠDNA片段扩增及测序的难度。另一方面，大量重复的A、T核苷酸，往往导致引物很难结合到模板DNA上，从而使PCR反应终止。在本次研究中，特别是H.brevisetosa等几个物种未能用FOLMER等[17]的引物扩增出COⅠDNA片段。针对这一问题我们专门设计了适用于高A+T含量的多毛类物种COⅠDNA的一对特异性引物，即PolyCoⅠF2和PolyCoⅠR4。经过测试，发现PolyCoⅠF2和PolyCoⅠR4这对引物组合扩增效果比较稳定，并成功测定了长度为930bp的COⅠDNA序列，其中一条在此研究中报道。

对于A+T含量高的多毛类物种COⅠDNA序列来说，与FOLMER等的引物相比，新设计的引物跨过了A、T核苷酸大量重复的区域，特别是反向引物PolyCoⅠR4与FOLMER等的COⅠ2198相比，不但与正向引物相距更远，而且几乎完全位于多毛类COⅠ基因的序列保守区上，因此对于高A+T含量的多毛类物种，采用本研究设计的引物可以扩增片段更长、特异性更高的COⅠDNA片段，在多毛类环节动物DNA条形码研究中具有明显的优势。

3.2 多毛类分类与DNA条形码数据库

根据形态学，本研究共鉴定了8个物种，均得到了GenBank中DNA数据的有力支持，形态学与DNA鉴定结果一致。获得的长度为930 bp的一个样本序列，以及长度为680 bp的12个样本序列都已上传至GenBank。同时，条形码图片和形态学信息已上传至BOLD数据库。目前，BOLD数据库中，关于多毛类的信息共有10 430条，其中鉴定到种分类阶元的仅6 555条。相比其他类群，多毛类数据库规模还极为有限，本研究在一定程度上使多毛类动物条形数据库得到有效扩充，但仍需补充更多的样本。

GenBank中仅有一个来自山东青岛的威氏围沙蚕COⅠDNA序列，尚缺少相关文献支持，而且BOLD数据库也没有相应的形态学和图片信息。本实验经过反复地形态学观察，以及COⅠDNA序列比对认为KY129888等两个样本属于威氏围沙蚕。得到的630 bp DNA序列及相关的图片信息已上传至BOLD数据库暂作为该物种条形码。由于刘瑞玉[19]编著的《中国海洋生物名录》一书中，东海区并不是该物种的分布区，而且该3个COⅠ序列与青岛报道的该物种相似度仅为94%，因此采自浙江沿海的P.wilsoni个体是否为隐生种还需要通过核DNA信息对比进行验证。但是根据CHRISTOPHER等[20]在2006年的文章，可以推知P.wilsoni其实是属于多齿围沙蚕的一个类群。台湾地区是多齿围沙蚕主要分布区域，本研究采集到的该物种样本均来自于浙江南部海域，该海区与台湾海域相连，而且夏季黑潮的次表层水和台湾海峡暖水团混合形成台湾暖流，沿着闽浙槽状凹地北上，一直达到长江口[21]。加上东南季风影响势力很大，多毛类幼虫期的担轮幼虫营浮游生活，因此多齿围沙蚕幼体很有可能随洋流到达浙南、闽北一带海域。此外，由于其翻吻Ⅲ区两侧各有一排圆锥形颚齿，而本地种多齿围沙蚕并无这一特征。故我们认为这几个样本属于威氏围沙蚕，而且很有可能与台湾的威氏围沙蚕属于同一类群。但若要验证这一假设还需要台湾的样本作比较，从而进一步说明其分布特点。

经过COⅠDNA序列比对，采自苍南的KY129876和象山的KY129877样本属于四索沙蚕L.tetraura。由于长叶索沙蚕L.longiforlia和四索沙蚕在形态上极为相近，因此仅形态学鉴定很可能导致误判，这也进一步说明了DNA条形码在海洋多毛类动物分类学上有着巨大的优势和应用前景。

