沙蒿籽总黄酮和总多酚及其抗氧化活性

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(1.陕西省食品绿色加工与安全控制工程实验室,陕西西安 710119;2.陕西师范大学食品工程与营养科学学院,陕西西安 710119;3.中国农业科学院农产品加工研究所,北京 100193)

沙蒿籽总黄酮和总多酚及其抗氧化活性

郜安宁1,2,周志昊1,2,黄峰3,邵红军1,2,张泓3,*,杨兴斌1,2,*

(1.陕西省食品绿色加工与安全控制工程实验室,陕西西安 710119;2.陕西师范大学食品工程与营养科学学院,陕西西安 710119;3.中国农业科学院农产品加工研究所,北京 100193)

本文测定了沙蒿籽的四种不同极性溶剂提取物中总黄酮和总多酚的含量、化学成分及其体外抗氧化活性。结果显示:沙蒿籽总黄酮和总多酚的提取含量与溶剂的极性相关,甲醇提取物的总黄酮(33.30±0.11) mg/g和总多酚(80.1±0.16) mg/g含量最高,其次是丙酮和乙酸乙酯提取物,氯仿提取物含量较低。相对应的是,甲醇提取物的DPPH和ABTS自由基清除能力最强,其IC50分别是19.09、26.30 μg/mL,其铁离子还原能力也明显高于其它三种提取物。通过HPLC法检出槲皮素和儿茶素两种黄酮,均在甲醇提取物中含量最高,分别为5.15、28.24 mg/g。这表明,甲醇更适宜于沙蒿籽中总多酚和总黄酮的提取,这为沙蒿籽作为抗氧剂的开发利用提供了理论依据。

沙蒿籽,总黄酮,总多酚,抗氧化活性

白沙蒿(AretmsiaspshaerocephalaKrasch)是菊科蒿属多年生、超旱生沙生植物,又名黄蒿、籽蒿或黄毛菜籽、圆头沙蒿,广泛分布在我国腾格里沙漠、乌兰布和沙漠等西北部地区[1-3]。白沙蒿植株产籽量大,枝叶常作为饲料,籽粒药食兼用,我国西北地区就有使用沙蒿籽粉增加面条延展性的习惯[4-5]。现对沙蒿籽的研究多集中于沙蒿油、沙蒿多糖和沙蒿胶,研究发现沙蒿油中不饱和脂肪酸含量高于90%,且富含维生素E[6]。沙蒿多糖具有显著的抗氧化、降血糖和抗肿瘤活性[7-8],而沙蒿胶可起到改善食品口感,增加食品持水性、稳定性的作用[9-10]。

更为重要的是,沙蒿富含黄酮等生物活性成分。张杰对白沙蒿全草的化学成分进行了研究,从中分离鉴定出了包括橙皮素、金合欢素、金圣草黄素在内的11个黄酮类化合物;赵东保等也在沙蒿的乙醇提取物中分离并鉴定出了8种黄酮类化合物[11-14]。但目前对沙蒿籽总黄酮、总多酚的提取及活性研究鲜有报道。因此,本研究以沙蒿籽为研究对象,研究不同溶剂提取对沙蒿籽中总黄酮和总多酚的影响,并测定其抗氧化活性,以期为沙蒿籽植物资源在食品、医药等领域的广泛应用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

沙蒿(AretmsiaspshaerocephalaKrasch)籽 购于甘肃武威,根据《中华人民共和国药典》的鉴定标准,经鉴定为白沙蒿籽;DPPH、TPTZ、ABTS、乙酸乙酯、没食子酸 Sigma公司;标准品(原儿茶酸、儿茶素、表儿茶素、咖啡酸、阿魏酸、芦丁、槲皮素) 中国药品生物制品所;乙腈、甲醇 色谱级,美国Honeywell公司;Folin-Ciocalteu 上海瑞谷生物科技公司;其它试剂 均为分析纯。

LC-2010A高效液相色谱 日本shimadzu公司;Multiskan Go全波长酶标仪 美国热电公司;MILLI-Q超纯水仪 美国MILLIPORE公司;Q/BKYY31-2000电热恒温鼓风干燥箱 上海跃进医疗机械厂;R-3型旋转蒸发仪 BUCHI公司。

