响应面法优化超声波提取鸡蛋枣原花青素工艺

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(湖南农业大学园艺园林学院,湖南长沙 410128)

响应面法优化超声波提取鸡蛋枣原花青素工艺

刘琼,王仁才*,吴小燕,石浩

(湖南农业大学园艺园林学院,湖南长沙 410128)

本文采用单因素实验和响应面分析法对鸡蛋枣中原花青素进行提取工艺优化。在单因素实验的基础上,根据中心组合(BOX-Behnken)实验设计,采用四因素三水平对各个因素进行研究与分析,结果表明:鸡蛋枣中原花青素的最佳提取工艺为超声时间16 min、超声功率为618 W、超声温度为65 ℃、料液比为1∶21,在此工艺下的鸡蛋枣原花青素得率1.82%。证实超声波提取鸡蛋枣中原花青素的工艺是可行的。体外抗氧化实验表明:鸡蛋枣原花青素对DPPH自由基、羟基自由基的清除具有显著效果,同时还原力显著,且不输于VC。

鸡蛋枣,原花青素,得率,超声波,响应面

枣(ZiziphusjujubaMill.)为鼠李科枣属植物,已有 3000多年的栽培历史,是中国最古老的果树之一[1]。枣果是集营养与医疗保健于一体的优质滋补品,不仅营养丰富、味道甜美,同时又为补中益气、养血安神、缓和药性的常用中药[2]。鸡蛋枣,是指形如鸡蛋大的红枣。其适应性强,结果早,丰产、稳产,果实大,果肉金黄,品质优良而深受消费者喜爱[3]。近年来,随着经济社会的快速发展、人民生活水平显著提高和人们的消费观的变化,药食同源的枣果实越来越受到人们的青睐,其功能成分及医疗保健作用已成为研究热点[4]。

原花青素提取常见的方法溶剂提取法、超声辅助提取法、微波辅助提取法、超临界CO2提取法及酶辅助提取法等。由于超声波提取具有无污染、高效率、低耗能等优点,近年来该方法逐渐在沙枣、葡萄籽、莲房等果实原花青素提取研究并应用[5-7]。徐亚维等[8]山东小枣为原料,研究了乙醇浸提法和正交实验提取原花青素的最佳提取工艺,山东小枣中原花青素的含量为2.06%;张娜等[9]研究骏枣在常压和蒸制方式下活性成分含量的变化情况,研究表明干枣在常压和高压蒸制下,原花青素含量均呈升高趋势而鲜枣则相反,为红枣提供一种科学的食用方法,也为生产加工枣产品提供科学依据;游凤等[10]探讨枣皮颜色变化与生物活性成分含量的关系,并通过清除DPPH自由基能力初步评价各阶段枣皮抗氧化能力的大小,研究表明冬枣原花青素含量约为4.297～30.186 mg/g,其中青红枣皮的含量最高且DPPH自由基清除能力最好,为合理开发和利用红枣资源提供参考和借鉴,而对于祁东鸡蛋枣原花青素提取工艺及其抗氧化活性的研究尚未见报道。

本文首次以湖南祁东鸡蛋枣为试材,采用响应面法探讨其超声波提取工艺,并将提取后的原花青素通过大孔吸附树脂纯化后,探究其体外抗氧化活性,为鸡蛋枣的开发和综合利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

鸡蛋枣 湖南省衡阳市祁东县采集的地方枣品种(成熟期:八月中旬,采摘时间:2016.8.16);原花青素标准品、1,1-二苯基-2-苦肼基 上海源叶生物科技公司;无水乙醇、甲醇、正丁醇、37%浓盐酸、双氧水、硫酸亚铁、水杨酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁 均为国产分析纯。

ZW1105051705紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司;SB-3200D超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司;AUW220D电子天平 日本shimadzu公司;DR-1001旋转蒸发仪 郑州长城科工贸有限公司;TG16台式高速离心机 长沙英泰仪器有限责任公司;DK-98-IIA电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司;DHG-9246A电热恒温干燥箱 上海精宏实验设备有限公司;粉碎机 FW-100(中兴)高速万能粉碎机。

1.2实验方法

1.2.1 鸡蛋枣粉的制备 鸡蛋枣鲜枣切成块状,经70 ℃烘干至恒重,粉碎过40目筛,备用。

1.2.2 鸡蛋枣花青素的超声提取单因素实验设计

1.2.2.1 超声时间对鸡蛋枣原花青素得率的影响 精确称取0.2 g枣粉,选择60%的乙醇溶剂,在料液比1∶20、温度60 ℃、提取功率700 W的条件下,分别在10、15、20、25、30 min的不同提取时间下超声提取,以原花青素得率为指标,考察提取时间对鸡蛋枣原花青素提取得率的影响。

