添加含磷与非磷保水剂对牦牛肉肉糜蛋白质氧化的影响

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(西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都 610041)

添加含磷与非磷保水剂对牦牛肉肉糜蛋白质氧化的影响

张杰,唐善虎*,李思宁,郑渝川,侯晓卫

(西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都 610041)

以添加复合磷酸盐、乳酸钠和柠檬酸三钠作为保水剂制作牦牛肉肉糜,以不添加任何保水剂处理的为对照,通过测定牦牛肉肉糜色度值、表面疏水性、总巯基含量和羰基含量,探讨三种保水剂的抗蛋白氧化性,并比较三者抗蛋白氧化性的差异。实验结果表明:在4 ℃冷藏条件下,7 d贮藏期间,保水剂确实可以延缓肉糜的蛋白氧化,保水剂的种类显著影响牦牛肉肉糜中蛋白质的氧化程度(p<0.05);其中柠檬酸三钠对肉色的改善效果最佳,在第7 d时比其它组的色度值都低为1.26;复合磷酸盐对降低蛋白质表面疏水性的效果最好,在第7 d时表面疏水性为108.70 nmol/mg,仅比第1 d增加了12.73%;乳酸钠对保护蛋白质巯基和减少羰基生成的效果最好,在第7 d时与其它组相比巯基值最大为94.94 nmol/mg,羰基值最小为25.25 nmol/mg。本研究为减少肉制品中蛋白质氧化提供了新途径。

肉糜,复合磷酸盐,保水剂,蛋白质氧化

在过去的十几年人们对脂类的氧化已经做了深入探讨,但却忽略了蛋白氧化在食品体系中的影响。直到最近几年,人们才逐渐认识到蛋白氧化对食品和人体健康造成的危害,就有部分学者对其进行研究。Lund等[1]研究发现高氧的气调包装会导致猪背最长肌的蛋白发生氧化,从而增加滴水损失,降低肉的嫩度;Liu等[2]的研究发现蛋白质被氧化后,其消化率下降,营养价值降低;Ooizumi等[3]发现蛋白质氧化后的产物易与其他物质作用,改变蛋白原有的性能如凝胶性等。为了降低蛋白氧化程度,有学者通过添加抗氧化剂来延缓,例如秦春君[4]的研究发现三种植物酚类(迷迭香酚类物质、苹果酚类物质、葡萄籽酚类物质)具有突出的抗氧化活性,这种性质与螯合肌红蛋白中铁离子,抑制高铁肌红蛋白的生成有关。彭新颖等[5]将乳清分离蛋白(WPI)的水解产物用于生肉糜的加工中,发现WPI水解物可以有效的抑制食物的氧化。除了以上抗氧化剂外,现已发现部分保水剂也具有一定的抗氧化性。例如有研究表明磷酸盐有一定的抗氧化性[6],具体表现在可以延缓蛋白质中巯基的氧化变化、防止肉制品的变色(肌红蛋白的氧化)等[7],在食品加工中常将多种磷酸盐互配使用以达到既保水又抗氧化的目的;乳酸钠是水分保持剂,但最初却作为肉及肉制品中的抗菌剂[8]使用,最近几年的研究成果证实了乳酸盐类在改善牛肉的色泽方面也有一定的效果[9];柠檬酸三钠又名柠檬酸钠,在食品、饮料工业中用作酸度调节剂、风味剂和稳定剂,后有文献报道可提高肉的离子强度、pH和螯合金属离子[10],因而对蛋白质的氧化也有一定缓解作用。但是有关不同保水剂在肉制品中抗蛋白氧化性能的比较却几乎没有报道,特别是在牦牛肉肉糜的产品加工中尚无报道。

因此,本研究通过测定牦牛肉肉糜在储藏期间色泽、表面疏水性、巯基含量和羰基含量四指标的变化,探讨保水剂对牦牛肉肉糜中蛋白质氧化是否具有缓解作用,并将非磷保水剂(乳酸钠和柠檬酸三钠)与含磷保水剂(复合磷酸盐)作对比,探讨三种保水剂的抗蛋白氧化性,并比较三者抗蛋白氧化性的差异。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