从Kimura双参数的遗传距离看，种内平均遗传距离为2.8%，而沙蚕科内种间平均遗传距离为23.9%，科内种间距离远远大于种内距离。而且种内和科内种间遗传距离之间存在明显的分歧，说明COⅠ序列完全可以作为多毛类环节动物分类鉴定的分子条形码。

虽然多毛类多数类群的成体迁移能力较低，但幼体可浮游，因而分布范围十分广泛。这类海洋生物适应能力极强，在多种生境下均可生存，因而又形成了适应各地相应生态环境的类群。来自于舟山东极贻贝养殖场的短毛海鳞虫样本经形态学和分子生物学（BOLD数据库相似度为100%）共同验证属于短毛海鳞虫。但是BLAST的结果显示，该样本与GenBank中的参考序列HM473396相似度仅为88%。由于本研究缺少该物种足够的DNA序列样本，因此下载了GenBank中的HM473396一起进行分析和遗传距离计算，由此造成该物种种内遗传距离高达13.48%。多毛纲属于高级无脊椎动物，起源于距今大约6亿年的寒武纪时期，进化历史相当漫长[14]。加拿大不列颠哥伦比亚省和浙江省舟山东极岛有太平洋的阻隔，且在漫长的地质时代里，这两个地区没有汇合过，反而随着太平洋板块的扩大而不断远离，地理隔离显著[2]，因而来自于这两个采样点的短毛海鳞虫群体长期缺少基因交流，两者的COⅠDNA序列可变位点的低频突变也就分别被保留了下来。同时，由于该类群多附着于其他生物群落或者栖息于大的龙介虫栖管中，其栖息地生态环境相对稳定，受自然选择压力较小，因此在外形上并未发生明显的分化，一些主要形态学鉴别特征仍然一致[1]。但是鉴于本研究的实验数据，我们推测我国东海的短毛海鳞虫群体和加拿大地区的群体已经发生了分化。由于本研究分析的样本数较少，因此未能充分验证东海的短毛海鳞虫是否属于隐生种，准确鉴定还需要进一步的数据支持。

此外，聚类结果显示，围沙蚕属的三个物种不是一个单系群。由于围沙蚕属的物种都属于全球范围内的广布种，生物多样性极高，因此不断有隐生种被报道，且该属所包含的物种也时常被调整，故该类群也是目前多毛类研究的一个热门。随着双齿围沙蚕的人工养殖的不断规模化，对该类群其他物种的研究也必将不断深入。

[1]廖秀珍.海洋底栖多毛类的分子系统发育学研究[D].厦门:厦门大学,2006.

[2]吴旭文.中国海矶沙蚕和欧努菲虫科的分类学和地理分布研究[D].青岛:中国科学院海洋研究所,2013.

[3]COULL B C.Role of meiofauna in estuarine soft-bottom habitats[J].Australian Journal of Ecology,1999,24:327-343.

[4]ROUSE G W,PLEIJEL F.Polychaetes[M].Oxford:Oxford University Press,2001:354.

[5]SCHANDER C,WILLASSEN E.What can biological barcoding do for marine biology[J].Mar Biol Res,2005,1(1):79-83.

[6]KNOWLTON N.Sibling species in the sea[J].Annu Rev Ecol Syst,1993,24:189-216.

[7]HEBERT P D N,CYWINSKA A,SHELLEY L,et al.Biological identifications through DNA barcodes[J].Proceedings of the royal society B,Biological Sciences,2003,270(1512):313-321.

[8]RADULOVICI A E,ARCHAMBAULT P,DUFRESNE F.DNA barcodes for marine biodiversity:moving fast forward[J].Diversity,2010,2:450-472.

[9]COSTA F O,CARVALHO G R.The Barcode of Life Initiative:synopsisand prospective societalimpacts of DNA barcoding of Fish[J].Genomics,Society and Policy,2007,3:29-40.

[10]JOLLY M T,VIARD F,GENTIL F,et al.Comparative phylogeography of two coastal polychaete tubeworms in the Northeast Atlantic supports shared history and vicariant events[J].Molecular Ecology,2006,15:1 841-1 855.