1.2.2.2 超声功率对鸡蛋枣原花青素得率的影响 精确称取0.2 g枣粉,选取60%的乙醇溶剂,料液比1∶20,温度60 ℃,提取时间15 min,分别在500、600、700、800、900 W的不同提取功率下超声提取,以原花青素得率为指标,考察超声功率对鸡蛋枣原花青素提取得率的影响。

1.2.2.3 提取温度对鸡蛋枣原花青素得率的影响 精确称取0.2 g枣粉,选择60%的乙醇溶剂,料液比1∶20,提取功率700 W,分别在50、60、70、80、90 ℃的不同提取温度下超声提取,以原花青素得率为指标,考察提取温度对鸡蛋枣原花青素提取得率的影响。

1.2.2.4 料液比对鸡蛋枣原花青素得率的影响 精确称取0.2 g枣粉,选择60%的乙醇溶剂,温度60 ℃,提取功率700 W,分别在1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30不同料液比下超声提取,以原花青素得率为指标,考察料液比对鸡蛋枣原花青素提取得率的影响。

1.2.2.5 乙醇浓度对鸡蛋枣原花青素得率的影响 精确称取0.2 g枣粉,选择料液比1∶20,温度60 ℃,提取功率700 W,分别以40%、50%、60%、70%、80%的乙醇为提取液超声提取,以原花青素得率为指标,考察乙醇浓度对鸡蛋枣原花青素提取得率的影响。

1.2.2.6 提取次数对鸡蛋枣原花青素得率的影响 精确称取0.2 g枣粉,选择料液比1∶20,温度60 ℃,60%乙醇,提取功率700 W的条件,分别提取1、2、3、4、5次,以原花青素得率为指标,考察提取次数对鸡蛋枣原花青素提取得率的影响。

1.2.3 响应面法优化超声提取工艺 在单因素实验的基础上分别选择超声时间(h)、超声功率(W)、超声温度(℃)、料液比4个因素的3个水平,以鸡蛋枣原花青素得率(Y)为考察指标,进行Box-Behnken实验设计,优化超声波提取鸡蛋枣原花青素得率的工艺条件,实验因素及水平编码如表1。

表1 Box-Behnken响应曲面设计实验因素水平和编码Table 1 Response surface experimental design of Box-Behnken of factor levels and code

1.2.4 原花青素的测定

1.2.4.1 原花青素标准曲线的绘制 采用铁盐催化比色法[11]。称10 mg原花青素标准品加入至10 mL容量瓶,用甲醇定容得1 mg/mL原花青素标准品溶液,分别量取1 mg/mL的原花青素标准溶液0.1、0.25、0.5、1、1.5、2 mL转入10 mL容量瓶中,各容量瓶加甲醇补至10 mL得10、25、50、100、150、200 μg/mL原花青素标准液。分别取1 mL加入9 mL的反应液(正丁醇∶盐酸∶硫酸铁铵=83∶6∶1)迅速振荡摇匀,放入100 ℃水浴锅,反应40 min后,迅速冷却静止20 min,以1 mL甲醇加9 mL反应液作为空白,在吸光度A550 nm处测定溶液吸光值。以原花青素得率C(μg)为横坐标,溶液吸光值A为纵坐标,得到回归方程为y=0.0028x+0.0254,R2=0.999。

1.2.4.2 鸡蛋枣原花青素的测定 取少量已制备好的鸡蛋枣原花青素溶液,将其稀释至合适倍数(单因素实验中稀释一般为2倍,而响应面实验中稀释一般为4倍),取1 mL加9 mL反应液,放入100 ℃水浴锅,反应40 min后,迅速冷却静止20 min,用1 mL甲醇代替提取液重复以上操作,作为参比,在吸光度A550 nm处测定溶液吸光值,并计算原花青素的得率。

式(1)

式中:V为提取液体积,mL;C为待测溶液中鸡蛋枣原花青素的质量浓度,mg/mL;n为提取溶液的稀释倍数;m为鸡蛋枣粉的质量,g。

1.2.5 鸡蛋枣原花青素粗提物的纯化 将1 mg/mL鸡蛋枣原花青素提取物作为上样液,在预处理好的AB-8型大孔吸附树脂上样,径高比1∶10,以1 mL/min的流速上样,上样液pH 5.0,上样量1.5 BV,用蒸馏水洗至流出液呈无色后,用2.5 BV的60%乙醇对大孔树脂吸附柱洗脱,洗脱流速1 mL/min,将60%乙醇洗脱液收集,减压浓缩至无醇味后,冷冻干燥为粉末备用,经铁盐催化法测得鸡蛋枣原花青素纯度为73.07%。