1.2实验方法

1.2.1 提取物的制备 将干燥的沙蒿籽粉碎过60目筛得沙蒿籽粉末,分别精密称取20 g沙蒿籽粉末,按照1∶20 (g/mL)比例分别加入甲醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿于室温下浸提24 h,重复浸提三次,合并不同溶剂提取滤液并用无水硫酸钠干燥,后于40 ℃减压浓缩,得到沙蒿籽不同溶剂粗提取物浸膏。精密称取各提取物浸膏10 mg,分别用甲醇溶解置于-4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 总多酚含量的测定 总多酚标准曲线建立:利用Folin-Ciocalteu法测定样品总多酚(total polyphenols content,TPC)含量[15]。精确称取0.2 g没食子酸(Gallic acid)标准品,用50%乙醇定容至1000 mL,分别取0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL标准品,各加入福林酚试剂2.4 mL,充分振荡后静置3～4 min,再分别加入12%的Na2CO3溶液4.8 mL,用50%的乙醇定容至10 mL容量瓶中。室温条件下避光反应2 h,以试剂空白为对照,在760 nm波长下测定吸光度值,记录实验数据,以浓度为横坐标吸光度值为纵坐标作标准曲线,得回归方程为Y=0.616X+0.11,R2=0.9941。配制浓度为1 mg/mL的不同溶剂提取物样品溶液,取1 mL按照标准曲线的操作步骤进行反应,之后测定吸光度值,重复三次并记录。根据没食子酸测定的标准曲线,计算出样品中的TPC含量,表示为没食子酸当量(GAE,mg GAE/g提取物)。

1.2.3 总黄酮含量的测定 总黄酮标准曲线的建立:黄酮含量用NaNO2-Al(NO3)3比色法[16]测定。精确称取0.25 g芦丁,用50%乙醇溶解,稀释到1000 mL,分别吸取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2、2.4 mL芦丁溶解液,加入0.4 mL 5% NaNO2,室温静置6 min;然后加入0.4 mL的10% Al(NO3)3,放置6 min后再加入4%的NaOH 4.0 mL,摇匀使其充分反应,加50%乙醇定容至10 mL,放置15 min使其反应充分,在510 nm波长处测定吸光度大小,记录实验数据,以浓度为横坐标吸光度值为纵坐标作标准曲线,得回归方程为Y=0.6732X-0.1111,R2=0.9961。取1 mL不同溶剂提取物样品溶液,按上述操作步骤进行反应,测定其吸光值,重复三次并记录。以芦丁作为标准曲线,样品中总黄酮的含量表示为芦丁当量(RE,mg RE/g提取物)。

1.2.4 样品化学成分的HPLC分析 采用色谱条件[17]:色谱柱:Venusil C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相A:含0.5%的甲酸水溶液,流动相B:乙腈/甲醇,80∶20,v/v,梯度洗脱程序设置为:0～5 min,8%溶剂B;5～15 min,8%～16% B;15～40 min,16%～30% B;40～55 min,30%～60% B;55～60 min,60% B;60～70 min,60%～30% B。柱温为30 ℃,流速为1.0 mL/min,进样量:20 μL,检测器:UV检测器,检测波长:280 nm。样品经0.45 μm滤膜过滤后进样。根据标准品的保留时间和浓度对样品中的黄酮和酚类化学成分进行定性和定量分析。

1.2.5 抗氧化性的测定

1.2.5.1 样品对DPPH自由基的清除作用 参照文献[18-19]的方法并稍作修改,评价样品溶液对DPPH自由基的清除能力。将3.0 mL DPPH(0.1 mmol/L)溶液与1.0 mL不同浓度的样品溶液分别加入试管中,充分混合,黑暗处理30 min,在517 nm处测定吸光值A1,相同条件下的DPPH自由基吸光度值A0为对照。样品对DPPH的清除率按以下方法计算:

DPPH自由基清除率(%)=(A0-A1)/A0×100

1.2.5.2 样品对ABTS自由基的清除作用 参照之前的测定方法[20]。配制ABTS自由基母液,将7 mmol/L的ABTS溶液和2.45 mmol/L的过硫酸钾等体积混合后,室温条件下避光12 h以便生成ABTS自由基。将ABTS自由基母液用甲醇适当稀释作为工作液使用。取0.5 mL的样品溶液和2.7 mL的ABTS自由基工作液在30 ℃下混合均匀并孵育6 min,在745 nm条件下测定其吸光值As,以在相同条件下0.5 mL甲醇和2.7 mL的ABTS自由基工作液的混合溶液的吸光值AC为对照,每个样品对ABTS自由基的清除能力用以下公式进行算:

ABTS自由基的清除率(%)=(Ac-As)/Ac

1.2.5.3 铁离子还原能力 分别取浓度为50、100、200、400、800、1000 μmol/mL的FeSO4·7H2O溶液0.5 mL,加入4.5 mL FRAP试剂(由0.3 mol/L醋酸缓冲液、25 mL 10 mmol/L TPTZ溶液、2.5 mL 20 mmol/L FeCl3溶液及2.5 mL组成),室温下静置30 min,于593 nm处测定吸光值,记录实验数据,以FeSO4浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标制作标准曲线。按照标准曲线的制作方法,取浓度为1 mg/mL的样品溶液0.5 mL,加入FRAP试剂,静置后于593 nm处测定吸光值,空白组由甲醇溶液代替样品溶液,样品的还原能力以达到相同吸光度值所用μmol Fe2+/g表示,FRAP值越大表示其抗氧化活性越高[21]。

