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黑曲霉WS003固态发酵制备果胶酶条件的优化

2017-09-18张忠平杨旭

中国调味品 2017年9期
关键词:碳氮比黑曲霉果胶酶

张忠平,杨旭

(1.哈尔滨市食品质量安全检测中心,哈尔滨 150036;2.哈尔滨市食品工业研究所,哈尔滨 150025;3.哈尔滨市食品工业研究所有限公司,哈尔滨 150025)

黑曲霉WS003固态发酵制备果胶酶条件的优化

张忠平1,杨旭2,3*

(1.哈尔滨市食品质量安全检测中心,哈尔滨 150036;2.哈尔滨市食品工业研究所,哈尔滨 150025;3.哈尔滨市食品工业研究所有限公司,哈尔滨 150025)

以豆粕和麸皮为主要培养基、黑曲霉WS003为发酵菌株,利用固态发酵法生产果胶酶。通过单因素试验确定了碳氮比为40∶1、菠萝皮为诱导物、磷酸氢二钾为无机营养盐;采用正交试验对培养条件进行了优化。结果表明:菠萝皮的添加量为0.15 g/10 g干基、发酵pH为6.0、磷酸氢二钾浓度为0.2%时,果胶酶产酶活力最高,达到81.06 U/mL。

黑曲霉;固态发酵;果胶酶

黑曲霉是食品工业中重要的发酵菌种,可产生果胶酶、糖化酶、淀粉酶等多种酶,主要用于柠檬酸发酵、食醋和白酒制曲等方面。果胶质广泛存在于植物中,有“粘合细胞组织”的作用,是植物细胞壁和胞间层的重要组分[1]。果胶酶是指分解果胶质复合酶的总称[2],应用于酿造果酒果醋、饲料、木材防腐、植物病防治和环境保护等方面。尤其是在食品行业中,果胶酶可以降低果汁、果酒以及果醋的粘度,提高出汁率,起着增加澄清度的作用。黑曲霉是国际上公认的安全发酵微生物[3],用其生产果胶酶,发酵周期短、安全可靠、优势明显。固态发酵法应用广泛、历史悠久,尤其是在酶制剂的生产中得到了普遍应用[4]。本试验通过对黑曲霉高产果胶酶诱变菌株WS003固体发酵,采用单因素试验和正交试验确定其最佳产酶条件,旨在为果胶酶的生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌种

黑曲霉(Aspergillusniger)WS003:本实验室提供;麸皮、豆粕:市售。

1.2 斜面培养基(PDA)

马铃薯200 g去皮,切块煮沸30 min,纱布过滤,葡萄糖20 g及琼脂20 g,补水至1000 mL,pH自然。

1.3 基础培养基

麸皮10 g,豆粕0.25 g,装入250 mL三角瓶中,料水比1∶1.5 (W/V)。

1.4固体发酵[5]

无菌水洗下斜面上的孢子,用装有玻璃珠的三角瓶震荡制成孢子悬液。将一定量的孢子悬液接种至固体发酵培养基中,36 ℃培养72 h。

1.5 果胶酶活力的测定方法

采用DNS法(3,5-二硝基水杨酸法)[6],底物为pH 4.0的0.4%果胶溶液。取0.5 mL适当稀释的发酵上清液,加入2 mL底物溶液,于45 ℃水浴30 min,加入DNS试剂混匀,煮沸5 min,立即冷却定容至25 mL,540 nm处测吸光值。活力定义:上述条件下每1 min分解果胶产生1 μmol半乳糖醛酸所需的酶量定义为1个活力单位(U)。

2 结果与分析

2.1 不同诱导物对黑曲霉产果胶酶活力的影响

2.1.1 菠萝皮对果胶酶活力的影响

分别将0.1,0.2,0.3,0.4 g的菠萝皮粉作为诱导物添加到培养基中,接种一定量的黑曲霉悬液,置于36 ℃恒温培养箱中,定期摇动,72 h后浸提,测定果胶酶活力,试验结果见图1。

在发酵过程中,菠萝皮既可以作为碳源又可以作为诱导物。由图1可知,其用量对产酶影响较大,在培养基中添加0.2 g菠萝皮产果胶酶能力最强,达到66.12 U/mL,但随着添加量的增加,菠萝皮中的抑制产果胶酶成分会逐渐增加,造成果胶酶活力的下降。

2.1.2 西瓜皮对果胶酶活力的影响

分别将0.25,0.5,1,1.5,2.5,3 g的西瓜皮粉作为诱导物添加到培养基中,接种一定量的黑曲霉悬液,置于36 ℃恒温培养箱中,定期摇动,72 h后浸提,测定果胶酶活力,试验结果见图2。

由图2可知,在培养基中添加2.5 g的西瓜皮产果胶酶能力最大,达到了60.84 U/mL,但明显不如以菠萝皮为诱导物的果胶酶活力高,故选择菠萝皮作为适宜的诱导物,添加量为0.2 g/10 g干基。

2.2 不同发酵pH值对黑曲霉产果胶酶活力的影响

调整培养基用水的pH值分别为3.5,4.0,4.5,5.0,6.0,接种一定量的黑曲霉悬液,置于36 ℃恒温培养箱中,定期摇动,72 h后浸提、测定果胶酶活力,试验结果见图3。