1.2.6 原花青素的抗氧化能力评价

1.2.6.1 鸡蛋枣原花青素DPPH自由基清除能力测定 参照吴小燕等[12]方法,取不同浓度鸡蛋枣原花青素和0.2 mmol·L-1DPPH自由基溶液各2 mL,加入同一试管中,混匀 30 min后在517 nm处测吸光度,测定值为Ai;同时测定Ao值:2 mL DPPH自由基溶液与2 mL蒸馏水混合;以及测定Aj值:2 mL样品溶液与2 mL蒸馏水混合。每个样品重复处理3次,求其平均值。以VC溶液作对照,并计算DPPH清除率。

1.2.6.2 鸡蛋枣原花青素羟基自由基清除能力的测定 采用Fetion反应,测定羟基自由基清除能力[13],依次加入2 mL 6 mmol·L-1的 FeSO4溶液,2 mL不同浓度鸡蛋枣原花青素,6 mmol·L-1的双氧水2 mL,摇匀,静置 10 min,再加入2 mL 6 mmol·L-1水杨酸,摇匀,静置 30 min 后于510 nm处测吸光值Ai;用水代替水杨酸时测Aj;用水代替抗氧化剂测得空白对照Ao。每个样品重复处理3次,求其平均值。并以VC溶液作对照。清除率按下式计算:

1.2.6.3 鸡蛋枣原花青素还原力测定 参照朱丽蓉等[14]方法,取2.5 mL不同浓度鸡蛋枣原花青素(空白用2.5 mL蒸馏水代替),加入2.5 mL PBS缓冲液(0.2 mol·L-1,pH=6.6)及1.0%的K3Fe(CN)6溶液2.5 mL,摇匀,50 ℃水浴20 min后用冷水迅速冷却,加入10%的三氯乙酸2.5 mL,充分反应,取上述反应液5 mL,加入5 mL蒸馏水和1 mL 0.1%的 FeCl3溶液,混匀,10 min后以水为空白在700 nm处测定吸光度。吸光度值越大,代表其还原能力越强。每个样品重复处理3次,求其平均值。并以VC溶液作对照。

1.3数据处理

采用 Design-Expert v8.0.6.1软件对数据进行处理与回归分析。

2 结果与分析

2.1单因素实验

2.1.1 超声时间对鸡蛋枣原花青素得率的影响 由图1可知,随着超声时间的增长,鸡蛋枣原花青素的提取得率先增加后下降,有可能是由于超声时间过长从而导致原花青素的结构被破坏,原花青素的得率降低[15]。故选取超声时间为20 min。

图1 超声时间对鸡蛋枣原花青素提取效果的影响Fig.1 The effect of ultrasonic time on the extraction of proanthocyanidins from egg jujube

2.1.2 超声功率对鸡蛋枣原花青素得率的影响 由图2可知,随着超声功率的提高,鸡蛋枣原花青素得率先增加后减少,推测其原因超声波功率过大,其产生的热效应、空化效应和机械作用越剧烈,破碎细胞作用越强,导致原花青素发生降解,得率下降[16]。因此,适宜的超声波功率为600 W。

图2 超声功率对鸡蛋枣原花青素提取效果的影响Fig.2 The effect of ultrasonic power on the extraction of proanthocyanidins from egg jujube

2.1.3 提取温度对鸡蛋枣原花青素得率的影响 由图3知,随超声温度的升高,原花青素的得率先增后降,其原因应该是温度过高会加速分子运动速度加快,扩散、渗透、溶解速度加快,原花青素的提取量会增多;但同时过高的温度导致原花青素的氧化,结构被破坏[17]。故最适宜的超声温度为60 ℃。

图3 超声温度对鸡蛋枣原花青素提取效果的影响Fig.3 The effect of ultrasonic temperature on the extraction of proanthocyanidins from egg jujube

2.1.4 料液比对鸡蛋枣原花青素得率的影响 由图4可知,随料液比的增大,得率也升高,但料液比1∶20后,升幅比较平稳。这是因为提取溶剂体积增大时,样品与提取液的接触面积增大,有利于原花青素提取。但当料液比增大到一定程度后,原花青素已经充分溶出,过高的溶剂会造成溶剂的浪费[18]。故最适宜的料液比为1∶20。

图4 料液比对鸡蛋枣原花青素提取效果的影响Fig.4 The effect of the ratio of material to liquid on the extraction of proanthocyanidins from eggs