牦牛肉 选取由四川省阿坝红原县国中食品有限责任公司提供自然放牧、健康无病牦牛的腿肌,屠宰后去除多余的脂肪,-20 ℃下贮藏;复合磷酸盐(六偏磷酸钠∶焦磷酸盐∶三聚磷酸钠=1∶2∶1)、乳酸钠、乳酸钙、氯化钙、柠檬酸三钠、氯化钠(NaCl)、盐酸(HCl)、二硝基苯腙(DNPH)、三氯乙酸(TCA)、乙醇、磷酸、乙酸乙酯、盐酸胍、溴酚蓝(BPB)、乙二胺四乙酸(EDTA)、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、三羟甲基氨基甲烷(Tris) 均购于成都科龙化工试剂厂;考马斯亮蓝试剂 天津市天新精细化工开发中心;5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、牛血清白蛋白 美国Sigma。

TDZ5-WS离心机 长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司;Centrifuge 5804R高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司;PL303分析天平 梅特勒-托利多国际股份有限公司;LD510电子秤 沈阳龙腾电子有限公司;UV-1000紫外可见分光光度计 翱艺仪器(上海)有限责任公司;HH-6数显恒温水浴锅 国华电器有限公司;CR-400型色差仪 日本Minolta公司;MP511型实验室pH计 上海三信仪表厂;Joyoung/九阳JYL-D05绞肉机 九阳股份有限公司;FSH-2A可调高速组织匀浆机 江苏金坛市医疗仪器厂;QL-901漩涡混合器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

1.2实验方法

1.2.1 牦牛肉肉糜的制作 将牛肉去除筋膜洗净后,用绞肉机绞碎,随机分成四组每份肉糜的质量为50 g,第一组为空白对照未做任何处理;第二组加入复合磷酸盐0.3%(焦磷酸钠∶三聚磷酸钠∶六偏磷酸钠=2∶1∶1);第三组加入乳酸钠0.2%;第四组加入柠檬酸三钠1.2%,并且各处理组同时加入0.15%氯化钙和0.25%乳酸钙。充分混匀后制成肉饼并用保鲜膜包裹放入盒中,于4 ℃保存,在第1、3、5、7 d测定各指标。

1.2.2 指标的测定方法

1.2.2.1 色度值的测定 使用色差计分别测定第1、3、5、7 d的a*值和b*值,每块肉糜取3个点进行测定,计算色度值Y,然后取平均值[11]。

Y=b*/a*

式中,Y代表色度值,b*为黄色度,a*表示红色度。

1.2.2.2 牦牛肉中肌原纤维蛋白的提取 参考Koutina等人[12]的方法并稍有修改。具体步骤为:取4 ℃冷藏经处理的牦牛肉肉糜3 g,添加于其4倍体积的0.05 mol/L Na2HPO4提取缓冲溶液(0.1 mol/L NaCl、5 mmol/L EDTA,用HCl调pH至7.0)经匀浆至均质液,离心15 min(2000 r/min),弃上清液,重复以上操作两次。将经过三次提取的沉淀与4倍体积0.1 moL/L NaCl漂洗液,匀浆30 s,离心15 min(2000 r/min),弃上清液,加入8倍体积0.1 moL/L NaCl的漂洗液后再匀浆,用4层的纱布过滤去除结蹄组织后,用0.1 mol/L HCl调整溶液的pH为6.0,离心15 min(2000 r/min),弃上清液,将沉淀密封于容器中冷藏,于24 h内测定相关指标的变化。蛋白质浓度的测定参照考马斯亮蓝G-250法,用标准牛血清白蛋白做标准曲线。

1.2.2.3 牦牛肉肉糜肌原纤维蛋白表面疏水性的测定 根据Chelh等[13]使用的方法测定牦牛肉肉糜肌原纤维蛋白的表面疏水性。将肌原纤维蛋白溶解于20 mmol/L,pH6.0的磷酸盐缓冲溶液中,使蛋白质的浓度变为5 mg/mL,取1 mL的蛋白溶液加入200 μL的溴酚蓝(BPB,1 mg/mL)溶液后混匀室温下放置10 min,然后离心15 min(7000 r/min),将上清液稀释10倍后在595 nm下测定吸光度值A。实验空白样为未加样品的磷酸盐缓冲溶液。用溴酚蓝的含量表征蛋白质的表面疏水性,表面疏水性的计算公式如下:

