维拉帕米增加伊曲康唑体外抗烟曲霉能力

陈培英 曾秋琼 孔庆涛 张征 张玲莉 曾梅华 桑红

(南京总医院皮肤科 南京大学医学院附属金陵医院，南京 210002)

·论著·

维拉帕米增加伊曲康唑体外抗烟曲霉能力

陈培英 曾秋琼 孔庆涛 张征 张玲莉 曾梅华 桑红

(南京总医院皮肤科 南京大学医学院附属金陵医院，南京 210002)

目的 探讨临床药物维拉帕米对伊曲康唑体外抗烟曲霉能力的影响。方法 在仅含伊曲康唑 (ITZ)和含有ITZ与维拉帕米 (Vera)的平板上观察烟曲霉菌落生长情况；显微镜下观察烟曲霉在仅含ITZ和两药联合的液体培养基中孢子萌发和菌丝生长情况；使用微量液基稀释法和E-test方法测试两个药物联用后的伊曲康唑对烟曲霉最低抑菌浓度。结果 ITZ联用Vera比单用ITZ对烟曲霉菌落生长、菌丝萌发抑制效果更明显，并且显著降低了ITZ对烟曲霉的MIC。结论 维拉帕米增加伊曲康唑对烟曲霉的体外抗菌能力。

烟曲霉；伊曲康唑；维拉帕米；抗菌

随着免疫抑制剂、广谱抗生素和抗癌药的广泛使用，真菌感染现象日渐增多，经常出现在器官移植者、造血干细胞移植者、ICU和外科手术患者身上[1]。其中，曲霉感染在血液科和ICU最常见。有流行病学报道约64%的血液学恶性肿瘤患者发生过霉菌感染，其中90%由曲霉引起[2]。使用免疫抑制剂的患者一旦发生曲霉感染，死亡率高达85%[3]。据统计，1970～2010年，侵袭性曲霉病已经构成发展中国家医院患者发病和死亡的主要原因[4]。目前可供临床使用的抗真菌药物数量有限，唑类药物副作用少，是美国感染疾病协会指南推荐的治疗和预防曲霉感染的一线用药[5]，但侵袭性曲霉病患者经过长时间唑类药物治疗后较易发生耐药现象。临床上已经发现曲霉对唑类药物的敏感性呈下降趋势。国内有研究者在服用了数月伊曲康唑但曲霉病复发的患者身上分离到比治疗前耐受64倍的曲霉菌株[6]。更令人畏惧的是，很多菌株已经进化出多药耐药特征[7]。可想而知，如果患者被曲霉耐药菌感染，势必增加治疗难度，甚至造成感染治疗失败和复发。因此，有效抑制曲霉对药物的耐受性和提高现有抗真菌药物的药效是治疗曲霉感染疾病迫切需要解决的问题。

基于第二信使钙离子的钙信号通路参与几乎所有细胞生理活动，对真菌生长发育和逆境响应非常重要。此信号通路主要通过调控通路成员或者钙离子转运体来改变生物体细胞质中钙离子浓度进而帮助细胞应对各种环境刺激和生理信号。已有研究指出，钙信号通路或其关键成员参与实验室白念珠菌、构巢曲霉、烟曲霉对药物逆境的响应[8-12]。这些研究结果提示阻断钙信号通路可能是克服临床真菌耐药和提高现有抗真菌药物药效的一条潜在途径。维拉帕米属于临床上钙离子拮抗类型药物，被广泛用于治疗心血管疾病。本文研究拟检测维拉帕米对伊曲康唑抗曲霉能力的影响，为药物联用抗菌研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验烟曲霉系南京总医院皮肤科真菌室保存菌株，已经经形态学和分子生物学方法鉴定。维拉帕米 (购自上海信谊药厂有限公司)用无菌双蒸水配置成20 mg/mL浓度母液。伊曲康唑 (购自sigma)用二甲基亚砜 (DMSO)配置成1 mg/mL浓度母液。所有药物母液均保存于-20℃冰箱。

1.2 方法

平板接菌法测试菌株对于药物的敏感性 ①药物平板的配置：丰富培养基YAG配置，每升培养基包含葡萄糖20 g，酵母粉5 g，微量元素1 mL。根据实验需要将适宜体积的药物母液加入到20 mL液态培养基YAG中，混匀之后立即倒入无菌平板凝固。药物平板现配现用，防止药物失效。② 菌悬液的配置：将上述实验菌株接种在适宜培养基平板上37℃培养2 d，然后用0.002% Tween 80将平板上孢子洗下来收集到无菌管子里，用无菌水清洗3遍，孢子悬液血球计数。将计数好的孢子悬液用无菌水稀释得到浓度为107孢子悬液，取出2 μL点接在配置好的药物平板上，放置在37℃培养箱中培养2 d取出观察生长情况。