图3 发酵pH对果胶酶活力的影响

由图3可知,pH在5.0~6.0果胶酶活力较高,在64 U/mL左右,故选择5.0~6.0为最适发酵pH值。

2.3 不同无机盐对黑曲霉产果胶酶活力的影响

2.3.1 磷酸氢二钾对果胶酶活力的影响

磷酸盐非常适合微生物的生产,既可以起到一定的缓冲作用,又可以防止微生物代谢造成的培养基过酸或者过碱。在培养基中按照0.1%,0.2%,0.3%加入磷酸氢二钾,接种一定量的黑曲霉悬液,置于36 ℃恒温培养箱中,定期摇动,72 h后浸提,测定果胶酶活力,试验结果见图4。

图4 磷酸氢二钾对果胶酶活力的影响

由图4可知,磷酸盐在0.2%的浓度时,果胶酶活力最大,为65.87 U/mL,但更高浓度的磷酸盐反而会对产酶有抑制作用,故选择0.2%为最适的磷酸氢二钾浓度。

2.3.2 硫酸镁对果胶酶活力的影响

在培养基中按照0.1%,0.2%,0.3%加入MgSO4溶液,接种一定量的黑曲霉悬液,置于36 ℃恒温培养箱中,定期摇动,72 h后浸提,测定果胶酶活力,试验结果见图5。

图5 硫酸镁对果胶酶活力的影响

由图5可知,硫酸镁的浓度为0.2%时,果胶酶活力最大,为61.79 U/mL。比较磷酸氢二钾和硫酸镁对果胶酶活力的影响,磷酸氢二钾要大一些,故选择磷酸氢二钾作为最适的无机盐。

2.4 不同碳氮比对黑曲霉产果胶酶活力的影响

菌体生长需要合适的碳源和氮源,不同的碳氮比例对果胶酶的发酵生产影响很大。选择麸皮和豆粕为碳源和氮源,按比例20∶1,30∶1,40∶1,50∶1进行培养基配比,接种一定量的黑曲霉悬液,置于36 ℃恒温培养箱中,定期摇动,72 h后浸提,测定果胶酶活力,试验结果见图6。

图6 碳氮比对果胶酶活力的影响

由图6可知,碳氮比为40∶1时,果胶酶活力最高,故选择最适的碳氮比例为40∶1。

2.5 正交试验对果胶酶活力的影响

选择菠萝皮添加量、磷酸氢二钾浓度和发酵pH 3个因素为影响黑曲霉产酶条件的主要因素进行试验,因素水平表见表1,正交试验结果见表2。

表1 因素水平表

表2 正交试验结果

由表2可知,对黑曲霉WS003产果胶酶影响因素从大到小的顺序依次为:菠萝皮添加量、pH和磷酸氢二钾。分析结果表明A2B3C1为最佳组合,即菠萝皮添加量为0.15 g/10 g干基、pH为6.0、磷酸氢二钾浓度为0.2%,在此条件下,果胶酶活力可达81.06 U/mL。

3 结论

利用单因素试验确定了黑曲霉WS003的培养条件:碳氮比为40∶1、菠萝皮为诱导物、磷酸氢二钾为无机营养盐;通过正交试验进一步优化了培养条件。结果表明:菠萝皮的添加量为0.15 g/10 g干基、发酵为pH 6.0、磷酸氢二钾浓度为0.2%时,果胶酶活力最高,达到81.06 U/mL。

[1]蒋红菊,杨加志,宋加妹,等.高产果胶酶菌株选育及发酵产酶条件优化的研究进展[J].中国酿造,2010,224(11):1.

[2]程红,杜国军,刘晓兰,等.黑曲霉HY-M27产果胶酶固态发酵条件的优化[J].中国调味品,2012,37(12):24.

[3]白爱枝,闫祖威,梁运章,等.黑曲霉产纤维素酶液体发酵条件的优化[J].食品科技,2008,32(3):12.

[4]贺莹,高丽芳,焦红英.黑曲霉产糖化酶固态发酵营养条件优化研究[J].中国酿造,2013,32(9):88.

[5]王丽丽,刘晓兰,郑喜群,等.黑曲霉固态发酵产生果胶酶条件的优化[J].食品科技,2008,32(5):14.

[6]杨欣伟,林伟铃,田宝玉,等.果胶酶高产菌株EIM-6的筛选鉴定及其液体发酵产酶条件优化[J].福建师范大学学报,2009,25(2):69.

Optimization ofAspergillusnigerWS003 Producing Pectinase Conditions by Solid-state Fermentation Method

ZHANG Zhong-ping1, YANG Xu2,3*

(1.Harbin Testing Center for Food Quality and Safety,Harbin 150036,China; 2.Harbin Food Industry Institute,Harbin 150025,China;3.Harbin Food Industry Institute Co.,Ltd.,Harbin 150025,China)

Use soybean meal and wheat bran as main culture medium andAspergillusnigerWS003 as the fermentation strain,adopt solid-state fermentation method to produce pectinase.The single factor experiments are used to improve the fermentation conditions:the ratio of carbon and nitrogen is 40∶1, use pineapple peel as inducer and K2HPO4as inorganic salt.The orthogonal experiments are adopted to optimize the culture conditions.The results show that the optimal conditions of culture medium are as follows: additive amount of pineapple peel is 0.15 g/10 g dry basis,fermentation pH is 6.0, the concentration of K2HPO4is 0.2%.Under these conditions, the enzyme activity of pectinase is the highest,which can reach 81.06 U/mL.

Aspergillusniger;solid-state fermentation;pectinase

2017-03-10 *通讯作者

杨旭(1970-),男,山东莱州人,高级工程师,研究方向:食品工程。

TS264.2

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.09.013

1000-9973(2017)09-0058-03

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