1.2.2.4 牦牛肉肉糜肌原纤维蛋白中巯基含量的测定 按照Koutina等[12]报道的方法并有改动。取1 mL浓度约为4 mg/mL的蛋白溶液加入4 mL含有6 mol/L盐酸胍、1 mmol/L EDTA的50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.3),混合均匀后取4.5 mL样品溶液加入0.5 mL 10 mmol/L 5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)的100 mmol/L Tris-HCl溶液(pH7.6)混合,在25 ℃下静置25 min,对照组用提取缓冲液代替样品,在412 nm处测定其吸光值。巯基含量(nmol/mg蛋白)使用摩尔吸光系数13600 L·mol-1·cm-1。

1.2.2.5 牦牛肉肉糜肌原纤维蛋白中羰基含量的测定 采用DAPH比色法[14],取1 mL 4 mg/L的肌原纤维蛋白溶液放入离心管中,每管中加入1 mL 10 mmoL/L的DNPH溶液,并设置一组空白对照,将反应体系放于黑暗中室温(25 ℃)反应40 min,并且每隔5 min漩涡振荡一次使反应充分。随后加入1 mL 20%的TCA(三氯乙酸溶液),摇匀后离心(12000 r/min,10 min,4 ℃),弃上清液。沉淀用1 mL的乙醇-乙酸乙酯溶液(体积比为1∶1)洗涤3次,避免DNPH的干扰。最后将沉淀溶解于3 mL,6 mol/L的盐酸胍溶液,于37 ℃水浴15 min。将溶液在12000 r/min的条件下离心5 min,取上清液于紫外分光光度计370 nm的条件下测定吸光度值。蛋白质羰基衍生物的含量(nmol/mg 蛋白)用摩尔消光系数为22000 L/(mol·cm)计算。

表1 各组样品在4 ℃储藏期间色度值的变化Table 1 Changes of chromatic value of each sample during storage at 4 ℃

注:表中同一时间不同的小写字母表示添加不同保水剂对肉糜色泽影响的差异显著性(p<0.05)。

表2 各组样品在4 ℃储藏期间蛋白质溴酚蓝结合量的变化Table 2 Changes of bromophenol blue combination of each sample during storage at 4 ℃

注:表中数据为均值±标准差,同列上标字母不同表示差异显著(p<0.05)；表3、表4同。1.3数据处理

数据使用SPSS V19.0统计软件计算出3次重复测量所得的平均值,以平均值±标准差的形式表达,并进行ANOVA分析和Duncan显著性检验,不同显著性数据用不同字母标记。

2 结果与分析

2.1添加不同保水剂对牦牛肉肉糜色泽的影响

肉的颜色是衡量肉品质好坏的一项重要指标,人们可以通过视觉加以鉴别,从而判断肉质。肌红蛋白是肉的呈色物质,它有脱氧肌红蛋白、氧合肌红蛋白和高铁肌红蛋白三种存在形式,三者之间的比例决定了肉色,其中高铁肌红蛋白是不被期望的肉色,含量越高表示褐变越严重[15-16]。

由表1可知,四组样品的肉色色度值随着时间的延长都不同程度地上升即肉色都逐渐偏黄。经过处理的牦牛肉肉糜的色泽好于未处理组。从第1～7 d,未处理组的色度值始终最大,柠檬酸三钠组的色度值始终最小;将各处理组内部相比较发现肉色在前3 d时变化不显著(p>0.05),3 d后颜色均发生了显著的变化(p<0.05);在贮藏的7 d内,复合磷酸盐和乳酸钠对肉色的护色效果无显著性差异(p>0.05)。三种添加剂对肉色有护色作用的原因是:复合磷酸盐的加入可以改变离子浓度,影响金属离子与血红素铁的相互作用,从而使肌红蛋白的稳定性提高[17],故对肉色变黄有延缓作用;乳酸钠因在肉中酶的作用下可以生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,从而使高铁肌红蛋白还原酶的活性变大,抑制褐变反应[18];柠檬酸三钠可以提高pH,较高的pH环境可以增加肌红蛋白的稳定性[19]。综上所述,复合磷酸盐、乳酸钠和柠檬酸三钠都可以抑制肌红蛋白的氧化,减缓高铁肌红蛋白的形成,从而达到提高肉色稳定性的目的,三者中柠檬酸三钠的改善效果最佳,在第7 d时色度值最小为1.26。