液体培养法测试药物对菌株生长的影响 根据实验需要将适宜体积的药物母液加入到液体培养基YAG中混匀配置成所需工作浓度的含药培养基，每个药物浓度组都加入等量菌悬液。混匀后转移至小培养皿中培养20 h后取出制片，在显微镜下观察孢子萌发和菌丝生长情况。

药物敏感性测试 参考CLSI-M38-A2指南使用微量液基稀释法。根据实验需要将适宜体积的药物母液加入到液体培养基RPMI 1640中混匀配置成工作浓度 (2倍测试浓度)，孢子悬液用RPMI 1640液体培养基配置成工作浓度 (2倍测试浓度)，采用96孔板，按照药物浓度由高到低顺序在每行孔依次加入待测药物工作液各100 μL，菌悬液100 μL，设立生长对照孔和阴性对照孔，设烟曲霉菌株ATCC MYA-3626为质控菌株。35℃培养48 h取出判读MIC。与生长对照孔相比100%生长受抑制的药物最低浓度判读为MIC。

用E-test方法测试菌株对于药物的敏感性 操作方法按照说明书所叙述进行。使用YAG培养基作为基底，在液态培养基温度适宜情况下添加适当体积维拉帕米药物母液，混匀后倒入平板冷凝成固体，取100 μL (约106个孢子)测试菌的孢子悬液均匀涂布于平板上。略干后用无菌镊子夹取E-test试条小心放置于平板中间，保证MIC刻度朝上，最后将平板置于37℃培养48 h后读取结果。

2 结 果

2.1 维拉帕米联合伊曲康唑增加伊曲康唑抑制烟曲霉生长的能力

维拉帕米是钙离子阻断药物，我们推断它会影响烟曲霉对伊曲康唑药物逆境的响应。为检测这点，我们将烟曲霉临床分离菌株AFS1分别接种到无药、仅含有伊曲康唑、同时含有伊曲康唑和维拉帕米的平板上进行培养。如图所示，随着维拉帕米浓度从100 μg/mL增加到200 μg/mL，两个药物联用后对菌落生长的抑制作用逐渐增强 (见图1A)。为了比较菌株生长受抑制程度，我们测量各组菌落直径。如图1B所示，在单用维拉帕米或者单用伊曲康唑培养基上的菌落直径平均值分别达到3.16 cm和1.43 cm，当维拉帕米联合浓度达到200 μg/mL时培养基上未见烟曲霉生长。为了观察是否在液体培养环境下也存在两者协同抗菌作用，将菌株AFS1接种到液体药物培养基中培养。如图1D所示，伊曲康唑单用对菌丝生长有一定抑制作用，但与维拉帕米联用后，烟曲霉孢子均无萌发。为了进一步观察这种协同抗菌作用是否在其他菌株中存在，我们将标准菌株A1160和AF293接种在药物平板上。如图1C所示，0.1 μg/mL伊曲康唑联合200 μg/mL维拉帕米对标准菌株同样有协同抗菌作用，但是菌株生长受抑制程度和临床菌株AFS1不同，这提示伊曲康唑与维拉帕米联用对不同来源菌株有不同程度的协同抗菌作用。

2.2 联合维拉帕米降低伊曲康唑对药物敏感烟曲霉菌株的最低抑菌浓度

进一步测试伊曲康唑与维拉帕米联用对烟曲霉生长的抑制作用。用棋盘法将烟曲霉药物敏感临床分离菌株AFS1、标准菌株AF293和A1160分别接种在96孔板中含有不同浓度伊曲康唑与200 μg/mL维拉帕米联合的液体培养基中培养48 h读取伊曲康唑最低抑菌浓度。图2显示96孔板底部菌丝生长情况，从中明显看到伊曲康唑单用组从1 μg/mL伊曲康唑浓度开始无菌丝生长，而与200 μg/mL维拉帕米联合后从0.5 μg/mL伊曲康唑浓度开始无菌丝生长，这提示联合维拉帕米能降低伊曲康唑对药物敏感菌株的最低抑菌浓度。

2.3 联合维拉帕米降低伊曲康唑对烟曲霉耐药菌株的最低抑菌浓度

为进一步观察这两种药物对耐药菌株是否同样存在协同抗菌作用，我们用E-test法检测烟曲霉临床分离菌株AFS1 (ITZ敏感菌株)、耐药菌株AFR1 (ITZ耐药菌株)分别在含有及不含有维拉帕米环境下的伊曲康唑最低抑菌浓度值 (MIC)。加入维拉帕米使伊曲康唑对敏感菌株AFS1的MIC值从1 μg/mL降至0.5 μg/mL (见图3左)，对耐药菌株AFR1的MIC值从32 μg/mL降至4 μg/mL (见图3右)，差异显著。这些现象都说明联用维拉帕米能显著降低伊曲康唑MIC。