2.1.5 乙醇浓度对鸡蛋枣原花青素得率的影响 由图5可知,随乙醇体积的增大,原花青素的提取得率逐渐升高,当乙醇浓度大于60%时,原花青素得率开始下降。根据相似相溶的原理,当原花青素极性与乙醇体积分数相当时,原花青素溶出量最大,而当乙醇体积分数过大时,脂溶性杂质大量溶出,与原花青素竞争与乙醇结合,原花青素提取得率降低[19]。故选择乙醇浓度为60%。

图5 乙醇浓度对鸡蛋枣原花青素提取效果的影响Fig.5 The effect of ethanol concentration on the extraction of proanthocyanidins from egg jujube

2.1.6 提取次数对鸡蛋枣原花青素得率的影响 由图6可知,提取次数增多,原花青素得率也增多,但在两次后,原花青素得率升幅很少。因此从生产效率和节约能源的角度来说,提取2次即可。

图6 提取次数对鸡蛋枣原花青素提取效果的影响Fig.6 The effect of extraction times on the extraction of proanthocyanidins from egg jujube

在图1～图6中,图5中乙醇浓度60%时,其原花青素得率最大,比乙醇浓度50%和70%原花青素得率幅度升幅并不大,同时图6中提取次数在两次以后,升幅也不大,考虑到溶剂消耗和生产效益等方面的因素,故在响应面实验设计中舍弃这两个因素。

2.2响应面分析实验设计及结果

2.2.1 回归模型的建立 在单因素实验的基础上,依据Box-Behnken中心组合实验设计进行了29组实验,其中5组中心点重复实验,实验结果见表2。对表2数据进行拟合,得到模型:

Y=1.7835-0.041572A+0.0271429B+0.0163095C+0.0790724D-0.016071AB-0.030357AC+0.0538542AD-0.029286BC+0.0053571BD+0.0178571CD-0.031785A2-0.074143B2-0.041108C2-0.116606D2

表2 超声波提取鸡蛋枣原花青素响应面分析实验设计与结果Table 2 Experimental design and results of ultrasonic extraction of proanthocyanidins from egg jujube

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance table

注:**表示极显著(p<0.01);*表示显著(p<0.05)。

2.2.2 回归方程及方差分析 通过对实验所得数据的方差分析,结果如表3所示,可知p模<0.0001,表示模型极显著,有很好的统计学意义;模型p失拟项=0.2386>0.05,说明回归方程拟合度高,其他外来因素对实验的影响小;其中模型决定系数R2值为0.9580,说明该模型能够解释95.8%响应值的变化,证实该实验模型对超声波提取鸡蛋枣原花青素工艺优化是可行的;回归方程的一次项A、B、D 均极显著(p<0.01),其中对实验结果影响顺序为D(料液比)>A(超声时间)>B(超声功率)>C(超声温度)。交互项 AC、BC 显著,AD极显著,这表明超声时间和超声温度、超声功率和超声温度、超声时间和料液比对原花青素提取得率均具有明显交互作用。平方项B2、C2、D2极显著(p<0.01),A2显著(p<0.05)。

2.2.3 响应面交互作用分析 根据回归模型,将任两水平固定在零水平,可以得到另外两因素交互作用的响应面图及对应等高线图,反映了各因素交互对提取得率的影响。本研究中各因素交互作用见图7～图12。

由图7～图12可知,超声时间与料液比、超声功率与超声温度、超声时间和超声温度之间的交互作用显著,表现为图8～图10的等高线为椭圆形。对比各图可知,料液比对鸡蛋枣原花青素的提取得率影响最大,表现为图(9、11、12)的曲面较陡。超声温度鸡蛋枣原花青素得率影响不明显,表现为曲线相对平缓,可能是原花青素超声波处理下溶出速度都较大,故提取温度的变化对鸡蛋枣原花青素得率相对其他三个因素要小。

图7 超声时间和超声功率交互作用的响应面图Fig.7 Response surface and contour map of interaction between ultrasonic time and ultrasonic power

图8 超声时间和超声温度交互作用的响应面图Fig.8 Response surface and contour map of interaction between ultrasonic time and ultrasonic temperature

图9 超声时间和料液比交互作用的响应面图Fig.9 Response surface and contour map of interaction between ultrasonic time and material liquid ratio

图10 超声功率和超声温度交互作用的响应面图Fig.10 Response surface and contour map of interaction between ultrasonic power and ultrasonic temperature

图11 超声功率和料液比交互作用的响应面图Fig.11 Response surface and contour map of interaction between ultrasonic power and material liquid ratio

图12 超声温度和料液比交互作用的响应面图Fig.12 Response surface and contour map of interaction between ultrasonic temperature and material liquid ratio