2.2添加不同保水剂对肌原纤维蛋白表面疏水性的影响

蛋白质结构保持稳定的一大要素是疏水基团与亲水基团之间的平衡,且疏水相互作用是稳定蛋白质结构最重要的作用力,它会影响蛋白质与其他分子之间的相互作用[20]。疏水基团都埋藏于蛋白质结构的内部,只有蛋白质的高级结构发生变化如裂解、氧化等,这些疏水性残基才会被暴露。吴伟[21]的研究发现氧化能够改变蛋白质的构象,使内部的疏水基团暴露导致蛋白质的表面疏水性增大。Li等[22]的研究也发现蛋白质空间结构的展开会导致蛋白质表面疏水性的增加。因此测定蛋白质的表面疏水性在一定程度上可以反映其表面疏水性氨基酸的相对含量,从而体现蛋白质结构的变化程度,进一步推知蛋白质的氧化程度。

表3 各组样品在4 ℃储藏期间总巯基含量变化Table 3 Changes of total sulfhydryl content of each sample during storage at 4 ℃

表4 各组样品在4 ℃储藏期间总羰基含量变化Table 4 Changes of total carbonyl content of each sample during storage at 4 ℃

肌原纤维蛋白表面疏水性的测定参考了Chelh[13]的测定方法,用溴酚蓝的结合量来表征蛋白质的疏水性;溴酚蓝的结合量越大,则蛋白质的表面疏水性越大。由表2可知随着时间的延长，各组的溴酚蓝结合量都变大,但处理组中溴酚蓝结合量随时间的变化相对于未处理组的变化要小。在贮藏第1、3 d时,未处理组、复合磷酸盐组和乳酸钠组的组内间溴酚蓝结合量变化显著(p<0.05),但柠檬酸三钠组内间溴酚蓝结合量变化不显著(p>0.05);在贮藏第5、7 d时,各处理组内部间差异不显著(p>0.05),可能是由于盐溶性的肌原纤维蛋白在低浓度的盐溶液中疏水基团的暴露程度很低,从而对肌原纤维蛋白表面疏水性影响小[23];或者低浓度的盐进入肌原纤维的内部,使内部的巯基发生交联,而对蛋白质的空间结构影响小,蛋白质结构展开程度低,从而疏水性变化不明显[24]。但是,添加复合磷酸盐的处理组溴酚蓝结合量始终最低,且贮藏第7 d与第1 d的增加量也比其它组小为13.84 μg。综上所述,经复合磷酸盐处理的牦牛肉肉糜对蛋白质疏水性的影响最小,其次为柠檬酸三钠和乳酸钠。

2.3添加不同保水剂对肌原纤维蛋白巯基含量的影响

肉中的蛋白质主要分为肌浆蛋白、肌原纤维蛋白和基质蛋白三大类,其中肌原纤维蛋白中的肌球蛋白含有巯基最多,大约有40多个,位于肌球蛋白的头和尾部。但是蛋白结构的变化会导致巯基的位移[25]。巯基是一种具有高反应活性的基团,部分埋藏于蛋白质的内部,环境的变化往往会使它暴露,发生氧化,形成二硫键或者进一步氧化为磺酸类以及其它产物[26],从而导致蛋白质变性。通常蛋白质氧化程度与巯基含量成反比[27]。但是巯基的减少可能是氧化形成了二硫键,也可能是蛋白质发生了降解[28]

由表3可知，四组样品中总巯基含量都经历了先升高后下降的变化趋势,其中未处理组无论是升高还是下降变动幅度都最大。在第3 d时各组的总巯基含量均上升,可能是由于氧化破坏蛋白质的空间结构使本埋藏在内部的巯基大量的暴露,所以总巯基含量升高,或者是由于内源性酶的作用使蛋白质聚合体展开,逐步分解使巯基不断暴露[29]。而巯基的氧化又是一个快速的过程,所以在第5 d时各组中总巯基含量明显减少(p<0.05)。复合磷酸盐组相比于其它处理组,巯基的含量偏低,在第7 d时巯基的含量最低,含量为77.60 nmol/mg,即复合磷酸盐对巯基的保护能力较差,分析原因可能是其中的三聚磷酸钠发生了水解,使蛋白质结构松散、展开,导致本埋藏在内部的巯基暴露发生氧化,从而使总巯基减少[7];柠檬酸三钠和乳酸钠处理组对巯基的保护好,在第7 d时的含量分别为89.49 nmol/mg和94.94 nmol/mg,分析原因可能是其离子态可以螯合金属离子,从而降低了蛋白质的氧化程度[30]。实验结果表明:复合磷酸盐、乳酸钠和柠檬酸三钠在一定程度上都能够缓解牦牛肉中肌原纤维蛋白巯基含量的减少,但是乳酸钠的效果最好。