图1 烟曲霉在不同浓度药物培养基上菌落图 (A，C)及菌落直径 (B)和菌丝生长图 (D)(Vera.维拉帕米，ITZ.伊曲康唑) 图2 烟曲霉菌株在不同浓度伊曲康唑与维拉帕米 (200 μg/mL)联用下的菌丝生长图 图3 伊曲康唑单用和联合维拉帕米对烟曲霉敏感菌株 (AFS1)和耐药菌株 (AFR1)的MIC值

Fig.1 The colonies (A，C) and colony diameters (B) and mycelial growth (D) ofAspergillusfumigatusin different drug media (Vera.verapamil,ITZ.itraconazole) Fig.2 Mycelial growth ofAspergillusfumigatusstrains in the different concentration of itraconazole with or without verapamil (200 μg/mL) Fig.3 MICs of itraconazole with or without verapamil against ITZ-sensitive (AFS1) or ITZ-resistant (AFR1) strains

3 讨 论

基于钙离子的钙信号通路的重要性从高等动物到真核生物真菌一直被强调，它是调节生命活动的重要环节，特别是在真菌响应逆境方面。已有研究提出白念株菌和曲霉中钙信号通路基因的缺失菌株对药物环境敏感[12-14]。唑类药物伊曲康唑、伏立康唑是侵袭性曲霉病治疗的首选药物。尽管曲霉物种总体对唑类药物敏感，但获得性耐药特征导致药物抗菌能力呈下降趋势。真菌在进化上和人类比较接近，造成用于治疗真菌感染的药物非常有限。以前研究多关注新药开发，而新型抗菌药研发工作又是一个复杂的长期的过程。联合用药是一个潜在的提高当前抗真菌药物效果的重要途径。本文分析了临床上钙离子拮抗剂类型药物维拉帕米对伊曲康唑抗烟曲霉能力的影响。我们的数据显示维拉帕米能体外增加烟曲霉菌株对伊曲康唑的敏感性，将伊曲康唑和维拉帕米联用可以很大程度降低伊曲康唑对烟曲霉敏感株和耐药株的MIC值，这与已有文献报道钙信号通路重要基因参与曲霉唑类药物响应途径的结果是一致的[12]。不同的是，我们侧重于探索和发现临床药物中钙信号阻断药物有潜力成为提高唑类抗真菌药药效的辅助剂，这也为临床曲霉感染治疗提供一个新思路。

虽然我们的数据显示与200 μg/mL浓度维拉帕米联合，伊曲康唑对烟曲霉临床菌株、标准菌株和耐药菌株的抗菌作用得到明显增强，但是这种联合抗菌效应在其他类型的烟曲霉敏感菌株和耐药菌株以及其他曲霉如黄曲霉、黑曲霉、土曲霉等是否也存在这种联合抗菌效应，这点仍然需要后期收集大量不同来源不同类型菌株进行大样本验证。另外，我们的数据提示维拉帕米在100 μg/mL到200 μg/mL浓度与伊曲康唑联合有协同抗菌作用 (见图1A)，按照一个人体重50 kg和血液重量占人体7%～8%进行简单粗略估算，维拉帕米体外100 μg/mL浓度尚在临床给药安全剂量范围内。但是，诸如血药浓度、生物利用度、药物分布等因素都需要综合考虑，后期我们必须在动物曲霉感染模型中验证两个药物在体内联合是否存在抗菌增效作用。以上工作也提示我们可以从更多钙离子拮抗药物中继续筛选具有提高抗真菌药物效果的其他临床钙离子拮抗药物。

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[本文编辑] 施 慧

Verapamil enhances antifungal activity of itraconazole againstAspergillusfumigatusinvitro

CHEN Pei-ying,ZENG Qiu-qiong,KONG Qing-tao,ZHANG Zheng,ZHANG Ling-li,ZENG Mei-hua,SANG Hong

(DepartmentofDermatology,NanjingGeneralHospital,JinlingHospital,SchoolofMedicine,NanjingUniversity,Nanjing210002,China)

Objective To study the effect of verapamil on antifungal activity of itraconazole againstAspergillusfumigatusinvitro.Methods Colony diameters were measured to compare the drug sensitivity when the strains were inoculated on the media with itraconazole alone and in the combination of verapamil.Spore germination were observated by microscope under itraconazole alone and in the combination of verapamil.Testing for susceptibility to itraconazole was carried out by the broth-based microdilution and E-test methods.Results Colony growth and conidia germination and biofilms were inhibited better under the combination of itraconazole and verapamil than that under itraconazole alone.Conclusions Verapamil enhances antifungal activity of itraconazole againstAspergillusfumigatusinvitro.

Aspergillusfumigatus;itraconazole;verapamil;antifungal activity

203-206]

国家自然科学基金 (31500122)

陈培英，女 (汉族)，博士，助理研究员.E-mail:jxcpy@163.com

桑红,E-mail:shzwqzsl@163.com

R 978.5 R 379.6

A

1673-3827(2017)12-0203-04

2016-12-28