[11]BERKE S K,MAHON A R,LIMA F P,et al.Range shifts and species diversity in marine ecosystem engineers:patterns and predictions for European sedimentary habitats[J].Global Ecology and Biogeography,2010,19:223-232.

[12]SAMPERTEGUI S,ROZBACZYLO N,CANALES-AGUIRRE C B,et al.Morphological and molecular characterization of Perinereis gualpensis(Polychaeta:Nereididae)and its phylogenetic relationships with other species of the genus off the Chilean coast,Southeast Pacific[J].Cahiers de Biologie Marine,2013,54:27-40.

[13]LOBO J,TEIXEIRA M A L,BORGES L M S,et al.Starting a DNA barcode reference library for shallow water polychaetes from the southern European Atlantic coast[J].Molecular Ecology Resources,2016,16(1):298.

[14]孙瑞平,杨德渐.中国动物志无脊椎动物第三十三卷环节动物门多毛纲[M].北京:科学出版社,2004:1-520.

[15]杨德渐,孙瑞平.中国近海多毛环节动物[M].北京:农业出版社,1988:1-352.

[16]ALIJANABI S M,MARTINEZ I.Universal and rapid salt-extraction of high quality genomic DNA for PCR-based techniques[J].Nucleic Acids Research,1997,25(22):4 692-4 693.

[17]FOLMER O,BLACK M,HOEH W,et al.DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates[J].Molecular Marine Biology&Biotechnology,1994,3(5):294-299.

[18]TAMURA K,PETERSON D,PETERSON N,et al.MEGA5:Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood,evolutionary distance,and maximum parsimony methods[J].Mol Biol Evol,2011,28:2 731-2 739.

[19]刘瑞玉.中国海洋生物名录[M].北京:科学出版社,2008:1-1 267.

[20]CHRISTOPHER J,HSIEH H L.New Species and New Records of the Perinereis nuntia Species Group (Nereididae:Polychaeta)from Taiwan and Other Indo-West Pacific Shores[J].Zoological Studies,2006,45(4):553-577.

[21]郭炳火,林 葵,宋万先.夏季东海南部海水流动的若干问题[J].海洋学报,1985,7(2):143-153.

Development of DNA Barcode Reference Library for Polychaetous Annelids Identified from the Coastal Intertidal Zone of Zhejiang Coastal Sea

YAO Rui1,XIE Fei-ang2,YAN An-qi,et al
(1.National Engineering Research Center for Mariculture,Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022;2.Marine Science and Technology School of Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022,China)

It remains a big challenge for accurate identification of marine polychaetous annelids solely depending on morphology.This study aimed to develop a DNA barcode reference library for polychaetes collected from intertidal zones of Zhejiang coastal sea during the period from January to October,2015.Samples were selected for mitochondrial COⅠDNA sequence analysis after morphological examination.Eight species from fourfamilies,i.e.Perinereis aibuhitensis,P.wilsoni,P.cultrifera,Pseudonereis variegata,Platynereis bicanaliculata,Halosydna brevisetosa,Marphysa sanguinea and Lumbrineris tetraura were identified from 13 COⅠ DNA sequences at the length of 680-930 bp;two sequences of P.wilsoni and two sequences of M.sanguinea are unavailable in BOLD’s collection;one sequence shares 88%similarity with a sequence of H.brevisetos on Gen－Bank;The average K-2-P distance within species is 2.8%and between species within family is 23.9%.The significant gap in K-2-P distance between-species and within-species suggests that COⅠsequence is suitable for DNA barcoding in Polychaeta.In addition,we designed a pair of primers for amplifying CO I DNA fragment of polychaete species,especially of species that have high A+T composition in the gene.

DNA barcoding;mitochondrial COⅠsequence;morphology;polychaete;Zhejiang coastal sea

Q959.192

A

1008－830X(2017)02－095－08

2016-11-02

科技部基础性工作专项（2014FY110500）

姚瑞（1992-），男，河南平顶山人，硕士研究生，研究方向：海洋生物学.

陈永久（1969-），男，浙江舟山人，博士，副教授，研究方向：海洋生物学.E-mail:yongjiu.chen@gmail.com