1.2.6 数据处理分析 所有实验均重复测定3次,所有数据均用Origin 7.0软件处理作图,并采用DPS 9.5数据处理系统进行显著性分析。数据表示为平均值±标准偏差,p<0.05认为具有显著性差异。

2 结果与讨论

2.1总多酚和总黄酮含量

用不同溶剂提取的沙蒿籽中总多酚和总黄酮含量测定结果如表1所示。从表1中可以看出,沙蒿籽中总多酚和总黄酮含量随着提取溶剂的不同有明显差异,溶剂极性越大,总多酚和总黄酮含量越高。其中,甲醇溶剂提取物的总多酚和总黄酮含量最高,其次分别是丙酮提取物、乙酸乙酯提取物和氯仿提取物。

表1 沙蒿籽不同溶剂提取物的总多酚和总黄酮含量Table 1 The total polyphenolic content and total flavonoids indifferent solvent extracts of A. sphaerocephala Krasch seeds content

2.2 HPLC分析

进一步利用HPLC对标准品与样品进行了分析,7种标准品色谱图如图1(A)所示,在测定条件下7种标准品实现了良好的分离。从图1(B～E)可知,不同极性溶剂的提取物组分和含量差异明显,甲醇和丙酮大极性提取物中黄酮类化合物种类较氯仿提取物的多,这与Alothman对三种热带水果不同极性提取物中黄酮类化合物含量的研究结果一致,大极性溶剂提取物的黄酮含量也比较高[22-23]。将样品色谱图与标准品色谱图对照,发现沙蒿籽提取物中存在槲皮素和儿茶素2种化合物,槲皮素在4种提取物中均有检出,含量在0.49～5.15 mg/g之间;而儿茶素仅在甲醇和丙酮提取物中检测出,含量分别为28.24、24.26 mg/g。

图1 沙蒿籽不同溶剂提取物的液相色谱图Fig.1 The chromatogram of the different solvent extracts of A.sphaerocephala Krasch seeds注:A～E分别表示黄酮类标准品、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿提取物的液相色谱图;1-原儿茶酸;2-儿茶素;3-表儿茶素;4-咖啡酸;5-阿魏酸;6-芦丁;7-槲皮素。

图2 沙蒿籽不同溶剂提取物对DPPH的清除作用Fig.2 The DPPH radical scavenging ability of the different solvent extracts of A. sphaerocephala Krasch seeds

2.3抗氧化性的测定

2.3.1 DPPH的清除作用 DPPH是一种稳定自由基,其电子在517 nm附近有较强的吸收峰,在实验中常被用来检测物质的自由基清除活性。由图2可以看出,DPPH自由基的清除率随着不同溶剂提取物的浓度的增加而增加,并在该浓度范围内(10～50 μg/mL)呈现出一定的量效关系,其中甲醇提物对DPPH自由基的清除能力最强,其IC50值为19.09 μg/mL,其次是丙酮提取物,IC50值为23.27 μg/mL。不同溶剂提取物清除DPPH自由基能力由大到小分别是:甲醇提取物>丙酮提取物>乙酸乙酯提取物>氯仿提取物,不同溶剂提取物之间清除能力差异显著(p<0.05),这一结果与刘曦等人对不同溶剂提取蓝莓叶的活性成分研究所得到的甲醇提取物总黄酮含量最高,抗氧化能力最强的结果一致[24-26]。

2.3.2 ABTS自由基的清除作用 不同溶剂提取物在不同浓度条件下对ABTS自由基的清除效果如图3所示。结果表明,各样品有一定的清除ABTS自由基的能力,且仍是甲醇提取物活性最好,在浓度为100 μg/mL时,清除率高达90.02%，其IC50是26.30 μg/mL,丙酮提取物次之,为89.24%,在浓度为80 μg/mL时,极性由大到小,各提取物的ABTS自由基清除率分别是89.41%、88.56%、75.69%、62.84%。不同溶剂提取物的ABTS自由基清除率,分别是甲醇提取物>丙酮提取物>乙酸乙酯提取物>氯仿提取物。甲醇、丙酮、乙酸乙酯及氯仿提取物组间差异显著(p<0.05)。