2.4添加不同保水剂对肌原纤维蛋白羰基含量的影响

羰基是有机官能团由碳氧原子通过双键连接形成,可由易受自由基攻击的含有NH2或NH的肽键及氨基酸侧链的断裂产生,例如可直接由精氨酸、脯氨酸或者赖氨酸的残基氧化形成或者蛋白质发生α-酰胺反应在N段形成α-酮酯酰衍生物,再被氧化为羰基[31]。羰基是蛋白质氧化损伤的主要标志性物质[32],且相对较容易测定。

由表4可以看出，四组的总羰基含量都呈上升趋势,分析原因可能是牦牛肉肉糜中的肌原纤维蛋白里含有可以促进蛋白质氧化的物质,例如:金属离子、亚铁血红素以及各种氧化酶,因此随着时间的延长,总羰基含量增加。但是氧化的程度因添加的保水剂种类不同而异,其中未处理组的上升趋势最明显,且在第7 d时羰基含量最高为44.48 nmol/mg;其次为复合磷酸盐,从第1 d的6.73 nmol/mg上升到了37.48 nmol/mg,分析原因可能是在较高浓度的盐溶液中,肌肉易失水,从而导致蛋白质更易变性;与其余各组相比,在第7 d时总羰基含量最低的为乳酸钠,即25.25 nmol/mg。以上结果均说明无磷保水剂乳酸钠和柠檬酸三钠在降低羰基含量方面优于含磷保水剂复合磷酸盐,且无磷保水剂中乳酸钠的效果最好。

3 结论

本实验重点研究了添加不同保水剂对肉糜色泽和肌原纤维蛋白氧化程度的影响,通过对比未处理组、添加含磷保水剂组和无磷保水剂组的实验结果,得到以下结论:

3.1 未处理组的各项指标都明显比处理组差(p<0.05),可见三种保水剂复合磷酸盐、乳酸钠、柠檬酸三钠对牦牛肉肉糜肌原纤维蛋白质的氧化都有一定的缓解作用,但是随着贮藏时间的延长,蛋白的氧化程度还是有所上升,可见保水剂对于维持理性状态的效果不理想。

3.2 保水剂的种类影响其作用效果,其中柠檬酸三钠对肉色的改善效果最佳,复合磷酸盐对降低蛋白质表面疏水性的效果最好,乳酸钠对保护蛋白质巯基和减少羰基含量的效果最好。

3.3 无磷保水剂在延缓蛋白质氧化方面优于含磷保水剂。

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Effectsofphosphorusandphosphorus-freeagentonproteinoxidationofyakmeatbatters

ZHANGJie,TANGShan-hu*,LISi-ning,ZHENGYu-chuan,HOUXiao-wei

(College of Life Science and Technology,Southwest University for Nationalities,Chengdu 610041,China)

With no addition of any water-holding agent as the control group,compound phosphate,sodium lactate and trisodium citrate was added to prepare yak meat batters. Color value,surface hydrophobicity,total sulfhydryl content and carbonyl content of yak meat batters were determined,and the capacities for protein oxidation were compared among different treatments. The results showed that during the 7 days of storage at 4 ℃,water retaining agents could defer protein oxidation,and the types of agent significantly affected the extension of oxidation of protein in yak meat batters(p<0.05). Among them,the effect of trisodium citrate on the improvement of flesh color was best,and the color value was 1.26 which was the lowest than other groups at the 7th day. The effect of compound phosphate on surface hydrophobicity was best,and the value was 108.70 nmol/mg which was only increased by 12.73% on the 7th day. The effect of sodium lactate on the protection of total sulfhydryl and the reduction of carbonyl content was best. At the 7th day,compared with other groups the maximum of total sulfhydryl content was 94.94 nmol/mg and the minimum of carbonyl content was 25.25 nmol/mg in sodium lactate group. This study provided a new way to reduce the oxidation of protein in meat products.

batters;compound phosphate;water retaining agents;protein oxidation

2017-01-09

张杰(1994-)，女，硕士研究生，研究方向：食品加工与安全，E-mail：1019460876@qq.com。

*通讯作者:唐善虎(1964-)，男，博士，教授，研究方向：食品科学，E-mail：stang01@126.com。

国家科技支撑计划(2015BAD29B02)；四川省科技支撑计划项目(2016NZ0005)。

TS251.52

:A

:1002-0306(2017)16-0234-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.044