2.2.4 验证实验 由Design-Expert 8.0.6软件计算得到鸡蛋枣原花青素提取的最佳工艺条件为:超声时间16.29 min、超声功率为618.15 W、超声温度为64.53 ℃、料液比为1∶21.04。在此工艺下的鸡蛋枣原花青素提取率理论可达1.81%。根据实验情况对以上工艺参数进行修正,超声时间、超声功率、超声温度、料液比分别为16 min、618 W、65 ℃、1∶21,在此工艺条件下,实际测得鸡蛋枣原花青素平均得率为1.82%(SD=0.04),与理论预测值相比,其相对误差约为0.01%,而且重复性也很好,说明该模型可以较好地预测枣原花青素与各实验条件之间的关系,具有一定的实用价值。

2.3体外抗氧化活性的测定

2.3.1 DPPH自由基清除能力 由图13可知,在浓度为5～20 μg/mL时,鸡蛋枣原花青素对DPPH自由基的清除能力较VC清除效果好;当两者浓度上升为20 μg/mL后,两者对DPPH清除能力相当。且样品IC50为11.88 μg/mL,VC的IC50为15.88 μg/mL。

图13 鸡蛋枣原花青素对DPPH自由基的清除能力Fig.13 DPPH free radical scavenging capacity of proanthocyanidins from egg jujube

2.3.2 羟基自由基清除能力 由图14可知,鸡蛋枣原花青素与VC对羟基清除能力随质量浓度的增加,清除率都呈上升趋势。在0.2～0.4 mg/mL下,样品清除能力高于相同质量浓度VC的羟基清除能力,0.4 mg/mL后,VC清除率略高于鸡蛋枣原花青素,但样品IC50为0.184 mg/mL,VC的IC50为0.287 mg/mL。

图14 鸡蛋枣原花青素对羟基自由基的清除能力Fig.14 Hydroxyl radical scavenging capacity of proanthocyanidins from egg jujube

2.3.3 还原力的测定 由图15可知,鸡蛋枣原花青素与VC的还原力随质量浓度的增加,还原力都呈上升趋势。在0.04～0.12 mg/mL下,VC还原力高于相同质量浓度鸡蛋枣的还原力,但在0.12 mg/mL后,鸡蛋枣原花青素还原力高于VC还原力。

图15 鸡蛋枣原花青素的还原力Fig.15 Reductiion force of proanthocyanidins from egg jujube

3 结论

本实验以单因素为基础,通过采用Box-Behnken实验设计与响应面分析对超声波提取鸡蛋枣原花青素工艺优化,得到了最佳工艺:超声时间16 min、超声功率为618 W、超声温度为65 ℃、料液比为1∶21,得到鸡蛋枣原花青素提取得率可以达到1.82%。与理论预测值相比,其相对误差约为0.01%,重复性好,说明该模型显著,准确可靠。体外抗氧化实验表明,鸡蛋枣原花青素对DPPH、羟基自由基的清除效果显著,且其还原力极佳,综合而言优于VC。

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Optimizationofultrasonicextractionofproanthocyanidinsfromeggjujubebyresponsesurfacemethodology

LIUQiong,WANGRen-cai*,WUXiao-yan,SHIHao

(College of Horticulture and Landscape,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China)

The extraction of proanthocyanidins from egg jujube was investigated by the single experiments and response surface methodology. On the basis of single factor tests,the method of the central composite experimental design(BOX-Behnken)was used to optimal of ultrasound-assisted extraction of proanthocyanidins form egg jujube by factors and three levels.The results indicated that the extractive conditions were optimized as follows:ultrasonic treatment time of 16 min,ultrasonic power of 618 W,ultrasonic temperature of 65 ℃ and the ratio of material to solvent of 1∶21 (g/mL).Under these conditions,the yield of Procyanidins from egg jujube was 1.82%. Antioxidant activities in egg jujube of the proanthocyanidins indicates that proanthocyandins of egg jujube had strong scavenging effects against DPPH radicals,·OH radicals and reductiion force was significant,it was not lower than that of VC.

egg jujube;proanthocyanidins;the extraction rate;ultrasonic;response surface methodolgy

2017-01-09

刘琼(1994-) ，女，硕士研究生，主要从事功能产品的开发与评价方面的研究，E-mail:18229470782@163.com。

*通讯作者:王仁才(1962-)，男，博士，教授，主要从事药用植物资源工程方面的研究，E-mail:409600160@qq.com。

湖南省自然科学基金委员会与衡阳市政府自然科学联合基金项目(13JJ8010)。

TS255.1

:B

:1002-0306(2017)16-0182-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.034