图3 沙蒿籽不同溶剂提取物对ABTS的清除作用Fig.3 The ABTS radical scavenging ability of the different solvent extracts of A. sphaerocephala Krasch seeds

2.3.3 铁离子还原能力 由图4可知,不同溶剂提取物均有一定的抗氧化活性,其对铁离子的还原能力存在明显差异,其中甲醇提取物的活性最强(920.45 μmol Fe2+/g),而氯仿提取物的活性最弱(621.76 μmol Fe2+/g)。

图4 沙蒿籽不同溶剂提取物铁离子还原能力Fig.4 The ferric-reducing power assay of the different solvent extracts of A. sphaerocephala Krasch seeds

2.4不同溶剂提取物中总多酚、总黄酮含量与抗氧化活性的相关性

4种溶剂提取物中总多酚、总黄酮含量与抗氧化活性的相关系数如表2所示。总多酚与DPPH、ABTS、FRAP的R2分别是0.96、0.88、0.89,相关性显著,表明沙蒿籽提取物中总多酚含量的高低反映了其抗氧化能力的强弱,提取物中总多酚含量增加,抗氧化活性也随之增加。这与Alothman M等人的研究结果一致[23]。总黄酮与抗氧化活性的相关系数分别是0.80、0.92、0.63,有显著的正相关性(p<0.05)。

表2 提取物中总多酚、总黄酮含量与抗氧化活性的相关性Table 2 The correlation between content of the total polyphenolic content and total flavonoids and the antioxidant activity of different extracts

注:*:相关性显著,p<0.05。

3 结论

研究了4种溶剂提取对沙蒿籽中总黄酮和总多酚含量及抗氧化活性的影响,发现提取物总黄酮和总多酚的含量与提取溶剂极性正相关,甲醇提取物总黄酮和总多酚的含量最高,体外抗氧化活性最强。同时,不同溶剂提取物中黄酮类化合物种类也有所差别,甲醇和丙酮提取物中含有儿茶素和槲皮素两种常见黄酮类物质,而氯仿和乙酸乙酯提取物中仅有槲皮素。

沙蒿籽是营养和食品加工价值兼具的野生食用资源,本研究对沙蒿籽粒抗氧化活性的研究结果表明沙蒿籽具有开发为天然抗氧化剂的潜力,同时其体内抗氧化活性和抗氧化机理有待深入研究。

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Totalflavonoidsandtotalpolyphenoliccontent,anditsantioxidantabilityofArtemisiasphaerocephalaKraschseeds

GAOAn-ning1,2,ZHOUZhi-hao1,2,HUANGFeng3,SHAOHong-jun1,2,ZHANGHong3,*,YANGXing-bin1,2,*

(1.Shaanxi Engineering Laboratroy for Food Green Processing and Security Control,Xi’an 710119,China;2.College of Food Engineering and Nutritional Science,Shaanxi Normal University,Xi’an 710119,China;3.Institute of Food Science and Technology,Chinese Academy of Agriculture Sciences,Beijing 100193,China)

The total flavonoids content(TFC),total polyphenoliccontent(TPC),chemical composition and antioxidant activity of the different solvent extracts ofArtemisiasphaerocephalaKrasch seeds were investigated. The results showed that the TFC and TPC were correlated with the polarity of solvents used here,the methanol extracts was showed to contain the highest level of TFC(33.30±0.11) mg/gand TPC(80.1±0.16) mg/g which followed by acetone,ethyl acetate and chloroform extracts. Furthermore,the methanol extracts was the most potent DPPH and ABTS radical-scavenger,the inhibitory concentration 50%(IC50)were 19.09,26.30 μg/mL,respectively. The ferric reducing activity of the methanol extracts was also higher than the other three extracts. Meanwhile,both quercetin and catechin were validated by HPLC in the methanol extracts with higher content of 5.15,28.24 mg/g,respectively. In short,methanol is suitable for the total polyphenolic and flavonoids extraction from seeds ofA.sphaerocephalaKrasch,and the extracts might be a valuable antioxidant resource.

ArtemisiasphaerocephalaKrasch seeds;total flavonoids;total polyphenols;antioxidant activity

2017-02-07

郜安宁(1993-)，女，在读硕士研究生，研究方向：食品营养与卫生，E-mail：anningg123@163.com。

*通讯作者:张泓(1958-)，男，博士，研究员，研究方向：食品工程，E-mail:zhanghong03@cas.cn。 杨兴斌(1969-)，男，博士，教授，研究方向：食品科学与工程，E-mail：xbyang@snnu.edu.cn。

农业部农产品加工重点实验室开放课题项目(2015007)；中央高校基本科研业务费专项基金项目(GK20102001)。

TS201.1

:A

:1002-0306(2017)16-0005-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.002